कई उम्मीदवार बायोमार्कर के उच्च throughput सत्यापन अनुक्रमिक एलिसा द्वारा किया जा सकता है क्रम में करने के लिए कम से कम स्थिर / गल चक्र और कीमती प्लाज्मा नमूनों के उपयोग के लिए. यहाँ, हम प्रदर्शन कैसे क्रमिक रूप से प्रदर्शन करने के लिए छह अलग मान्य प्लाज्मा बायोमार्कर के लिए ELISAs<sup> 1-3</sup> भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GVHD)<sup> 4</sup> एक ही प्लाज्मा नमूना पर.
निष्पक्ष खोज प्रोटिओमिक्स रणनीतियों उपन्यास biomarkers की बड़ी संख्या है कि एक नैदानिक सेटिंग में निदान और शकुन परीक्षण में सुधार और उपचारात्मक उपायों गाइड मदद मिल सकती है की पहचान करने की क्षमता है. जब उम्मीदवार प्रोटीन की बड़ी संख्या की पहचान कर रहे हैं, यह मुश्किल हो करने के लिए एक समय और कुशल फैशन में रोगी प्लाज्मा नमूनों कि परिमित मात्रा की घटना संचालित है, और स्थिर हैं तीव्र की शुरुआत में इस तरह के रूप में, से उम्मीदवार biomarkers मान्य हो सकता है भ्रष्टाचार बनाम मेजबान (GVHD) रोग, allogeneic hematopoietic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT) के एक संभावित जीवन धमकी जटिलता.
एक अनुक्रमिक फैशन में 5 आईएल 2Rα, TNFR1 6, 7 HGF आईएल-8, 8, 2 elafin, और REG3α 3 (भी PAP1 के रूप में जाना जाता है) को कम से कम करने के लिए: यहाँ हम छह मान्य GVHD प्रोटीन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ELISAs प्रदर्शन करने की प्रक्रिया का वर्णन फ्रीज पिघलना चक्रप्लाज्मा समय और प्लाज्मा के उपयोग thawed. इस प्रक्रिया के लिए हम अनुक्रमिक क्रम में ELISAs प्रदर्शन के रूप में मन्दन नमूना कारक द्वारा निर्धारित रूप में हमारी प्रयोगशाला में मामूली समायोजन के साथ निर्माता एलिसा किट और प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए इष्टतम अनुक्रमिक एलिसा प्रदर्शन की सुविधा स्थापित. जिसके परिणामस्वरूप प्लाज्मा biomarker सांद्रता तो संकलित किया जा सकता है और एक मरीज पलटन के भीतर महत्वपूर्ण निष्कर्ष के लिए विश्लेषण किया. जबकि इन biomarkers अनुसंधान प्रयोजनों के लिए ही कर रहे हैं, चिकित्सीय देखभाल में उनके शामिल वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में जांच की जा रही है.
इस तकनीक के लिए एक ही नमूना पर कई प्रोटीन / ब्याज की साइटोकिन्स ELISAs करने के लिए लागू किया जा सकता है (ओं) के नमूनों प्रदान करने की जरूरत है अन्य अभिकर्मकों के साथ मिलाया जा नहीं. यदि एलिसा किट पूर्व लेपित प्लेटें, 96-अच्छी तरह से आधा अच्छी तरह प्लेटें या 384 अच्छी तरह प्लेटें के साथ नहीं आते हैं आगे नमूने / अभिकर्मकों के उपयोग को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
तीव्र भ्रष्टाचार बनाम मेजबान (GVHD) रोग, allogeneic hematopoietic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण (HSCT) के बाद मृत्यु गैर पलटा (एनआरएम) का एक प्रमुख कारण है, तीन अंग प्रणालियों में शिथिलता से मापा जाता है: त्वचा, यकृत, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (GI) 4 पथ. तीव्र GVHD प्रत्यारोपण के बाद दो और आठ के बीच सप्ताह आम तौर पर होता है लेकिन बाद में हो सकता है, और अक्सर चिकित्सकीय कंडीशनिंग regimen विषाक्तता, संक्रमण या दवा के साइड इफेक्ट के रूप में अन्य के बाद HSCT जटिलताओं से अप्रभेद्य है. प्रोटिओमिक रणनीतियों और उच्च throughput मान्यता अनुक्रमिक एलिसा का उपयोग कर के उपयोग के माध्यम से, हम 6 प्रोटीन सांद्रता जिसका GVHD के नैदानिक अभिव्यक्तियाँ की शुरुआत में ऊंचा कर रहे हैं की पहचान की है. आईएल 2Rα, TNFR1, HGF और IL-8, जब एक 4-biomarker पैनल में संयुक्त नैदानिक लक्षणों की शुरुआत में GVHD का निदान कर सकते हैं और के बाद HSCT अस्तित्व GVHD 1 गंभीरता की स्वतंत्र रूप से भविष्यवाणी कर सकते हैं. Elafin, एस के GVHD के लिए एक biomarker, GVHD दाने और दाने के बीच दवा eruptions के रूप में अन्य कारणों से भेदभाव और प्रत्यारोपण 2 अस्तित्व की भविष्यवाणी कर सकते हैं कर सकते हैं. हमने हाल ही में कम जठरांत्र पथ के GVHD के एक biomarker के रूप REG3α की पहचान की है, लक्ष्य अंग सबसे एनआरएम के साथ जुड़े है. प्लाज्मा REG3α एकाग्रता मज़बूती के बाद HSCT दस्त के लिए कारण के रूप में GvHD की पहचान कर सकते हैं और नैदानिक आंतों बायोप्सी पर GVHD के histologic गंभीरता सहसंबंधी. सैनिक GVHD शुरुआत में REG3α सांद्रता भी GVHD चिकित्सा और NRM 3 के लिए जवाबदेही की भविष्यवाणी कर सकते हैं. चिकित्सीय देखभाल में इन मान्य GVHD बायोमार्कर के समावेश वर्तमान में नैदानिक परीक्षणों में जांच की जा रही है.
इन प्रयोगों छोटे प्लाज्मा GVHD शुरुआत का समय है कि अपूरणीय हैं और सीमित मात्रा के 2000 और 2010 के बीच HSCT प्राप्त रोगियों से एकत्र aliquots पर प्रदर्शन किया गया. इन नमूनों का कीमती प्रकृति के कारण, हम एक मुलाकात विकसित किया हैएक कुशल, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अतिरिक्त फ्रीज पिघलना चक्र, पिघलना समय और प्लाज्मा के उपयोग को समाप्त करने के तरीके में कई प्लाज्मा प्रोटीन सांद्रता को मापने के ख़्वांचा. इस तकनीक के लिए एक ही नमूना पर कई प्रोटीन / ब्याज की साइटोकिन्स ELISAs करने के लिए लागू किया जा सकता है (ओं) के नमूनों प्रदान करने की जरूरत है अन्य अभिकर्मकों के साथ मिलाया जा नहीं. यदि एलिसा किट पूर्व लेपित प्लेटें, 96-अच्छी तरह से आधा अच्छी तरह प्लेटें या 384 अच्छी तरह प्लेटें के साथ नहीं आते हैं आगे नमूने / अभिकर्मकों के उपयोग को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पांडुलिपि GVHD biomarkers को मापने के तकनीकी पहलुओं पर केंद्रित है.
अनुक्रमिक एलिसा विधि यहाँ प्रस्तुत एकाधिक प्लाज्मा प्रोटीन की प्लाज्मा के छोटे मात्रा में जो प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है और / या 9,10 चूहों से प्राप्त दुर्लभ रोगों या प्लाज्मा नमूनों के साथ मानव विषयों से नमूने के रूप में अपूरणीय पर माप के लिए अनुमति देता है. अनुक्रमिक ELISAs प्लाज्मा कमजोर पड़ने कारक बढ़ाने के क्रम में आम तौर पर प्रदर्शन कर रहे हैं, के साथ की आवश्यकता होती है ELISAs प्लाज्मा पतला ≥ 1:10 आम तौर पर की आवश्यकता होगी, reclaimed, हालांकि यह किया जा सकता है अगर वांछित नहीं है. अनुक्रमिक एलिसा प्रदर्शन करने की क्षमता एलिसा किट / प्रोटोकॉल जिसमें प्लाज्मा अन्य अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है या जिसके लिए अलग कमजोर पड़ने buffers प्लाज्मा के लिए आवश्यक हैं द्वारा सीमित है, यह एक नमूना फिर से उपयोग के कारण चिंता है कि एक असंगत ablility precludes बफर / अभिकर्मक एक विशेष परीक्षण के प्रदर्शन के साथ हस्तक्षेप करेगा. सावधान योजना के साथ, 10 या अधिक ELISAs ही प्लाज्मा नमूना पर किया जा सकता है.
ent "> व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं प्लाज्मा dilutions समायोजित क्रम में व्याख्या के परिणाम के आधार पर परीक्षण विषयों से नमूनों में ब्याज की प्रोटीन की उम्मीद प्लाज्मा सांद्रता प्रयोगशाला उपकरणों में अंतर की जरूरत हो सकता है की जरूरत में परिणाम ऊष्मायन और वर्णमिति विकास का अनुकूलन बार बार, washes की संख्या और / या धो लो सोख के क्रम में किसी भी एलिसा अनुकूलन.उच्च throughput क्षमता और सटीकता को बढ़ाने के लिए और एक लागत प्रभावी ढंग से विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, एक रोबोट तरल से निपटने 384 अच्छी तरह से प्लेटों पर विश्लेषण और stacking यूनिट के साथ एक स्वचालित प्लेट वॉशर सक्षम मंच के उपयोग की सिफारिश कर रहे हैं. इस उपकरण सटीकता और विश्लेषण की परिशुद्धता एकाधिक उपयोगकर्ताओं द्वारा प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए कर सकते हैं, और विश्लेषण के स्थिरता प्रदान करने के लिए अंतर और अंतर परख भिन्नता को कम करने में मदद.
1) के अधिकांश: हम दो कारणों के लिए उपलब्ध मल्टीप्लेक्स प्लेटफार्मों पर इस्तेमाल अनुक्रमिक एलिसाउपन्यास प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी जोड़े आसानी से मोती या अन्य सामग्री पर संयुग्मित के रूप में के रूप में अच्छी तरह से समय लेने और महंगी नहीं हो सकता है, 2) व्यक्तिगत एलिसा assays मल्टीप्लेक्स माइक्रोएरे या मोती, 11 पार जेट की अनुपस्थिति के लिए माध्यमिक की तुलना में अधिक सटीक हैं. यदि एक विश्वसनीय विधि मल्टिप्लेक्स, मनका आधारित प्रोटीन प्रदर्शन करने के लिए स्थापित किया गया है, यह अनुक्रमिक एलिसा प्रक्रिया की जगह करने में सक्षम हो सकता है, लेकिन हो सकता है माला और / एंटीबॉडी संयुग्म की क्षमता या हो वांछित प्रोटीन की संख्या से सीमित किया जा सकता है विश्लेषण किया.
The authors have nothing to disclose.
NIH RC1 HL-101,102 अनुदान, P01 CA039542, T32 HL007622, Hartwell फाउंडेशन, और डोरिस ड्यूक चैरिटटेबल फाउंडेशन द्वारा समर्थित है. डॉ. Paczesny एरिक Hartwell निधि और एमी Strelzer Manasevit अनुसंधान कार्यक्रम के एक अन्वेषक है.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |