Høy gjennomstrømning validering av flere kandidater biomarkører kan utføres ved sekvensiell ELISA for å minimere fryse / tine sykluser og bruk av edle plasmaprøver. Her viser vi hvordan du sekvensielt utføre ELISAs for seks ulike validerte plasma biomarkører<sup> 1-3</sup> Av graft-versus-host sykdom (GVHD)<sup> 4</sup> På samme plasmaprøve.
Objektive funn proteomikk strategier har potensial til å identifisere et stort antall nye biomarkører som kan forbedre diagnostisk og prognostisk testing i en klinisk setting, og kan hjelpe guide terapeutiske intervensjoner. Når store mengder kandidat proteiner er identifisert, kan det være vanskelig å validere kandidat biomarkører i en rettidig og effektiv måte fra plasmaprøver som er hendelsesstyrt, av endelig volum og uerstattelig, for eksempel ved utbruddet av akutt transplantat-mot- vert-sykdom (GVHD), en potensielt livstruende komplikasjon av allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HSCT).
Her beskriver vi prosessen med å utføre kommersielt tilgjengelige ELISA for seks validerte GvHD proteiner: 5 IL-2Rα, TNFR1 6, 7 HGF, IL-8 8, 2 elafin og REG3α 3 (også kjent som PAP1) i en sekvensiell måte for å minimere fryse-tine sykluser, Tint plasma tid og plasma bruk. For denne prosedyren utfører vi ELISAs i kronologisk rekkefølge som bestemmes av prøven fortynningsfaktoren som ble etablert i vårt laboratorium ved hjelp produsenten ELISA kits og protokoller med mindre justeringer for å lette optimal sekvensiell ELISA ytelse. De resulterende plasma biomarkør konsentrasjoner kan deretter bli utarbeidet og analysert for betydelige funn innenfor en pasient kohort. Mens disse biomarkører er for tiden til forskningsformål bare er deres innlemmelse i klinisk arbeid for tiden under etterforskning i kliniske studier.
Denne teknikken kan brukes til å utføre ELISA for flere proteiner / cytokiner av interesse på samme prøve (r) gitt eksempler ikke må blandes med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med forbelagte plater, 96-brønners halv-brønners plater eller 384-brønners plater kan brukes til ytterligere å redusere bruk av prøver / reagenser.
Akutt transplantat-mot-vert-sykdom (GVHD), en ledende årsak til ikke-tilbakefall dødelighet (NRM) etter allogen hematopoietisk stamcelletransplantasjon (HSCT), er målt ved dysfunksjon i tre organsystemer: huden, leveren og gastrointestinale (GI) skrift 4. Akutt GVHD oppstår vanligvis mellom to og åtte uker etter transplantasjon, men kan oppstå senere, og er ofte klinisk skilles fra andre post-HSCT komplikasjoner som tilvenningskur giftighet, infeksjon eller medisiner bivirkninger. Gjennom bruk av proteomikk strategier og high-throughput godkjenning ved sekvensiell ELISA, har vi identifisert seks proteiner som konsentrasjonene er forhøyet ved utbruddet av kliniske manifestasjoner av GVHD. IL-2Rα, TNFR1, HGF og IL-8, kombinert i en 4-biomarkør panel kan diagnostisere GVHD ved utbruddet av kliniske symptomer og kan forutsi post-HSCT overlevelse uavhengig av GVHD alvorlighetsgrad 1. Elafin, en biomarkør for GVHD av ski, kan diskriminere mellom GVHD utslett og utslett av andre årsaker som for eksempel narkotika utbrudd og kan forutsi transplantasjon overlevelse 2. Vi har nylig identifisert REG3α som en biomarkør for GVHD av nedre gastrointestinaltraktus, målorganet mest tilknyttet NRM. Plasma REG3α konsentrasjon kan sikkert identifisere GVHD som årsak for post-HSCT diaré og relateres til histologisk alvorlighetsgrad av GVHD på diagnostiske intestinal biopsi. REG3α konsentrasjoner på GI GVHD utbruddet kan også forutsi respons til GVHD terapi og NRM 3. Inkorporering av disse validerte GvHD biomarkører i klinisk arbeid blir nå undersøkt i kliniske studier.
Disse forsøk ble utført på liten plasma alikvoter tatt av pasienter som får HSCT mellom 2000 og 2010 på den tiden av GVHD utbruddet som er uerstattelige og begrenset mengde. Grunnet dyrebare natur av disse prøvene, har vi utviklet en Method måle flere plasmaproteiner konsentrasjoner på en effektiv, reproduserbar måte å fjerne overflødig fryse-tine sykluser, tine tid og plasma bruk. Denne teknikken kan brukes til å utføre ELISA for flere proteiner / cytokiner av interesse på samme prøve (r) gitt eksempler ikke må blandes med andre reagenser. Hvis ELISA kits ikke kommer med forbelagte plater, 96-brønners halv-brønners plater eller 384-brønners plater kan brukes til ytterligere å redusere bruk av prøver / reagenser. Dette manuskriptet fokuserer på de teknologiske aspektene ved måling GVHD biomarkører.
Den sekvensielle ELISA metoden presentert her tillater måling av flere plasmaproteiner på små volumer av plasma som kan være vanskelig å oppnå og / eller uerstattelige eksempel prøver fra humane individer med sjeldne sykdommer eller plasmaprøver oppnådd fra mus 9,10. De sekvensielle ELISAs er vanligvis utføres i rekkefølgen av økende plasma fortynningsfaktor med ELISA krever plasma fortynnet ≥ 1:10 vanligvis ikke ønsker å bli gjenvunnet, selv om dette kan gjøres hvis det er ønskelig. Evnen til å utføre sekvensiell ELISA er begrenset av ELISA kits / protokoller hvor plasma er blandet med andre reagenser eller som annen fortynning buffere kreves for plasma, dette utelukker ablility å gjenbruke en prøve på grunn av bekymring for at en inkompatibel buffer / reagens vil forstyrre med utføringen av en bestemt test. Med nøye planlegging, kan 10 eller flere ELISAs utføres på samme plasmaprøve.
ENT "> Individuelle laboratorier må kanskje justere plasma fortynninger for å ha interpretable resultater basert på forventet plasmakonsentrasjoner av proteinet av interesse i prøvene fra forsøkspersonene. Forskjeller i laboratorieutstyr kan resultere i behovet for å optimalisere inkubering og kolorimetriske utvikling ganger, antall vask og / eller vask suge ganger for å optimalisere en gitt ELISA.Å øke høy gjennomstrømningskapasitet og nøyaktighet og til å utføre analyser på en kostnadseffektiv måte, er bruk av en robot væskehåndtering plattform stand analyse på 384 brønner plater og en automatisert plate vaskemaskinen med stabling enhet anbefales. Dette utstyret kan øke nøyaktighet og presisjon av analyser utført av flere brukere, og bidra til å gi konsistens analyse for å redusere inter-og intra-assay variasjon.
Vi brukte sekvensiell ELISA over tilgjengelige multiplex plattformer for to grunner: 1) De fleste avantistoff parene for nye proteiner kan ikke lett være konjugert på perler eller annet materiale, så vel som tidkrevende og dyrt, 2) individuelle ELISA analysene er mer presis enn multiplex microarray eller perler, sekundært til et fravær av kryssreaktivitet 11. Hvis en pålitelig metode er etablert for å utføre multipleksede, bead-baserte mikromatriser, kan det være i stand til å erstatte den sekvensielle ELISA prosessen, men kan være begrenset av evnen til å konjugere antistoffene til perler og / eller ved antallet av proteiner ønskes analysert.
The authors have nothing to disclose.
Støttet av NIH tilskudd RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, Hartwell Foundation, og Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny er en etterforsker av Eric Hartwell fondet og Amy Strelzer Manasevit Research Program.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |