Validação com rendimento elevado de candidatos a biomarcadores múltiplos pode ser realizada por meio de ELISA sequencial de modo a minimizar de congelamento / descongelamento e utilização de amostras de plasma preciosos. Aqui, nós demonstrar como executar sequencialmente ELISAs para seis diferentes biomarcadores de plasma validados<sup> 1-3</sup> De enxerto-versus-hospedeiro (GVHD)<sup> 4</sup> Na amostra de plasma mesmo.
Proteômica estratégias de descoberta imparciais têm o potencial para identificar um grande número de novos biomarcadores que podem melhorar os testes de diagnóstico e prognóstico em um ambiente clínico e pode ajudar a guiar intervenções terapêuticas. Quando um grande número de proteínas candidatas são identificadas, pode ser difícil validar biomarcadores candidatos em tempo hábil e eficiente a partir de amostras de plasma de pacientes que são orientados a eventos, de volume finito e insubstituível, como no início da aguda do enxerto-versus- doença do hospedeiro (GVHD), uma complicação potencialmente fatal de alogênico de células tronco hematopoiéticas (TCTH).
Aqui descrevemos o processo de execução de testes ELISA comercialmente disponíveis para seis proteínas validados GVHD: IL-2Ra 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, e REG3α 3 (também conhecido como PAP1) de uma forma sequencial para minimizar ciclos de congelamento e descongelamento, Tempo de plasma descongelado e uso de plasma. Para esse procedimento foi realizar os testes ELISA em ordem sequencial, conforme determinado pelo fator de diluição da amostra, conforme estabelecido em nosso laboratório utilizando kits ELISA fabricante e protocolos com pequenos ajustes para facilitar ótimo desempenho ELISA sequencial. As concentrações plasmáticas de biomarcadores resultantes podem então ser compilados e analisados para resultados significativos dentro de um grupo de pacientes. Embora esses biomarcadores são atualmente apenas para pesquisa, sua incorporação cuidados clínicos está sendo investigado em ensaios clínicos.
Esta técnica pode ser aplicada para realizar os testes ELISA para múltiplas proteínas / citocinas de interesse na mesma amostra (s) desde que as amostras não necessitam de ser misturadas com outros reagentes. Se kits ELISA não vêm com pré-revestidas, as placas de 96 cavidades de meia assim chapas ou placas de 384 poços pode ser usado para reduzir ainda mais o uso de amostras / reagentes.
Doença do enxerto-versus-hospedeiro aguda (GVHD), uma das principais causas de mortalidade não-recaída (NRM) após alogénico transplante de células hematopoiéticas (HSCT), mede-se por uma disfunção em três sistemas de órgãos: a pele, fígado e gastrointestinal (GI) trato 4. GVHD aguda geralmente ocorre entre duas e oito semanas após o transplante, mas podem ocorrer mais tarde, e muitas vezes é clinicamente indistinguível da de outros pós-TCTH complicações, tais como a toxicidade regime de condicionamento, infecção ou efeitos colaterais. Através da utilização de estratégias de proteômica e de alto rendimento de validação usando ELISA sequencial, foram identificados seis proteínas cujas concentrações são elevadas no início das manifestações clínicas da DECH. IL-2Ra, TNFR1, HGF e IL-8, quando combinados em um painel 4 biomarcador pode diagnosticar-GVHD no início dos sintomas clínicos e pode prever a sobrevivência pós-transplante, independentemente da gravidade da GVHD 1. Elafin, um biomarcador para GVHD do skem, pode discriminar entre erupção GVHD e erupção de outras causas, como erupções de drogas e pode prever a sobrevida do transplante 2. Nós recentemente identificado REG3α como um biomarcador de DECH do trato gastrointestinal, o órgão alvo mais associado com NRM. A concentração plasmática de REG3α pode identificar com segurança DECH como a causa para o pós-TCTH diarréia e correlacionar com a gravidade histológica da DECH em diagnóstico biópsias intestinais. As concentrações no GI REG3α início GVHD também pode prever a capacidade de resposta a terapia com GVHD e NRM 3. A incorporação desses biomarcadores validados GVHD em atendimento clínico está sendo investigado em ensaios clínicos.
Estas experiências foram realizadas em pequenas alíquotas de plasma colhidas a partir de pacientes que receberam transplante entre 2000 e 2010 no momento do início GVHD que são insubstituíveis e de quantidade limitada. Devido à natureza precioso destas amostras, temos desenvolvido um metgico da medição das concentrações de proteína de plasma em múltiplos de forma eficiente e reprodutível para eliminar o excesso de ciclos de congelamento e descongelamento, o tempo de descongelamento e utilização de plasma. Esta técnica pode ser aplicada para realizar os testes ELISA para múltiplas proteínas / citocinas de interesse na mesma amostra (s) desde que as amostras não necessitam de ser misturadas com outros reagentes. Se kits ELISA não vêm com pré-revestidas, as placas de 96 cavidades de meia assim chapas ou placas de 384 poços pode ser usado para reduzir ainda mais o uso de amostras / reagentes. Este manuscrito incide sobre os aspectos tecnológicos da medição biomarcadores GVHD.
O método ELISA sequencial aqui apresentada permite a medição de várias proteínas do plasma em pequenos volumes de plasma que podem ser difíceis de obter e / ou insubstituível tais como amostras de indivíduos humanos com doenças raras ou de amostras de plasma obtidas a partir de ratinhos 9,10. Os ELISAs sequenciais são tipicamente realizadas na ordem do factor de diluição de plasma crescente, com testes ELISA requerem plasma diluído ≥ 1:10, normalmente, não necessitam de ser recuperado, embora isso possa ser feito se desejado. A capacidade de realizar ELISA sequencial é limitada por kits ELISA / protocolos em que o plasma é misturada com os restantes reagentes, ou para os quais tampões de diluição diferentes são requeridas para o plasma, o que se opõe à ablility de reutilizar uma amostra devido a preocupações de que um incompatíveis tampão / reagente irá interferir com o desempenho de um teste particular. Com um planeamento cuidado, de 10 ou mais ELISAs pode ser efectuado com a mesma amostra de plasma.
ent "> Laboratórios individuais podem precisar de ajustar diluições de plasma, a fim de obter resultados interpretáveis baseadas em concentrações plasmáticas esperados da proteína de interesse em amostras dos sujeitos de teste. Diferenças no equipamento de laboratório pode resultar na necessidade de optimizar a incubação e desenvolvimento colorimétrico vezes, o número de lavagens e / ou lavar tempos de imersão, de modo a optimizar qualquer dado ELISA.Para aumentar a taxa de transferência de alta capacidade e precisão e para realizar análises de forma rentável, a utilização de uma plataforma de manuseamento robotizado líquido capaz de análise em 384 placas de poços e um lavador de placas automático com a unidade de empilhamento são recomendados. Este equipamento pode aumentar a precisão e precisão das análises realizadas por vários usuários, e ajudar a fornecer consistência de análise para reduzir variação inter e intra-ensaio.
Usamos ELISA sequencial em plataformas multiplex disponíveis por dois motivos: 1) A maior parte dapares de anticorpos para novas proteínas não podem ser facilmente conjugados com pérolas ou outro material, bem como demorada e cara, 2) ensaios de ELISA individuais são mais precisos do que microarray multiplex ou grânulos, secundária a uma ausência de reactividade cruzada 11. Se um método de confiança é estabelecida para executar multiplexados, grânulo com base em microarrays, pode ser capaz de substituir o processo de ELISA sequencial, mas pode ser limitada pela capacidade para conjugar os anticorpos de grânulos e / ou pelo número de proteínas desejadas de ser analisados.
The authors have nothing to disclose.
Suportado pelo NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, a Fundação Hartwell, e Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny é um investigador do Hartwell Eric fundo ea Amy Strelzer Programa de Pesquisa Manasevit.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |