Высокая пропускная проверки нескольких биомаркеров кандидат может быть выполнена последовательная ELISA для того, чтобы свести к минимуму циклов замораживания / оттаивания и использования драгоценных образцов плазмы. Здесь мы покажем, как последовательно выполнять ИФА для шести различных подтверждено биомаркеров плазмы<sup> 1-3</sup> Трансплантат против хозяина (РТПХ)<sup> 4</sup> На том же образце плазмы.
Объективные открытие протеомики стратегии есть потенциал, чтобы идентифицировать большое количество новых биомаркеров, которые могут улучшить результаты диагностики и тестирования в клинических условиях и может помочь руководство терапевтических вмешательств. Когда большое число кандидатов белков определены, это может быть трудным для проверки кандидатов биомаркеров в своевременном и эффективном моды от пациента образцы плазмы, которые событию, конечный объем и незаменимы, например, в начале острой трансплантат-против- хозяина (РТПХ), потенциально опасное для жизни осложнение аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК).
Здесь мы опишем процесс выполнения коммерчески доступных ИФА в течение шести подтверждено GVHD белков: IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8, elafin 2, и REG3α 3 (также известная как PAP1) в последовательном моды свести к минимуму циклов замораживания-оттаивания, Талые время плазмы и плазменные использования. Для этой процедуры мы проводим ИФА в последовательном порядке, как это определено образца коэффициент разбавления, установленный в нашей лаборатории с помощью ELISA производитель наборов и протоколов с незначительными изменениями для облегчения оптимального последовательного исполнения ELISA. В результате концентрация в плазме крови биомаркеров могут быть обобщены и проанализированы значительные результаты в когорте пациентов. Хотя эти биомаркеры в настоящее время только для исследовательских целей, их включение в медицинской помощи в настоящее время изучается в клинических испытаниях.
Этот метод может быть применен для выполнения ИФА для нескольких белков / цитокинов проценты по той же выборке (ы), при условии образцы не должны быть смешаны с другими реагентами. Если ИФА комплекты не поставляются с предварительно покрытых пластинами, 96-а полу-луночные планшеты или 384-луночных планшетов могут быть использованы для дальнейшей минимизации использования образцов / реагентов.
Острый трансплантат против хозяина (РТПХ), одной из ведущих причин, не рецидив смертности (NRM) после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), измеряется в трех дисфункции органов и систем: кожи, печени и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) тракта 4. Острая РТПХ обычно происходит от двух до восьми недель после пересадки, но может произойти позже, и часто клинически неотличимые от других пост-ТГСК осложнений, таких как режим кондиционирования токсичности, инфекции или побочные эффекты лечения. Благодаря использованию протеомных стратегии и высокой пропускной проверку с помощью последовательного ELISA, мы определили 6 белков, концентрация которых повышена в начале клинических проявлений РТПХ. IL-2Rα, TNFR1, HGF и IL-8, когда объединены в 4-биомаркеров панели могут диагностировать РТПХ в начале клинических симптомов и может предсказать, после ТГСК выживания независимо от тяжести GVHD 1. Elafin, биомаркеров для GVHD из SKВ, могут различать GVHD сыпь и высыпания от других причин, таких как наркотики извержений и не может предсказать выживания пересадки 2. Недавно мы определили REG3α в качестве биомаркеров РТПХ нижнего желудочно-кишечного тракта, органов-мишеней всего связаны с природными ресурсами. Плазменные REG3α концентрации может надежно идентифицировать РТПХ в качестве причины для пост-ТГСК диарея и коррелируют с гистологической тяжести GVHD по диагностике кишечной биопсии. REG3α концентрации на начало GI GVHD также может предсказать реакции на трансплантат против хозяина терапии и NRM 3. Включение этих подтверждено GVHD биомаркеров в клинической помощи в настоящее время изучается в клинических испытаниях.
Эти эксперименты проводились на небольшие аликвоты плазмы полученная от пациентов, получающих ГСК между 2000 и 2010 во время наступления GVHD, которые являются незаменимыми и ограниченном количестве. В связи с драгоценной природы этих образцов, мы разработали встретилисьХод измерения концентрации нескольких белков плазмы в эффективную, воспроизводимым способом ликвидации избыточных циклов замораживания-оттаивания, оттепель времени и плазменные использования. Этот метод может быть применен для выполнения ИФА для нескольких белков / цитокинов проценты по той же выборке (ы), при условии образцы не должны быть смешаны с другими реагентами. Если ИФА комплекты не поставляются с предварительно покрытых пластинами, 96-а полу-луночные планшеты или 384-луночных планшетов могут быть использованы для дальнейшей минимизации использования образцов / реагентов. Эта рукопись фокусируется на технологических аспектах измерения GVHD биомаркеров.
Последовательный метод ИФА, представленные здесь позволяет производить измерения нескольких белков плазмы на малых объемах плазмы, которая может быть трудно получить и / или незаменимые, такие как образцы человеческих пациентов с редкими заболеваниями или плазму образцов, полученных от мышей 9,10. Последовательное ИФА, как правило, осуществляется в порядке возрастания фактора разбавления плазмы, с ИФА требует плазме разбавленной ≥ 1:10 правило, не нуждаются в утилизирован, хотя это можно сделать при желании. Способность выполнять последовательные ELISA ограничен ИФА / протоколы, в которых плазма смешивается с другими реагентами или для которых разведение различных буферов, необходимых для плазмы; это исключает ablility повторно использовать образец из-за опасений, что несовместима Буфер / реагента будет вмешиваться в выполнение конкретного теста. При тщательном планировании, 10 или более ИФА может быть выполнена на том же образце плазмы.
ENT "> Индивидуальные лаборатории может потребоваться настроить плазмы разведения, чтобы иметь интерпретируемые результаты, основанные на ожидаемых концентрациях в плазме крови белка в образцах из испытуемых. Различия в лабораторном оборудовании может привести к необходимости оптимизации инкубации и колориметрических развития раза, количество промываний и / или мытья замочить раз для того, чтобы оптимизировать любой ELISA.Для увеличения высокой пропускной способности и точности, и для выполнения анализов в экономически эффективным образом, использование роботов жидкость платформа обработки позволяет проводить анализ на 384-луночные планшеты и автоматизированная машина плита с укладки блока рекомендуется. Это оборудование может повысить достоверность и точность анализа, проведенного несколькими пользователями, и поможет обеспечить согласованность анализа для снижения меж-и внутри-анализ вариаций.
Мы использовали последовательное ELISA более доступные платформы мультиплексирования по двум причинам: 1) большинствоантитела пар для новых белков не может легко быть сопряжены с бисером или других материалов, а также трудоемким и дорогим, 2) отдельных ИФА являются более точными, чем микрочипов мультиплекс или бисером, вторичной по отношению к отсутствие перекрестной реактивности 11. Если надежный метод создан для выполнения мультиплексированных, шарик на основе микрочипов, это может быть в состоянии заменить последовательный процесс ELISA, но может быть ограничена возможность сопряженные антитела к бисера и / или по количеству белков желал быть проанализированы.
The authors have nothing to disclose.
Поддерживается гранты NIH RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, Хартвелл Фонда, и Дорис Дьюк благотворительный фонд. Доктор Paczesny является следователь Эрик Hartwell фонда и Эми Strelzer Manasevit исследовательской программы.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |