Summary
该协议描述了一个可视化的DNA双链断裂以及其定位在有丝分裂过程中DNA损伤激活的信号蛋白的方法。
Abstract
双链断裂（DSBs）是最有害的DNA病变的细胞可能会遇到。如果未修复，DNA双链断裂港口的巨大潜力产生突变和染色体畸变1。为了防止这种创伤催化基因组的不稳定性，这是至关重要的，检测DNA双链断裂的细胞，激活DNA损伤反应（DDR），并修复DNA。解除武装，复员和重返社会工作的刺激时，通过触发细胞周期阻滞，以便维修发生或强制的细胞发生凋亡，以维持基因组的完整性。 DSB修复发生的主要机制通过非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HRR）（评论2例 ）。有许多的蛋白质，其活动必须精确精心策划的解除武装，复员和重返社会正常运行。这里，我们描述了一种方法，2 - 和3 - 维（D）的可视化这些蛋白质之一，53BP1。
p53结合蛋白1（53BP1）定位于地区DNA双链断裂的修饰组蛋白3,4结合，形成病灶在5-15分钟内5。组蛋白修饰和招聘53BP1和其他DDR蛋白DSB网站被认为是染色质的结构重排，以方便周边地区的损失，并有助于DNA修复6。除了 直接参与修复，额外的角色被描述为53BP1在解除武装，复员和重返社会，如调节内-S检验点，G2 / M检验点，并激活下游DDR蛋白7-9。最近，人们发现，53BP1没有形成病灶在有丝分裂过程中DNA损伤，而不是等待细胞进入G1前定位附近的DNA双链断裂6。如53BP1 DDR蛋白质已被发现与有丝分裂的结构（如着丝粒）相关联的进展通过有丝分裂10期间。
在这个协议中，我们描述了使用2 - 和3-D的活细胞成像的可视化53BP1灶形成的DNA损伤剂喜树碱（CPT），以及53BP1在有丝分裂过程中的行为。喜树碱是拓扑异构酶I抑制剂，主要引起DNA双链断裂DNA复制过程中。要做到这一点，我们使用先前描述的53BP1 mCherry荧光融合蛋白结构的53BP1的蛋白质结构域的能够结合DNA双链断裂11。此外，我们使用组蛋白H2B-GFP的荧光融合蛋白的构建，能够监控整个细胞周期，但在特定的染色质的动态，在有丝分裂12。活细胞成像技术在多个方面，是一个很好的工具，以加深我们对DDR在真核细胞中的蛋白质的功能。
Protocol
A.细胞制备
- 正常人体主要的成纤维细胞（GM02270）卡瑞尔细胞储存库，卡姆登，新泽西州，并与hTERT 6永生。细胞生长和扩大在蜂星6-cm培养皿在媒体（4毫升）组成的MEM培养基与20％的胎牛血清（GIBCO），的non-essential/essential氨基酸，维生素，丙酮酸钠，和青霉素/链霉素（HyClone公司）。
- 人胚胎肾293（HEK293）细胞，从美国典型培养物保藏中心获得的，并在蜂星6-cm培养皿中生长和扩大。中，细胞保持在介质（4毫升）中组成的DMEM培养液与10％牛胎儿血清，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。
- 53BP1 mCherry（N-MYC-53BP1 WT pLPC的普罗Addgene质粒19836）（pCLNR H2BG; Addgene质粒17735）和H2B-GFP融合基因的结构也表达嘌呤霉素或G418抗性基因，分别转（fibrobla针）或转染（HEK293）使用SuperFect（Qiagene）进入细胞，并保持在药物选择。荧光定期检查维护。
- 图像采集前24-48小时，将细胞用胰蛋白酶消化成单细胞悬液，并以较低的密度接种到的3.5厘米FluroDish玻璃底板。
B.显微镜设置和图像采集
该协议被开发使用的蔡司细胞观察SD旋转盘共聚焦显微镜配备了一个AxioObserver Z1架，双通道Yokagawa CSU-X1A 5000旋转的磁盘单元，配光QuantEM 512SC EMCCD相机，HXP 120C光纤为基础的照明灯，4激光器（一Lasos 100mW的多行，氩[458，488，514纳米，50 mW的405 nm二极管，40 mW的561 nm二极管，和30 mW的635 nm二极管），AOTF，一个Pecon的的XL multiS1阶段孵化体系，蔡司孵化模块（模块S O 2，CO 2 TempModule模块S，S，供热机组XL小号）和前个月XY torized阶段与一个NanoScanZ的压电Z插入。为了尽量减少的活细胞成像的球面像差，而在水性介质中，一个C-复消色差63x/1.20水/更正物镜和蔡司Immersol W浸没流体（具有折射率n = 1.334）的支持。对于2通道共焦成像中，RQFT 405/488/568/647分色镜和BP525/50（绿色）和BP629/62（红色）排放过滤器被使用。所用的系统软件与AV4 Multi-channel/Z/T，快速成像，生理学，MosaiX，标记和查找，双摄像头，里面4D，自动对焦和3-D反褶积模块：蔡司Axiovision（版本4.8.2.0）。
- 确保运行，CO 2气体的CO 2孵化系统的模块。如果在显微镜防振空气表支持的，打开空气供给（或N 2气体）的空气表。
- 打开显微镜支架的电源开关，旋转式磁盘装置，数码相机，孵化模块，HXP照明灯，电动载物台，氩气激光，和计算机。
- 经过1分钟的热身时间，将点火钥匙的氩离子激光器为“开”。
- 在蔡司激光控制面板中，打开要使用的激光线的开关。
- 拨动开关切换为“待机”，“激光运行”，的Lasos氩离子激光器控制器，调光控制器的最佳水平（ 即正下方的绿色指示灯会变成红色）。
- 启动AxioVision软件。 注 ：是专门针对特定的显微镜和组件，它控制的窗口和下拉菜单，可自定义的用户界面AxioVision。因此，每个系统都有可能是唯一的接口。因此，在随后的步骤中提供软件操作的一般说明，而不是特定的软件窗口，标签和/或下拉菜单的方向。
- 成像前约1小时，在软件中，定位控制的孵化器和上部腔室的加热和镜台板的开启。把温度设置为37℃。打开的CO 2的控制和设置在5％的水平。
- 选择用于成像的物镜。在这项研究中，63x/1.20 NA C-复消色差水/更正物镜使用注 ：对于这样的镜头，需要浸没介质的折射率类似的水（蔡司Immersol W浸没流体）。
- 如果在一个长的时间内将被采样的多个单独的位置，某些应用足够量的液浸介质中，以确保它从一个位置到另一个进行。
- 放置在舞台上的菜带来物镜成与底部接触。
- 在显微镜控制或软件，直接发出的光目镜，选择“适当的广角过滤器的设置荧光信号的利息（这项研究中，”红“过滤器设置53BP1和”绿色荧光蛋白“过滤器设置为H2B ）。/ P>
- 查看通过眼透镜，图像聚焦，细胞中找到一个合适的领域。
- 使用软件或显微镜控制，直接发射的光远离共焦旋转圆盘单元到端口的目镜。
- 在软件中，打开相应的激光（这项研究中，561纳米激光53BP1和H2B的氩离子激光器的488 nm线）。
- 对于每个通道，调整的激光的强度的声光可调谐滤波器（AOTF）控制通过调节到适当的水平。
- 选择适当的的分色镜（RQFT 405/488/568/647）和发射滤波器（BP62分之62953BP1和BP五十○分之五百二十五的的H2B）。打开快门纺丝盘单元。
- 选择“实时”窗口，显示当前的视野。
- 在软件中，打开“相机”控制，选择相机使用（如果是双相机系统），并设定曝光时间约为100毫秒。调整％和EM获得其他埃森。 注：53BP1 mCherry结构显得有些暗淡。我们发现它有利于提高EM增益。
- 在软件中，打开控制的共聚焦转盘单位和调整转盘的速度进入相机的曝光时间，捕捉到一个合适的图像（ 例如 〜100毫秒）。单击“设置”锁定的变化。
- 打开“多维收购”。选择通道“选项卡，加载/选择合适的渠道。在这项研究中，我们将使用红色荧光蛋白（561 nm激光激发和BP 629/62过滤器的排放）和GFP（488 nm激光激发和BP525/50过滤器的发射线）定义的通道。
- 为了确保图像配准中，一个共同的分色镜（RQFT 405/488/568/647）用于两条通道。设置软件的“自动对焦”。 注意 ：工具→设置编辑器调整的MDA设置。确保有足够的激光功率设置（“足够的激光功率”是指设置，让您激发适当的荧光基团，同时最大限度地减少光漂白）。
- 在“MDA”窗口中，选择“Z-Stack的标签。选择“Z-堆栈在当前的焦点位置”。设置范围〜10微米的Z-Stack，然后选择“最佳”的一些步骤，以确保奈奎斯特采样到Z 注意：确切的Z-Stack的大小将取决于你的细胞的高度。相应的调整。
- 23。单击“开始”，产生的Z-Stack的图像进行分析，以确保设置适合你调查（ 例如在这项研究中的，这是非常重要的，整个核）。
- 选择“T”（时间）选项卡。对于喜树碱我们的实验中，我们设置了成像时间点之间的时间间隔为5分钟和1小时的控制（非处理的细胞）视频会议期间的整体。 注意：尽量减少光漂白细胞，实验应该被配置为使得在AOTF激光成像的时间点之间的空白。
- F多点成像几个细胞的菜，在MDA“窗口中，选择”位置“选项卡。确保“应用”设定时间点的每个位置前/后“被选中。 ，选择“Mark_Find”。使用“现场”视图，将周围的菜，并选择合适的视野。
- 多维收购菜单中单击“开始”，开始进行实验，并记录控制视频（未经处理的细胞）。
- 控制视频后，添加适当的处理（在这种情况下，10μM喜树碱）。我们记录了实验（药物处理的细胞）的视频在5-10分钟的时间间隔为2-4小时。 注：要考虑的是速度，一个给定的效果，治疗后出现的一个重要问题。在视频中可以看出，53BP1灶开始〜5分钟后，加入CPT。虽然一个相对容易的过程，手动添加药物的菜和重新校准的显微镜，确实需要时间。设计实验时，必须考虑到这。
- 为了监测米itosis，我们的间隔设为7.5分钟，并记录为4-5小时（特定的设置取决于使用的细胞系和其细胞周期的长度）。可能需要进行调整，在较长的录音，以防止光漂白。
C.图像处理与分析
Volocity软件（珀金埃尔默），该协议的开发利用。获得这些数据（AxioVision）所使用的软件也有能力来处理和分析图像。我们鼓励用户利用该软件提供给他们，并查阅相关文献，对他们的应用程序。
- 打开Volocity软件。创建并命名一个新的库，并导入你的视频文件。
- 要查看的文件，我们通常会发现使用“扩展聚焦方式”设定有极大的帮助。这叠加的Z-Stack片，此协议，使我们能够可视化53BP1灶在不同领域的核。
- 在必要时调整的影片。 VOlocity配备了一系列的工具，以提高采集到的图像质量。很多时间通过确保在显微镜上的设置是合适的，可以被保存在编辑以后。通常情况下，它是有帮助，反卷积您的图像，调整亮度/对比度。实验的基础上，你的特定的编辑需求会有所不同。
- 添加一个相对时间戳和比例尺。
- 要查看单元格中的3-D，切换到“3-D不透明度”设置。这允许在空间的3-D渲染细胞的旋转，从而提供利益的结构的细胞内的多个角度。 注：这是有助益的可视化细胞在不同的平面中，以确定结构感兴趣的旅行。例如，在“扩展聚焦方式”设定，它是很难辨别53BP1不，其实，游离在有丝分裂过程中从DNA。然而，这是显而易见的，在3-D。
- 动画和静止图像可以导出成多种文件类型，根据用户的喜好。 I>
D.代表性的成果
响应对CPT 53BP1灶形成的一个例子的图1中所示。中华映管灶的细胞暴露在5-10分钟范围内，并保持这些病灶在整个持续时间的记录。正如在图2中所示，53BP1解离染色质在有丝分裂的发病，冷凝染色体周围形成薄膜的雾度。末期发生有丝分裂结束，53BP1再次聚集成不同的病灶。虽然HEK293细胞没有接触到CPT，但它们形成丰富的，自发的53BP1所产生的内源性DNA损伤的修复病灶。这一观察结果使我们得出结论，53BP1没有形成病灶早期有丝分裂过程中，在与以前的报告显示，类似的效果后，细胞暴露于电离辐射和radiomimetic的药物5。
从图1“SRC =”/ files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg“/>
图1。喜树碱（10μM）引起DNA双链断裂和向培养基中添加药物后的30分钟内，在骑自行车的成纤维细胞的53BP1灶形成。
图2。，53BP1并不构成灶在HEK293细胞中有丝分裂过程中，直到telophase/G1。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
维持基因组的完整性，细胞的生存是至关重要的。如果保存的基因组会导致过早衰老，癌变，死亡8。有浓厚的兴趣，挑剔的DDR功能，源于其基础和临床研究的重要性。多年来，以帮助在细胞如何检测和修复DNA损伤的研究已开发了许多技术。传统的方法，如免疫细胞化学和西方墨点法领域的支柱，尽管最近的技术进步已经使日益复杂的方法发展。活细胞成像，在该协议中详细说明，使我们能够研究的解除武装，复员和重返社会的特征，忽略了更传统的技术。
使用活细胞成像的核心是建立荧光标记的蛋白质。在这里，我们描述了使用一个mCherry-标签的蛋白质涉及在DDR，53BP1，以及一组蛋白H2B-GFP融合产物。荧光标记蛋白被广泛地使用在分子和细胞生物学，但是，它们并不是没有其局限性。将一种新型的内源性蛋白的结构，创造了明显的改变自然功能的风险。此外，某些结构可以将在不同的细胞系中的不同层次表示，在各种条件下。我们已观察到的荧光强度的发散水平在所有本研究中所用的基因工程细胞。在本协议中所使用53BP1建设缺乏功能最全域，但是，它保留了绑定到DNA损伤位点，这似乎并没有产生不利影响细胞2。
此外，重要的是要考虑基因传递的方法，。在这个协议中，我们采用了两种方法：慢病毒转导和稳定转染。我们的慢病毒感染的细胞中的稳定转导与荧光构造;因此，他们将继续无限期地表达这些蛋白。然而，这种方法是较为劳动密集的相比，转染和取决于通过该种细胞的目标;有些细胞是不适合于高效转染。另一方面，慢病毒能够进入大多数细胞，包括人类。调查人员正在鼓励权衡每一种方法的优点和缺点，当涉及到他们自己的实验。作为一个可能的规避荧光标记的蛋白质中固有的问题的手段，最近报道细胞渗透性的荧光标记探针的使用活细胞实验10。然而，这种技术还没有得到充分的发展。
活细胞成像技术的一个主要优点是学习能力的解除武装，复员和重返社会的时空关系和DSB修复。事实上，：季米特洛娃等。（2008年），能够观察到活细胞荧光标记和揭示小说中形成有关53BP1端粒的结合，以及它是如何影响染色质的动态。此分析将是显着更具挑战性的，虽然不是不可能的，与其他方法。有监督解除武装，复员和重返社会的能力，在空间和时间，使我们能够识别功能和关系，否则，我们可能会忽视。
总之，使用活细胞成像技术使研究人员能够DSB形成和分辨率的实时监控动力学，定量分析，并允许在单个细胞水平。除了 在本研究中所使用的技术，以及其他的应用程序的活细胞成像可以使用，例如FRET和FRAP 3。实时观测细胞的技术将继续得到改进，并用于研究各种细胞过程。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
支持部分由R01NS064593和R21ES016636（KV）。显微镜进行VCU - 神经生物学与解剖学显微镜设备，部分支持，资金从NIH-NINDS中心的核心授予5P30NS047463的。旋转盘共聚焦显微镜购买的与NIH-NCRR的奖（1S10RR027957）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one | ||
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. | ||
| MEM media | GIBCO | ||
| Non-essential amino acids | GIBCO | ||
| Amino acids | GIBCO | ||
| Vitamins | GIBCO | ||
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | ||
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene | ||
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene | ||
| SuperFect | Qiagen | ||
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss | ||
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss | ||
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss | ||
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
