שתי והדמית תא חייה תלת ממדית של חלבוני תגובת ניזק לדנ"א
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה להמחשת DNA חלבון איתות הפסקה כפולת גדיל הופעל בתגובה לניזק לדנ"א, כמו גם הלוקליזציה שלה במהלך מיטוזה.
Abstract
הפסקות כפולות גדיל (DSBs) הן DNA המזיק ביותר נגעי תא יכול להיתקל. אם יצא שלא תוקן, פוטנציאל גדול DSBs נמל לייצר מוטציות וליקויים כרומוזומליים 1. כדי למנוע הטראומה הזאת מcatalyzing חוסר יציבות גנומית, זה קריטי לתאים כדי לזהות DSBs, להפעיל את תגובת הניזק לדנ"א (DDR), ולתקן את ה-DNA. כאשר מגורה, DDR עובד כדי לשמור על שלמות גנטית על ידי מפעילת עצירת מחזור תא כדי לאפשר תיקון להתקיים או לאלץ את התא כדי לעבור אפופטוזיס. המנגנונים הבולטים של תיקון DSB מתרחשים דרך nonhomologous הסוף מצטרף-(NHEJ) וההומולוגי רקומבינציה תיקון (הרר) (שנסקר ב2). יש חלבונים רבים שפעילות חייבת להיות דווקא מתוזמרת לDDR כדי לתפקד כראוי. בזאת, אנו מתארים שיטה ל2 – ויזואליזציה 3-ממדית (ד ') של אחד מהחלבונים האלה, 53BP1.
חלבון p53 מחייב 1 (53BP1) localizes לתחומיםDSBs על ידי הקשירה לההיסטונים שונים 3,4, ויצר מוקדים בתוך 5-15 דקות 5. השינויים והגיוס של חלבוני היסטון 53BP1 ואחרים DDR לאתרי DSB הם האמינו כדי להקל על ההתארגנות המבנית של הכרומטין סביב אזורים של ניזק ולתרום לתיקון דנ"א 6. מעבר להשתתפות ישירה בתיקון, תפקידים נוספים כבר תאר ל53BP1 בDDR, כגון הסדרת מחסום S תוך, מחסום G2 / M, והפעלת DDR חלבונים במורד זרם 7-9. לאחרונה, התגלה כי 53BP1 אינו מהווה מוקדים בתגובה לניזקי DNA הנגרמים במהלך מיטוזה, במקום לחכות לתאים להיכנס G1 לפני localizing לסביבה של 6 DSBs. חלבוני DDR כגון 53BP1 נמצאו לקשר עם מבני mitotic (כגון kinetochores) במהלך ההתקדמות במיטוזה 10.
בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש של 2 ו – 3-D הדמיה חייה תא לדמייןהיווצרות 53BP1 המוקדים בתגובה לדנ"א סוכן camptothecin המזיק (CPT), כמו גם התנהגותו של 53BP1 במהלך מיטוזה. Camptothecin הוא topoisomerase אני מעכב שבעיקר גורם DSBs במהלך שכפול הדנ"א. כדי להשיג זאת, השתמש חלבון היתוך ניאון תואר קודם 53BP1-mCherry לבנות מורכב מחלבון תחום 53BP1 מסוגלת להיקשר 11 DSBs. בנוסף, השתמש חלבון היתוך ניאון היסטון H2B-GFP לבנות מסוגל לפקח דינמיקת הכרומטין לאורך מחזור התא אך בפרט במהלך 12 מיטוזה. הדמית תא חייה בממדים רבים היא כלי מצוין להבנה מעמיקה יותר של התפקוד של חלבונים בתאי DDR האיקריוטים.
Protocol
Discussion
שמירה על שלמות גנטית היא חיונית להישרדות תא. כישלון כדי לשמר את התוצאות הגנום במוקדם, היווצרות הסרטן, הזדקנות או מות 8. יש עניין רב בהבחנה כמה פונקציות DDR, נובעות מחשיבותו למחקר בסיסי וקליני. טכניקות רבות פותחו במשך השנים כדי לסייע במחקר של כמה תאים לזהות ולתקן ני…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך בחלקו על ידי R01NS064593 וR21ES016636 (KV). מיקרוסקופי בוצע בVCU – מחלקה לנוירוביולוגיה מתקן מיקרוסקופי ואנטומיה, נתמך, בין השאר, במימון ה-NIH NINDS מרכז ליבת מענק 5P30NS047463. Confocal מיקרוסקופ הדיסק מסתובב נקנה בפרס ה-NIH NCRR (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
