DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme
Summary
Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.
Abstract
Çift iplikli sonları (DSBs) en zararlı DNA olan bir hücre karşılaşabilirsiniz Lezyon. Onarılamayan bırakılırsa, DSBs liman büyük potansiyel mutasyonlar ve kromozomal anomaliler 1. üretmek. DSBs algılamak için hücreler, DNA hasar cevabı (DDR) etkinleştirmek ve DNA tamir için genomik instabilite katalizleyen bu travma önlemek için çok önemlidir. Uyarıldığında, DDR onarım gerçekleşecek ya da apoptoz geçmesi hücre zorlamak için izin vermek için hücre döngüsü tutuklama tetikleyerek genomik bütünlüğünü korumak için çalışır. DSB onarım baskın mekanizmaları nonhomologous sonu katılmadan (NHEJ) ve homolog rekombinasyon tamiri (HRR) (2 yorum) yoluyla meydana gelir. Olan faaliyetleri kesin DDR düzgün çalışması için düzenledi gereken pek çok protein vardır. Ve bu proteinlerin birinin, 53BP1 3-boyutlu (D) görselleştirme – Burada, bir 2 için yöntem açıklanmaktadır.
P53-bağlayıcı protein 1 (53BP1) alanlarına lokalize5-15 dakika 5 içinde odaklarının oluşturulması, modifiye histon 3,4 bağlanarak DSBs. DSB sitelerine 53BP1 ve diğer DDR proteinlerin histon modifikasyonlar ve alım hasar bölgelerinin çevresinde kromatin yapısal yeniden düzenlenmesini kolaylaştırmak ve DNA tamir 6 katkıda bulunduğuna inanılmaktadır. Tamir doğrudan katılım da ötesinde, ilave rollerin, bir intra-S kapısı, bir G2 / M kontrol noktası, düzenleyici ve aşağı doğru DDR proteinleri 7-9 aktive olduğu gibi, DDR de 53BP1 için tarif edilmiştir. Son zamanlarda, 53BP1 yerine DSBs 6 civarına lokalize önce G1 girmek hücreleri bekliyor, mitoz sırasında indüklenen DNA hasarına yanıt olarak odaklar teşkil etmemektedir keşfedilmiştir. Bu tür 53BP1 gibi DDR proteinleri mitoz ile 10 arasındaki ilerlemesi esnasında mitotik yapılar (kinetochores gibi) ile ilişkilendirmek için tespit edilmiştir.
Bu protokolü biz 2 kullanılmasını tanımlamak – ve 3-D canlı hücre görüntüleme görselleştirmek içinDNA hasarına neden olan ajan kamptotesin (CPT) yanı sıra, mitoz sırasında 53BP1 davranışı yanıt olarak 53BP1 odaklarının oluşumu. Kamptotesin öncelikle DNA replikasyonu sırasında DSBs neden ben inhibitörü bir topoizomeraz olduğunu. Bunu başarmak için, biz daha önce açıklanan 53BP1-mCherry floresan füzyon proteini DSBs 11 bağlamak mümkün bir 53BP1 proteinin etki oluşan inşa kullanılır. Buna ek olarak, bir histon H2B-GFP füzyon proteini floresan mitoz sırasında 12 hücre döngüsü boyunca ama özellikle kromatin dinamik izlemek mümkün yapı kullanılır. Birden fazla boyutta canlı hücre görüntüleme ökaryotik hücrelerde DDR proteinlerin fonksiyonu anlayışımızı derinleştirmek için mükemmel bir araçtır.
Protocol
Discussion
Genomik bütünlüğünün korunması hücrenin yaşaması için önemlidir. Erken yaşlanma, karsinogenez veya ölüm 8 genom sonuçları korumak için başarısızlık. Sezmek yoğun ilgi var nasıl temel ve klinik hem de araştırma için önemini kaynaklanan DDR fonksiyonları. Birçok teknikleri hücreleri algılamak ve DNA hasarı onarmak nasıl çalışmaya yardımcı olmak için yıllar içinde geliştirilmiştir. Teknolojideki son gelişmeler giderek daha sofistike yöntemler gelişmeye izin olsa blo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R01NS064593 ve R21ES016636 (KV) tarafından kısmen desteklenir. Mikroskopi VCU yapıldı – Nörobiyoloji & Anatomi Mikroskopi Tesis Bölümü, NIH-NINDS Merkezi çekirdek hibe 5P30NS047463 fon ile, kısmen desteklenmektedir. Dönen diske konfokal mikroskop bir NIH-NCRR ödülü (1S10RR027957) ile satın alınmıştır.
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
