To-og tre-dimensionelle Live-Cell Imaging af DNA skade responset Proteiner
Summary
Denne protokol beskriver en metode til at visualisere en DNA-dobbeltstrenget brud signalering protein aktiveres som reaktion på DNA-skade såvel som dens lokalisering under mitose.
Abstract
Dobbelt-strengbrud (DSB'er) er den mest skadelige DNA-læsioner en celle kan støde på. Hvis venstre udbedrede, at DSBs havn stort potentiale generere mutationer og kromosomafvigelser 1. For at forhindre dette traume fra at katalysere genomisk ustabilitet, er det afgørende for celler til at opdage DSBs, aktivere DNA skade responset (DDR), og reparere DNA. Når stimuleres, DDR arbejder for at bevare genomisk integritet ved at udløse cellecyklusstandsning at muliggøre reparation finde sted eller tvinge cellen til at undergå apoptose. De dominerende mekanismer i DSB-reparation ske gennem ikke-homolog ende-sammenføjning (NHEJ) og homolog rekombination reparation (HRR) (revideret i 2). Der er mange proteiner, hvis aktiviteter skal præcist orkestreret for DDR til at fungere ordentligt. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til 2 – og 3-dimensionelle (D) visualisering af et af disse proteiner, 53BP1.
Den p53-bindende protein 1 (53BP1) lokaliseres til områder afDSB'er ved binding til modificerede histoner 3,4 og danner foci løbet af 5-15 minutter 5. Histon modifikationer og rekruttering af 53BP1 og andre DDR proteiner til DSB sites menes at lette den strukturelle omlægning af kromatin omkring områder med skader og bidrage til DNA-reparation 6. Ud over direkte deltagelse i reparation, er yderligere roller blevet beskrevet til 53BP1 i DDR, såsom regulering af en intra-S checkpoint, en G2 / M checkpoint, og aktivering af downstream DDR-proteiner 7-9. For nylig blev det opdaget, at 53BP1 ikke danner foci som reaktion på DNA-skade induceret under mitose i stedet venter på celler for at indtaste G1 før lokalisering til i nærheden af DSB'er 6. DDR proteiner, såsom 53BP1 har vist sig at associere med mitotiske strukturer (såsom kinetochores) under progression gennem mitose 10.
I denne protokol beskrives anvendelsen af 2 – og 3-D levende celler til at visualiseredannelsen af 53BP1 foci som svar på DNA-ødelæggende middel camptothecin (CPT), og 53BP1 opførsel under mitose. Camptothecin er en topoisomerase I inhibitor, der primært bevirker DSB'er under DNA-replikation. For at opnå dette, anvendte vi en tidligere beskrevet 53BP1-mCherry fluorescerende fusionsproteinkonstruktion består af en 53BP1 proteindomæne stand til at binde DSB'er 11. Desuden blev der anvendt en histon H2B-GFP-fluorescerende fusionsproteinkonstruktion kunne følge chromatin dynamik gennem cellecyklussen, men især under mitosen 12. Live-cell imaging i flere dimensioner er et fremragende værktøj til at uddybe vores forståelse af funktionen af DDR-proteiner i eukaryote celler.
Protocol
Discussion
Opretholdelse af genomisk integritet er afgørende for celleoverlevelse. Manglende bevare genom resulterer i for tidlig aldring, carcinogenese, eller død 8. Der er en intens interesse for kræsne, hvordan DDR funktioner, der stammer fra dets betydning for både grundforskning og klinisk forskning. Mange teknikker er blevet udviklet gennem årene for at hjælpe til undersøgelse af, hvordan cellerne registrere og reparere DNA-skader. Traditionelle metoder såsom immunocytokemi og western blotting har været g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Delvist understøttet af R01NS064593 og R21ES016636 (KV). Mikroskopi blev udført ved VCU – Neurobiologisk Afdeling & Anatomi Microscopy Facility, støttet til dels med støtte fra NIH-NINDS center kerne tilskud 5P30NS047463. Den spinning disk konfokal mikroskop blev købt med en NIH-NCRR prisen (1S10RR027957).
Materials
| Product | Company |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
| MEM media | GIBCO |
| Non-essential amino acids | GIBCO |
| Amino acids | GIBCO |
| Vitamins | GIBCO |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO |
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
| SuperFect | Qiagen |
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what’s in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
