该协议描述了一个可视化的DNA双链断裂以及其定位在有丝分裂过程中DNA损伤激活的信号蛋白的方法。
双链断裂(DSBs)是最有害的DNA病变的细胞可能会遇到。如果未修复,DNA双链断裂港口的巨大潜力产生突变和染色体畸变1。为了防止这种创伤催化基因组的不稳定性,这是至关重要的,检测DNA双链断裂的细胞,激活DNA损伤反应(DDR),并修复DNA。解除武装,复员和重返社会工作的刺激时,通过触发细胞周期阻滞,以便维修发生或强制的细胞发生凋亡,以维持基因组的完整性。 DSB修复发生的主要机制通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HRR)(评论2例 )。有许多的蛋白质,其活动必须精确精心策划的解除武装,复员和重返社会正常运行。这里,我们描述了一种方法,2 – 和3 – 维(D)的可视化这些蛋白质之一,53BP1。
p53结合蛋白1(53BP1)定位于地区DNA双链断裂的修饰组蛋白3,4结合,形成病灶在5-15分钟内5。组蛋白修饰和招聘53BP1和其他DDR蛋白DSB网站被认为是染色质的结构重排,以方便周边地区的损失,并有助于DNA修复6。除了 直接参与修复,额外的角色被描述为53BP1在解除武装,复员和重返社会,如调节内-S检验点,G2 / M检验点,并激活下游DDR蛋白7-9。最近,人们发现,53BP1没有形成病灶在有丝分裂过程中DNA损伤,而不是等待细胞进入G1前定位附近的DNA双链断裂6。如53BP1 DDR蛋白质已被发现与有丝分裂的结构(如着丝粒)相关联的进展通过有丝分裂10期间。
在这个协议中,我们描述了使用2 – 和3-D的活细胞成像的可视化53BP1灶形成的DNA损伤剂喜树碱(CPT),以及53BP1在有丝分裂过程中的行为。喜树碱是拓扑异构酶I抑制剂,主要引起DNA双链断裂DNA复制过程中。要做到这一点,我们使用先前描述的53BP1 mCherry荧光融合蛋白结构的53BP1的蛋白质结构域的能够结合DNA双链断裂11。此外,我们使用组蛋白H2B-GFP的荧光融合蛋白的构建,能够监控整个细胞周期,但在特定的染色质的动态,在有丝分裂12。活细胞成像技术在多个方面,是一个很好的工具,以加深我们对DDR在真核细胞中的蛋白质的功能。
维持基因组的完整性,细胞的生存是至关重要的。如果保存的基因组会导致过早衰老,癌变,死亡8。有浓厚的兴趣,挑剔的DDR功能,源于其基础和临床研究的重要性。多年来,以帮助在细胞如何检测和修复DNA损伤的研究已开发了许多技术。传统的方法,如免疫细胞化学和西方墨点法领域的支柱,尽管最近的技术进步已经使日益复杂的方法发展。活细胞成像,在该协议中详细说明,使我们?…
The authors have nothing to disclose.
支持部分由R01NS064593和R21ES016636(KV)。显微镜进行VCU – 神经生物学与解剖学显微镜设备,部分支持,资金从NIH-NINDS中心的核心授予5P30NS047463的。旋转盘共聚焦显微镜购买的与NIH-NCRR的奖(1S10RR027957)。
Product | Company |
CellStar culture dishes | Greiner Bio-one |
FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. |
MEM media | GIBCO |
Non-essential amino acids | GIBCO |
Amino acids | GIBCO |
Vitamins | GIBCO |
Sodium Pyruvate | Invitrogen |
Penicillin/Streptomycin | HyClone |
Fetal Bovine Serum | GIBCO |
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene |
pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene |
SuperFect | Qiagen |
Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss |
AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss |
Zeiss Immersol W Oil | Zeiss |
Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |