Summary
Denne protokol beskriver en metode til at visualisere en DNA-dobbeltstrenget brud signalering protein aktiveres som reaktion på DNA-skade såvel som dens lokalisering under mitose.
Abstract
Dobbelt-strengbrud (DSB'er) er den mest skadelige DNA-læsioner en celle kan støde på. Hvis venstre udbedrede, at DSBs havn stort potentiale generere mutationer og kromosomafvigelser 1. For at forhindre dette traume fra at katalysere genomisk ustabilitet, er det afgørende for celler til at opdage DSBs, aktivere DNA skade responset (DDR), og reparere DNA. Når stimuleres, DDR arbejder for at bevare genomisk integritet ved at udløse cellecyklusstandsning at muliggøre reparation finde sted eller tvinge cellen til at undergå apoptose. De dominerende mekanismer i DSB-reparation ske gennem ikke-homolog ende-sammenføjning (NHEJ) og homolog rekombination reparation (HRR) (revideret i 2). Der er mange proteiner, hvis aktiviteter skal præcist orkestreret for DDR til at fungere ordentligt. Heri, beskriver vi en fremgangsmåde til 2 - og 3-dimensionelle (D) visualisering af et af disse proteiner, 53BP1.
Den p53-bindende protein 1 (53BP1) lokaliseres til områder afDSB'er ved binding til modificerede histoner 3,4 og danner foci løbet af 5-15 minutter 5. Histon modifikationer og rekruttering af 53BP1 og andre DDR proteiner til DSB sites menes at lette den strukturelle omlægning af kromatin omkring områder med skader og bidrage til DNA-reparation 6. Ud over direkte deltagelse i reparation, er yderligere roller blevet beskrevet til 53BP1 i DDR, såsom regulering af en intra-S checkpoint, en G2 / M checkpoint, og aktivering af downstream DDR-proteiner 7-9. For nylig blev det opdaget, at 53BP1 ikke danner foci som reaktion på DNA-skade induceret under mitose i stedet venter på celler for at indtaste G1 før lokalisering til i nærheden af DSB'er 6. DDR proteiner, såsom 53BP1 har vist sig at associere med mitotiske strukturer (såsom kinetochores) under progression gennem mitose 10.
I denne protokol beskrives anvendelsen af 2 - og 3-D levende celler til at visualiseredannelsen af 53BP1 foci som svar på DNA-ødelæggende middel camptothecin (CPT), og 53BP1 opførsel under mitose. Camptothecin er en topoisomerase I inhibitor, der primært bevirker DSB'er under DNA-replikation. For at opnå dette, anvendte vi en tidligere beskrevet 53BP1-mCherry fluorescerende fusionsproteinkonstruktion består af en 53BP1 proteindomæne stand til at binde DSB'er 11. Desuden blev der anvendt en histon H2B-GFP-fluorescerende fusionsproteinkonstruktion kunne følge chromatin dynamik gennem cellecyklussen, men især under mitosen 12. Live-cell imaging i flere dimensioner er et fremragende værktøj til at uddybe vores forståelse af funktionen af DDR-proteiner i eukaryote celler.
Protocol
A. Cell Preparation
- Normale humane primære fibroblaster (GM02270) blev opnået fra Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, og immortaliseret med hTERT 6. Celler blev dyrket og ekspanderet i CellStar 6-cm skåle i mediet (4 ml) bestående af MEM suppleret med 20% føtalt bovint serum (GIBCO), non-essential/essential aminosyrer, vitaminer, natriumpyruvat, og penicillin / streptomycin (HyClone ).
- Human embryonisk nyre 293 (HEK293) celler blev opnået fra American Type Culture Collection og dyrket og ekspanderet i CellStar 6-cm skåle. Cellerne blev holdt i medier (4 ml) bestående af DMEM suppleret med 10% kalvefosterserum, ikke-essentielle aminosyrer, L-glutamin og penicillin / streptomycin.
- 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro, Addgene plasmid 19836) og H2B-GFP (pCLNR-H2BG, Addgene plasmid 17735) fusion genkonstruktioner også udtrykker puromycin eller G418-resistens-gener, henholdsvis blev transduceret (fibroblam) eller transficeret (HEK293) under anvendelse af Superfect (Qiagene) i celler og holdt under lægemiddelselektion. Vedligeholdelse af fluorescens blev periodisk kontrolleret.
- 24-48 timer før billedoptagelse blev cellerne trypsinbehandlet til en enkelt-cellesuspension og podet ved lav densitet på 3,5 cm FluroDish glas bundpladerne.
B. Microscope Opsætning og Image Acquisition
Denne protokol blev udviklet ved hjælp af Zeiss Cell Observer SD spinning disk konfokal mikroskop udstyret med en AxioObserver Z1 stativ, en dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 spinding disk enhed, 2 Photometrics QuantEM 512SC EMCCD kameraer, en HXP 120C fiberbaseret illuminator, 4 lasere (en Lasos 100mW multi-line Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diode, 40 mW 561 nm diode, og 30 mW 635 nm diode), AOTF, en Pecon XL multiS1 scene inkubation system, Zeiss inkubation moduler (O 2 Modul S, CO 2 Modul S, TempModule S, Varme Unit XL S) og en Prior motorized XY-scene med en NanoScanZ piezo Z insert. For at minimere sfærisk aberration, mens billeddannelse levende celler understøttes i et vandigt medium, en C-Apochromat 63x/1.20 Vand / Corr objektivlinsen og Zeiss Immersol W immersion fluid (med et refraktionsindeks n = 1,334) blev anvendt. For 2 kanaler konfokal afbildning, en RQFT 405/488/568/647 dichroisk spejl og BP525/50 (grøn) og BP629/62 (rød) emissionsfiltre blev anvendt. Det system, der anvendes software var Zeiss AxioVision (ver. 4.8.2.0) med AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fysiologi, MosaiX, Mark & Find, Dual Camera, Inside 4D, autofokus og 3-D dekonvolution moduler.
- Sørg for, at CO 2-gas kører til CO 2 Modul af inkubationen system. Hvis mikroskopet understøttes af et anti-vibrationsluft tabellen, tænde for lufttilførslen (eller N2-gas) til luftbord.
- Tænd for strømmen til mikroskop stativ, spinning disk enhed, kameraer, inkubationstider moduler, HXP Illuminator, motoriseret scene, Argonlaser, og computer.
- Efter 1 min af opvarmningstid, drej tændingsnøglen til Argon laser til "On".
- På Zeiss laser kontrolpanelet, skal du tænde kontakterne til de laserlinjer der skal anvendes.
- Stil vippekontakten for Lasos Argon laser controller fra "standby" til "laser run" og justere lyset controller til det optimale niveau (dvs. lige under det punkt, hvor den grønne indikator lyser rødt).
- Start op AxioVision software Bemærk:. Brugerfladen for AxioVision kan tilpasses med vinduer og rullemenuer, der er specifikke for den pågældende mikroskop og komponenter som den kontrollerer. Som sådan har hvert system et potentielt unikt interface. Derfor er generelle instrukser for software manipulation tilvejebragt i efterfølgende trin, i stedet retninger for specifikke software-vinduer, faner og / eller pull-down menuer.
- Ca. 1 time før billeddannelse, i softwaren, placere betjeningsgrebene for inkubatoren ogslå opvarmning til det øvre kammer og scenen pladen. Indstil temperaturen til 37 ° C. Tænd CO 2 kontrol og indstille niveauet på 5%.
- Vælg objektivlinsen til billeddannelse. I denne undersøgelse blev en 63x/1.20 NA C-Apochromat Vand / Corr objektivlinse anvendt Bemærk:. Til denne linse, er en nedsænket medium med et brydningsindeks, der svarer til vand (Zeiss Immersol W immersion fluid) nødvendig.
- Hvis flere adskilte positioner, som skal testes over en lang tidsperiode, være sikker at anvende en tilstrækkelig mængde af nedsænkning medium at sikre, at den udføres fra en position til en anden.
- Sæt fadet på scenen og bringe objektivlinsen op i kontakt med bunden.
- Ved hjælp af enten mikroskop kontroller eller software, rette det udsendte lys til okularerne, og vælg den relevante widefield filter sæt til det fluorescerende signal af interesse (for denne undersøgelse, skal du indstille "Rød" filter til 53BP1 og en "GFP" filter sæt til H2B ). </ Li>
- Se gennem de okulære linser, fokusere billedet, og finde en egnet område af celler.
- Brug enten softwareprogrammet eller mikroskop kontrol, lede det udsendte lys væk fra okularerne til havnen med det konfokale rotationsskiveapparatet enhed.
- I softwaren, skal du tænde den rette laser (for denne undersøgelse, den 561 nm laser for 53BP1 og 488 nm linje i Argon laser for H2B).
- For hver kanal, justere intensiteten af laseren ved at justere akustisk-optisk afstemmelige filter (AOTF) kontrol til et passende niveau.
- Vælg den relevante dichroiske spejl (RQFT 405/488/568/647) og emissions-filtre (BP 629/62 for 53BP1 og BP 525/50 for H2B). Åbn lukkeren til den roterende skive enhed.
- Vælg "Live" vinduet for at vise den aktuelle synsfelt.
- I softwaren, skal du åbne "Camera" kontrol, vælge det kamera, der skal bruges (hvis en dobbelt kamera system) og indstille eksponering tid til ca 100 ms. Juster% og EM få så ian. vendige Bemærk: 53BP1-mCherry konstruktion forekommer noget dim. Vi fandt det nyttigt at øge EM forstærkning.
- I softwaren, åbner kontrollen for det konfokale rotationsskiveapparatet enhed og justere rotationsskiveapparatet hastighed ved at indtaste kameraets eksponeringstid der blev indstillet til at tage et passende billede (f.eks ~ 100 ms). Klik på "Set" for at låse i ændringen.
- Åbn "multi-dimensional erhvervelse". Vælg kanal fanen og læsse / udvælge relevante kanaler. For denne undersøgelse, bruger vi kanaler, der er defineret for dsRed (561 nm laser excitation og BP 629/62 filter til emission) og GFP (488 nm laser linje for excitation og BP525/50 filter for emission).
- At sikre billedregistrering blev en fælles dikroisk spejl (RQFT 405/488/568/647) anvendes til begge kanaler. Indstil softwaren til "Autofokus" Bemærk:. Gå til Værktøjer → Indstillinger editor at justere MDA indstillinger. Sørg for, at tilstrækkelig lasereffekt er indstillet ("Passende laser magt" henviser til en indstilling, der giver digat vække den rette fluorofor samtidig minimere fotoblegende).
- I MDA-vinduet, skal du vælge z-stack fane. Vælg "Z-stack på nuværende fokus position". Indstil intervallet for ~ 10 um z-stak og vælge "optimal" for antallet af skridt til at sikre Nyquist sampling gennem Z. Bemærk: Den nøjagtige størrelse af z-stakken vil afhænge af højden af dine celler. Justere i overensstemmelse hermed.
- 23. Klik på "Start" og analysere den resulterende z-stak billedet for at sikre, at indstillingerne er passende for, hvad du er ved at undersøge (f.eks i denne undersøgelse, var det vigtigt at afbilde hele kernen).
- Vælg "T" (tid)-fanebladet. For vores eksperiment med camptothecin satte vi intervallet mellem billeddannende tidspunkter til 5 min og den samlede varighed af sessionen i 1 time for en kontrol (ikke-behandlede celler) video Note:. At minimere fotoblegende af cellerne, eksperimentet bør være konfigureret således, at AOTF emner, hvis laser mellem billeddannende tidspunkter.
- Feller multi-point billeddannelse af flere celler i skålen, i MDA-vinduet, vælge positionen fanen. Sikre "Apply"-indstillingen før / efter tidspunkt 'per position "er markeret. Vælg "Mark_Find". Brug af "Live", Flyt fadet rundt og vælge relevante synsfelter.
- Klik på "Start" i multi-dimensional-køb menuen for at begynde eksperimentet og optage en kontrol video (af ubehandlede celler).
- Efter kontrollen video, tilsættes en passende behandling (i dette tilfælde 10 pM camptothecin). Vi indspillede den eksperimentelle (lægemiddel-behandlede celler) video på 5-10 minutters intervaller i 2-4 timer Bemærk:. Et vigtigt spørgsmål at overveje, er den hastighed, hvormed en given effekt indtræder efter behandling. Som det ses i videoen, 53BP1 foci begynder at fra ~ 5 min efter tilsætning af CPT. Selvom en forholdsvis nem proces, tilføjer lægemiddel til fadet manuelt og re-kalibrere mikroskop tager tid. Der skal tages hensyn til dette, når designe eksperimenter.
- Til overvågning mitosis, vi har indstillet intervallet til 7,5 min og registreres for 4-5 timer (de specifikke indstillinger afhænger af celle, der anvendes linie og længden af sin celle cyklus). Justeringer kan være nødvendigt at foretage for at forhindre fotoblegende under længere optagelser.
C. billedbehandling og analyse
Denne protokol blev udviklet ved hjælp Volocity software (PerkinElmer). Den software, der anvendes til at opnå disse data (AxioVision) har også evnen til at behandle og analysere billeder. Brugere opfordres til at udnytte software til rådighed for dem, og konsultere behørig litteratur om deres ansøgning.
- Åbne Volocity software. Oprette og navngive et nyt bibliotek, og importere dine videofiler.
- Til visning filerne, som regel finder vi det mest hensigtsmæssigt at bruge "Extended Focus"-indstillingen. Dette Indkopierer z-stack skiver og for denne protokol, os at visualisere 53BP1 foci i forskellige områder af kernen tillader.
- Juster videoer efter behov. Volocity er udstyret med en række værktøjer til at forbedre kvaliteten af erhvervede billeder. Ved at sikre indstillingerne på mikroskop var hensigtsmæssige, kan meget tid gemmes i redigeringen senere. Ofte er det nyttigt at deconvolve dine billeder og justere lysstyrke / kontrast. Dine specifikke redigering behov vil variere baseret på eksperimentet.
- Tilføj en relativ tidsstempling og skala bar.
- For at se celler i 3-D, skal du skifte til "3-D opacitet" indstilling. Dette tillader drejning af de 3-D afsmeltet celler i rummet, hvorved der tilvejebringes flere perspektiver af strukturer af interesse i cellerne Bemærk:. Det er nyttigt at visualisere celler i forskellige planer for at bestemme, hvor strukturer af interesse rejser. For eksempel er det i den "udvidede Focus" indstillingen er vanskeligt at se, at 53BP1 giver faktisk, dissocierer fra DNA under mitose. Men det er indlysende i 3-D.
- Film og stillbilleder kan eksporteres til en række filtyper baseret på brugerens præferencer. i>
D. repræsentative resultater
Et eksempel på 53BP1 foci-dannelse i respons på CPT er vist i figur 1.. Celler udsættes for CPT dannelse af foci i 5-10 min, og opretholde disse foci under hele optagelsen. Som vist i figur 2, 53BP1 dissocierer fra chromatin i indtræden af mitose, danne en tynd uklarhed omkring kondenserende kromosomer. Som telophase opstår, og mitose kommer til en ende, 53BP1 endnu engang aggregater i særskilte foci. Mens HEK293-celler ikke blev udsat for CPT, har de alligevel dannet rigelige, spontan 53BP1 reparation foci genereret af endogent DNA-skader. Denne observation tillod os at slutte, at 53BP1 ikke danner foci i den tidlige mitose i overensstemmelse med en tidligere rapport, der viser en lignende virkning efter udsættelse af celler for ioniserende stråling og radiomimetiske lægemidler 5.
Ure 1 "src =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/>
Fig. 1. Camptothecin (10 uM) bevirker DSB'er og 53BP1 foci formation i cykling fibroblaster inden 30 min efter tilsætning af lægemidlet til mediet.
Figur 2. 53BP1 ikke danner foci under mitose indtil telophase/G1 i HEK293-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opretholdelse af genomisk integritet er afgørende for celleoverlevelse. Manglende bevare genom resulterer i for tidlig aldring, carcinogenese, eller død 8. Der er en intens interesse for kræsne, hvordan DDR funktioner, der stammer fra dets betydning for både grundforskning og klinisk forskning. Mange teknikker er blevet udviklet gennem årene for at hjælpe til undersøgelse af, hvordan cellerne registrere og reparere DNA-skader. Traditionelle metoder såsom immunocytokemi og western blotting har været grundpillerne i marken, selv om de seneste teknologiske fremskridt har gjort det muligt stadig mere sofistikerede metoder til at udvikle sig. Levende cell imaging, som nærmere beskrevet i denne protokol, giver os mulighed for at studere karakteristika DDR overset af mere traditionelle teknikker.
Centralt for anvendelsen af levende celler er skabelsen af fluorescensmærkede proteiner. Her beskriver vi anvendelsen af en mCherry-mærket protein involveret i DDR, 53BP1, samt en histon H2B-GFP-fusion produkt. Fluorescensmærkede proteiner anvendes i udstrakt grad i molekylær-og cellebiologi, men de er ikke uden begrænsninger. Fastgørelse af en ny struktur til et endogent protein skaber indlysende risiko for ændring naturlige funktion. Desuden kan visse konstruktioner og vil blive udtrykt på forskellige niveauer i forskellige cellelinier, under forskellige betingelser. Vi har observeret forskellige niveauer af fluorescerende intensitet i alle de genetisk manipulerede celler anvendt i denne undersøgelse. Den 53BP1 konstruere anvendt i denne protokol mangler mest funktionelle domæner, men det bevarer evnen til at binde til steder med DNA-skader, som ikke synes at påvirke cellen 2.
Desuden er det vigtigt at overveje fremgangsmåde til genlevering. I denne protokol, brugte vi to metoder: lentiviral transduktion og stabil transfektion. Vores lentivirus-inficerede celler stabilt transduceret med det fluorescerende konstruktion;derfor vil de fortsætte med at udtrykke disse proteiner på ubestemt tid. Men denne metode er noget mere arbejdskrævende sammenlignet med transfektion og dikteres af hvilken type celler anvendes mest, og nogle celler er ikke egnede til effektiv transfektion. På den anden side er lentivira stand til at indtaste de fleste celler, inklusiv human. Efterforskere opfordres til at afveje fordele og ulemper til hver metode, når det kommer til deres egne eksperimenter. Som en mulig måde at omgå problemerne forbundet med fluorescensmærkede proteiner, blev brugen af celle-permeable fluorescensmærkede prober nylig rapporteret for levende celle eksperimenter 10. Denne teknik er endnu ikke fuldt udviklet.
En primær fordel ved levende celler er evnen til at studere de Spatiotemporal relationer i DDR og DSB reparation. Faktisk Dimitrova et al. (2008) var i stand til at observere fluorescensmærkede levende celler og afsløre roman iformation om 53BP1 binding til telomerer og hvordan det påvirker kromatinet dynamik. Denne analyse vil være betydeligt mere udfordrende, men ikke umuligt, med andre metoder. Have evnen til at overvåge DDR i både tid og rum giver os mulighed for at skelne funktioner og sammenhænge, som vi ellers ville overse.
Sammenfattende muliggør anvendelse af levende celler forskere for at overvåge kinetik DSB dannelse og opløsning i realtid, og tillader kvantitativ analyse ved en enkelt celle niveau. Ud over den teknik, der anvendes i denne undersøgelse, kan andre anvendelser af levende celler anvendes, såsom FRET, og FRAP 3. Teknologien til at observere celler i realtid vil fortsat blive forbedret og anvendt til at undersøge en række cellulære processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Delvist understøttet af R01NS064593 og R21ES016636 (KV). Mikroskopi blev udført ved VCU - Neurobiologisk Afdeling & Anatomi Microscopy Facility, støttet til dels med støtte fra NIH-NINDS center kerne tilskud 5P30NS047463. Den spinning disk konfokal mikroskop blev købt med en NIH-NCRR prisen (1S10RR027957).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellStar culture dishes | Greiner Bio-one | ||
| FluroDish glass bottom dishes | World Precision Instruments, Inc. | ||
| MEM media | GIBCO | ||
| Non-essential amino acids | GIBCO | ||
| Amino acids | GIBCO | ||
| Vitamins | GIBCO | ||
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | ||
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | ||
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | ||
| N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; plasmid 19836 |
Addgene | ||
| pCLNR-H2BG; plasmid 17735 | Addgene | ||
| SuperFect | Qiagen | ||
| Zeiss Cell Observer SD Imaging system | Zeiss | ||
| AxioVision (release 4.8.2) | Zeiss | ||
| Zeiss Immersol W Oil | Zeiss | ||
| Volocity software (version 6.0) | PerkinElmer |
References
- Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell. 127, 1361-1373 (2006).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- Feuerhahn, S., Egly, J. M. Tools to study DNA repair: what's in the box. Trends Genet. 24, 467-474 (2008).
- Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis. J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).
- Giunta, S., Jackson, S. P. Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events. Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).
- Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells. Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).
- Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks. Nature. 432, 406-411 (2004).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461, 1071-1078 (2009).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).
- Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes. PLoS One. 5, e10459 (2010).
- Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks. DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).
- Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).
- Valerie, K., Povirk, L. F. Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair. Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).
- Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. 53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint. Science. 298, 1435-1438 (2002).
- Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX. J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).
