Viral Sporing af genetisk Defineret neurale kredsløb
Summary
Fremgangsmåde til sporing synaptisk forbundne neuroner er beskrevet. Vi anvender TVA specificitet af en opstrøms celle til at probe, om en cellepopulation af interesse modtager synaptisk input fra genetisk definerede celletyper.
Abstract
Klassiske metoder til at studere neuronale kredsløb er forholdsvis lille produktion. Transsynaptisk vira, især pseudorabiesvira (PRV) og rabiesvirus (RABV), og for nylig vesikulær stomatitis virus (VSV), til undersøgelse af kredsløb, bliver stadig mere populære. Disse højere throughput metoder bruger virus, der sender mellem neuroner i enten anterograd eller retrograd retning.
For nylig blev en modificeret RABV for monosynaptiske retrograde tracing udviklet. (Figur 1A). I denne fremgangsmåde er glycoprotein (G)-gen er fjernet fra det virale genom, og resupplied kun i målrettede neuroner. Infektion specificitet opnås ved at substituere et kimært G, der består af det ekstracellulære domæne af ASLV-A glycoprotein, og det cytoplasmatiske domæne af RABV-G (A / RG), til den normale RABV-G 1. Dette kimære G specifikt inficerer celler, der udtrykker TVA receptor 1. Genet, der koder TVA kan blevet delivered ved forskellige fremgangsmåder 2-8. Efter RABV-G infektion af en TVA-udtrykkende neuron kan RABV sender til andre, synaptisk forbundne neuroner i en retrograd retning af natur af sin egen G, som var co-leveres med TVA-receptoren. Denne teknik mærker et relativt stort antal indgange (5-10%) 2 på en defineret celletype, der giver et udsnit af alle de input ned på en defineret starter celletype.
Vi har for nylig ændret denne teknik til at bruge VSV som en transsynaptisk sporstof 9. VSV har flere fordele, herunder den hurtige genekspression. Her har vi detaljeret et nyt viralt sporingssystem hjælp VSV nyttige til probning microcircuitry med forøget opløsning. De oprindelige offentliggjorte strategier Wickersham et al. 4 og Beier et al. Ni tillader mærkningen af neuroner, der projicerer inficeret oprindeligt-TVA-udtrykkende-celler, her VSV blev manipuleret til kun at transmittere til tvA-udtrykkende celler (Figur 1B). Viruset først pseudotype med RABV-G for at tillade infektion af neuroner nedstrøms for TVA-udtrykkende neuroner. Efter infektion af denne første population af celler, frigivet virus kan kun inficere TVA-udtrykkende celler. Fordi transsynaptisk viral spredning er begrænset til TVA-udtrykkende celler, tilstedeværelsen eller fraværet af forbindelse fra definerede celletyper kan undersøges med høj opløsning. En eksperimentel rutediagram af disse eksperimenter er vist i figur 2. Her viser vi en model kredsløb, at retningsændring-selektivitet i muse retina. Vi undersøger forbinde starburst amacrine celler (SAC) til retinale ganglieceller (rGCS).
Protocol
Discussion
Anvendelse af vira til at studere neurale kredsløb er et relativt højt gennemløb metode til at analysere forbundne neuroner. Men genererer både VSV og RABV virioner er ikke trivielt. Selv om protokollen er anført ovenfor til redning virus fra cDNA er tilvejebragt, er det stadig en lav sandsynlighed begivenhed. Niveauerne af hver af de N-, P-og L-plasmider skal finjusteres, og mange forsøg og replikater skal gøres for at sikre viral redning. Dannelsen af ribonukleotid partikel inkorporerer en komplet VSV-gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende Sean Whelan for at få hjælp med at redde rekombinante VSV-varianter, og Didem Goz og Ryan Chrenek for teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af HHMI (CLC) og # NS068012-01 (KTB).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Microelectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 |
References
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
- Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
- Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
- Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
- Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
- Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
- Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
- Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
- Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
- Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
- Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
- van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).
