Summary

Viral traçage des circuits neuronaux génétiquement déterminées

Published: October 17, 2012
doi:

Summary

Procédé de traçage neurones connectés synaptique est décrit. On utilise la spécificité de la TVA une cellule amont pour sonder si une population cellulaire d'intérêt synaptique reçoit une entrée à partir de types de cellules génétiquement déterminées.

Abstract

Les méthodes classiques d'étude des circuits neuronaux débit assez faible. Transsynaptique virus, en particulier la pseudo-rage (PRV) et le virus de la rage (RABV), et plus récemment virus de la stomatite vésiculaire (VSV), pour l'étude des circuits, est de plus en plus populaire. Ces méthodes à utiliser plus les virus qui transmettent entre les neurones, soit la direction antérograde ou rétrograde.

Récemment, un RABV modifié pour monosynaptique rétrograde traçage a été développé. (Figure 1A). Dans cette méthode, la glycoprotéine (G), le gène est supprimé à partir du génome viral, et réapprovisionné seulement dans les neurones cibles. Spécificité infection est obtenue en substituant une chimère G, composé du domaine extracellulaire de la glycoprotéine ASLV-A et le domaine cytoplasmique de la RABV-G (A RG /), pour la normale RABV-G 1. Cette chimère G infecte spécifiquement les cellules exprimant le récepteur TVA 1. Le gène codant pour la TVA peut d étéelivered par diverses méthodes 2-8. Après RABV-G infection d'un neurone TVA exprimant, le RABV peut transmettre à d'autres neurones, synapses connectées dans un sens rétrograde par la nature de son propre G qui était co-délivré avec le récepteur TVA. Cette technique qualifie un nombre relativement important d'entrées (10.05%) 2 sur un type cellulaire défini, la fourniture d'un échantillon de toutes les entrées sur un type cellulaire défini démarreur.

Nous avons récemment modifié cette technique à utiliser VSV comme un traceur transsynaptique 9. VSV a plusieurs avantages, notamment la rapidité de l'expression des gènes. Ici, nous détaillons un nouveau système de suivi à l'aide virale utiles pour sonder les microcircuits avec une résolution accrue VSV. Alors que les stratégies originales publiées par Wickersham et al. 4 et Beier et al. 9 étiquetage de tous les permis de neurones qui projettent sur ​​un premier-infectés TVA exprimant des cellules, ici VSV a été conçu pour transmettre uniquement à la télévisionCellules exprimant A-(figure 1B). Le virus est d'abord pseudotypés avec RABV-G pour permettre l'infection des neurones en aval de TVA exprimant neurones. Après avoir infecté de cette première population de cellules, le virus ne peut infecter publié TVA cellules exprimant. Parce que la propagation virale transsynaptique est limitée à TVA cellules exprimant, la présence de l'absence de connectivité de types de cellules définies peuvent être explorées avec une grande résolution. Un diagramme expérimental de ces expériences est montré dans la figure 2. Ici, nous montrons un circuit modèle, celui de la direction de la sélectivité dans la rétine de la souris. Nous examinons la connectivité des cellules amacrines starburst (ZSC) pour les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR).

Protocol

1. Faire virus à partir d'ADNc: Recouvrement de la VSV à partir d'ADNc en utilisant la vaccine-T7 système 10 Un jour avant l'expérience, divisé en 60 cellules BsrT7 plat mm contenant du DMEM + 10% de FBS. Cellules par boîte de graines 2E6. BsrT7 cellules BHK21 sont dérivées de, ou rein de bébé hamster, cellules. PBS tiède avec 1 mM de magnésium et de calcium 1 mM à 37 ° C. Procurez-vous une petite aliquote vTF7-3, un virus de la vaccine exprimant la T7 …

Discussion

Utilisation de virus pour étudier les circuits neuronaux est une méthode débit relativement élevé d'analyser les neurones connectés. Cependant, générer à la fois des virions VSV et RABV n'est pas trivial. Bien que le protocole ci-dessus pour le sauvetage du virus à partir d'ADNc est fourni, il est toujours un événement à faible probabilité. Les niveaux de chacune des N, P et L plasmides doivent être finement ajusté, et de nombreux essais et répétitions doivent être effectuées pour assurer…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Sean Whelan de l'aide pour sauver variantes VSV recombinants, et Didem Goz et Ryan Chrenek pour l'assistance technique. Ce travail a été soutenu par HHMI (CTC), et n ° NS068012-01 (KTB).

Materials

Reagent Company Catalogue number  
      Tissue Culture
Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells available upon request    
vaccinia (vTF7-3) available upon request    
pN, pP, pl plasmids available upon request    
Calcium Chloride Sigma C1016  
Magnesium Chloride Sigma M8266  
HEK 293T cells Open Biosystems HCL4517  
60 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430166  
75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap Corning 430641  
Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Invitrogen 12491-015  
1 M HEPES pH 7.4 Gibo 15630-080  
FBS: Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028  
PKS Invitrogen 15140-163  
Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent Invitrogen 11668-019  
Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe Sigma Z248010-1PAK  
Syringe Filters Nalgene 190-2520  
PEI: High Potency Linear PEI Polysciences 23966  
      Viral Centrifugation
Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore Corning 430314  
Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344058  
Ultracentrifuge Beckman-Coulter optima XL-80K  
SW28 Ultracentrifuge rotor Beckman-Coulter 342207  
      Mouse Injection
Capillary micropipets Drummond 5-000-2005  
Stereotax Narishige SR-5M  
Micromanipulator Narishige SM-15  
Ump injector World Precision Instruments Sys-Micro4  
Four channel microcontroller World Precision Instruments UMP3  
M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt Foredom M.TXB-EM  
H.10 Handpiece, Quick Change Foredom H.10  
Step Drill, 0.5 mm Foredom A-58005P  
Microelectrode holder World Precision Instruments MEH2S  
Ketamine Henry Schein 995-2949  
Xylazine Henry Schein 4015809TV  
Buprenorphine Henry Schein 1118217  
1 ml syringe Becton-Dickinson 309628  
30 gauge injection needle Becton-Dickinson 305106  
Protective Ophthalmic Ointment Doctors Foster and Smith 9N-014748  
Ethanol Sigma 493511  
Iodine Sigma PVP1  
      Surgery and Dissection tools
Scissors Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Fine Forceps Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00  
Scalpel handle Fine Science Tools 10003-12  
Scalpel blades Fine Science Tools 10015-00  
Sutures Robbins Instruments 20.SK640  
      Dissection and antibody staining
paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417  
Triton X-100 Sigma T9284  
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121  
      Antibodies
Antibodies millipore AB144P  
Anti-gfp Abcam ab13970  
Donkey anti-chicken Dylight 488 Jackson immunoresearch 703-545-155  
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 Jackson immunoresearch 705-605-147  
DAPI Invitrogen D1306  
      Tissue mounting
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-100  
Cover glass 22 x 22, 0 thickness Electron Microscopy Sciences 72198-10  
Silicone elastomer Rogers Corp HT-6220  
Clear nail polish Electron Microscopy Sciences 72180  
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930  

References

  1. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
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Cite This Article
Beier, K., Cepko, C. Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry. J. Vis. Exp. (68), e4253, doi:10.3791/4253 (2012).

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