Summary

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Published: October 17, 2012
doi:

Summary

Werkwijze voor het traceren van synaptisch verbonden neuronen beschreven. We maken gebruik van TVA specificiteit van een upstream cel te peilen of een cel populatie van belang synaptische input van genetische gedefinieerde celtypes ontvangt.

Abstract

Klassieke methodes voor het bestuderen van neuronale circuits zijn vrij geringe capaciteit. Transsynaptic virussen, met name de pseudorabies (PRV) en rabiësvirus (RABV), en meer recent vesiculair stomatitis virus (VSV), voor het bestuderen schakelingen, wordt steeds populairder. Deze hogere doorvoersnelheid methoden gebruiken virussen die overbrengen tussen neuronen in zowel de anterograde of retrograde richting.

Onlangs werd een aangepaste RABV voor monosynaptic retrograde tracing ontwikkeld. (Figuur 1A). In deze methode wordt het glycoproteïne (G) gen verwijderd uit het virale genoom en alleen in bevoorraad gerichte neuronen. Infectie specificiteit wordt bereikt door het substitueren van een chimeer G, bestaande uit het extracellulaire domein van de ASLV-A glycoproteïne en het cytoplasmatische domein van de G-RABV (A / RG) voor de normale RABV-G 1. Deze chimere G infecteert specifiek cellen die de TVA-receptor 1. Het gen dat codeert TVA kan zijn delivered op verschillende manieren 2-8. Na RABV-G infectie van een TVA-expressie neuron kan de RABV verzenden naar andere, synaptisch verbonden neuronen in een achteruitgaande richting van nature eigen G was geleverd samen met TVA receptor. Deze techniek labels een relatief groot aantal ingangen (5-10%) 2 op een bepaald celtype, die een bemonstering van alle ingangen op een bepaald celtype starter.

We hebben onlangs gemodificeerd deze techniek VSV als een tracer transsynaptic 9. VSV heeft een aantal voordelen, waaronder de snelheid van genexpressie. Hier hebben we detail een nieuwe virale tracing systeem met behulp van VSV nuttig voor het sonderen van microcircuits met verhoogde resolutie. Terwijl de oorspronkelijke gepubliceerde strategieën Wickersham et al.. 4 en Beier et al.. 9 vergunning etiket van neuronen die aanvankelijk op geïnfecteerd TVA-expressie-cellen hier VSV werd ontworpen om slechts aan TVA-expressie brengende cellen (Figuur 1B). Het virus wordt eerst met pseudogetypeerd RABV-G infectie van neuronen stroomafwaarts van TVA-expressie neuronen mogelijk. Na het infecteren deze eerste populatie van cellen, het virus infecteren model alleen TVA tot expressie brengende cellen. Omdat de transsynaptic virale verspreiding beperkt tot TVA tot expressie brengende cellen, of afwezigheid van connectiviteit van gedefinieerde celtypes kunnen worden onderzocht met hoge resolutie. Een experimentele stroomschema van deze experimenten wordt getoond in Figuur 2. Hier laten we een model circuit, dat van richting-selectiviteit in de muis retina. We onderzoeken de connectiviteit van starburst amacrine cellen (SBZ) aan retinale ganglioncellen (RGC).

Protocol

1. Virus maken van cDNA: Terugwinning van VSV uit cDNA met Vaccinia-T7 System 10 Een dag voor experiment, BsrT7 cellen verdeeld in 60 mm schaaltje met DMEM + 10% FBS. Zaad 2E6 cellen per schaal. BsrT7 cellen afkomstig zijn van BHK21 of babyhamsterniercellen cellen. Warm PBS met 1 mM magnesium en 1 mM calcium tot 37 ° C. Aanschaffen kleine hoeveelheid vTF7-3, een vaccinia virus dat T7 polymerase en ontdooien tot kamertemperatuur. vTF7-3 is een besmettelijke vacciniavirus de uiti…

Discussion

Met virussen neurale circuits studie een relatief high throughput werkwijze voor het analyseren verbonden neuronen. Echter, het genereren van zowel VSV en RABV virionen is niet triviaal. Hoewel het bovenstaande protocol voor reddings virus van cDNA wordt, is het nog steeds een lage waarschijnlijkheid event. De niveaus van elk van de N, P en L plasmiden moeten fijn worden aangepast en vele proeven en gerepliceerd moet worden gedaan om virale rescue waarborgen. De vorming van de ribonucleotide deeltjes waarin een volledig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen graag Sean Whelan erkennen voor hulp bij het redden van recombinante VSV-varianten, en Didem Goz en Ryan Chrenek voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door HHMI (CLC), en # NS068012-01 (KTB).

Materials

Reagent Company Catalogue number  
      Tissue Culture
Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells available upon request    
vaccinia (vTF7-3) available upon request    
pN, pP, pl plasmids available upon request    
Calcium Chloride Sigma C1016  
Magnesium Chloride Sigma M8266  
HEK 293T cells Open Biosystems HCL4517  
60 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430166  
75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap Corning 430641  
Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Invitrogen 12491-015  
1 M HEPES pH 7.4 Gibo 15630-080  
FBS: Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028  
PKS Invitrogen 15140-163  
Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent Invitrogen 11668-019  
Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe Sigma Z248010-1PAK  
Syringe Filters Nalgene 190-2520  
PEI: High Potency Linear PEI Polysciences 23966  
      Viral Centrifugation
Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore Corning 430314  
Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344058  
Ultracentrifuge Beckman-Coulter optima XL-80K  
SW28 Ultracentrifuge rotor Beckman-Coulter 342207  
      Mouse Injection
Capillary micropipets Drummond 5-000-2005  
Stereotax Narishige SR-5M  
Micromanipulator Narishige SM-15  
Ump injector World Precision Instruments Sys-Micro4  
Four channel microcontroller World Precision Instruments UMP3  
M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt Foredom M.TXB-EM  
H.10 Handpiece, Quick Change Foredom H.10  
Step Drill, 0.5 mm Foredom A-58005P  
Microelectrode holder World Precision Instruments MEH2S  
Ketamine Henry Schein 995-2949  
Xylazine Henry Schein 4015809TV  
Buprenorphine Henry Schein 1118217  
1 ml syringe Becton-Dickinson 309628  
30 gauge injection needle Becton-Dickinson 305106  
Protective Ophthalmic Ointment Doctors Foster and Smith 9N-014748  
Ethanol Sigma 493511  
Iodine Sigma PVP1  
      Surgery and Dissection tools
Scissors Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Fine Forceps Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00  
Scalpel handle Fine Science Tools 10003-12  
Scalpel blades Fine Science Tools 10015-00  
Sutures Robbins Instruments 20.SK640  
      Dissection and antibody staining
paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417  
Triton X-100 Sigma T9284  
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121  
      Antibodies
Antibodies millipore AB144P  
Anti-gfp Abcam ab13970  
Donkey anti-chicken Dylight 488 Jackson immunoresearch 703-545-155  
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 Jackson immunoresearch 705-605-147  
DAPI Invitrogen D1306  
      Tissue mounting
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-100  
Cover glass 22 x 22, 0 thickness Electron Microscopy Sciences 72198-10  
Silicone elastomer Rogers Corp HT-6220  
Clear nail polish Electron Microscopy Sciences 72180  
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930  

References

  1. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  2. Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
  3. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
  4. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  5. Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
  6. Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
  7. Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
  8. Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
  9. Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
  10. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
  11. Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
  12. Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
  14. Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
  15. van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).

Play Video

Cite This Article
Beier, K., Cepko, C. Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry. J. Vis. Exp. (68), e4253, doi:10.3791/4253 (2012).

View Video