Summary

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

Published: October 17, 2012
doi:

Summary

シナプス接続されたニューロンをトレースする方法が記載されている。我々は、目的の細胞集団は遺伝的に定義された種類の細胞からシナプス入力を受け取るかどうかを調べるために上流の細胞のTVAの特異性を利用する。

Abstract

神経回路を研究するための古典的な方法は、かなり低いスループットです。特に経シナプスウイルス、仮性(PRV)と狂犬病ウイルス(RABV)、そして最近では、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、回路を研究するために、ますます人気が高まっています。これらのより高いスループット方法は順行性または逆行どちらの方向でもニューロン間の送信、ウイルスを使用しています。

最近では、単シナプス逆行トレースのために修飾されたRABVが開発されました。 ( 図1A)。この方法では、糖タンパク質(G)遺伝子はウイルスゲノムから削除され、標的ニューロンでのみ補給。感染特異性はASLV-糖タンパク質と正常RABV-G1用RABV-G(/ RG)の細胞質ドメインの細胞外ドメインから成るキメラGを代入することによって達成される。このキメラGは具体的にTVAの受容体1を発現している細胞に感染します。をコードする遺伝子TVAはdきできます様々な方法で2月8日 elivered。 TVA発現ニューロンのRABV-Gの感染後、RABVはTVAの受容体との共同配信された、独自のGの性質によって逆方向に他の、シナプス接続されたニューロンに信号を送ることができます。この手法は、定義されたスターター細胞型へのすべての入力のサンプリングを提供し、定義された細胞型への入力の数が比較的多い(5-10%)2にラベルを付けます

我々は最近、経シナプストレーサー9としてVSVを使用するには、この手法を変更しました。 VSVのは、遺伝子発現の迅速性など、いくつかの利点があります。ここでは、詳細解像度を上げると超小型回路をプロービングするための有用なVSVを使用して、新しいウイルストレースシステムを。ウィッカーシャムによるオリジナルの公表戦略。4 Whileとバイエル TVA発現細胞に感染した当初は上に任意のニューロンと、そのプロジェクトの9許可の標識は、ここにVSVをテレビにのみ送信するように設計されました発現細胞( 図1B)。ウイルスは最初TVA発現ニューロンのニューロンの下流の感染を可能にするためにRABV-Gでシューされています。細胞のこの第一の集団を感染させた後、リリースされたウイルスは、TVA-発現細胞に感染することができます。経シナプスウイルスの拡散がTVA発現細胞に限られているため、定義された種類の細胞からの接続の有無の存在は、高分解能で調べることができます。これらの実験の実験のフローチャートを図2に示します。ここでは、マウス網膜で方向選択性のあること、モデル回路を示しています。我々は、網膜神経節細胞に星形アマクリン細胞(SACの)(のRGC)の接続性を検証する。

Protocol

1。 cDNAからウイルスを作る:cDNAを用いワク-T7システム10からVSVの回復実験の前にある日、DMEM + 10%FBSを含む60ミリメートル皿にBsrT7セルを分割する。皿当たり種子2E6細胞。 BsrT7細胞はBHK21、またはベビーハムスター腎臓細胞に由来する。 1mM塩化マグネシウムと37から1 mMのカルシウム℃で温PBS 少量vTF7-3、T7ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス、室温に解凍?…

Discussion

神経回路を研究するためにウイルスを使用すると、接続されたニューロンの分析の比較的ハイスループットな方法である。しかし、VSVとRABVビリオンの両方を生成することは簡単ではありません。 cDNAからウイルスを救出するために、上記のプロトコルが用意されていますが、それはまだ低確率イベントです。 N、P、およびLプラスミドのそれぞれのレベルは細かく調整する必要があり、多くの…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、技術支援のための組換えVSVの変種を救出の支援のためのショーン·ウィーラン、とDIDEMゴズとライアンChrenekを承認したいと思います。この作品はハワードヒューズ(CLC)、および#NS068012-01(KTB)によってサポートされていました。

Materials

Reagent Company Catalogue number  
      Tissue Culture
Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells available upon request    
vaccinia (vTF7-3) available upon request    
pN, pP, pl plasmids available upon request    
Calcium Chloride Sigma C1016  
Magnesium Chloride Sigma M8266  
HEK 293T cells Open Biosystems HCL4517  
60 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430166  
75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap Corning 430641  
Media : DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Invitrogen 12491-015  
1 M HEPES pH 7.4 Gibo 15630-080  
FBS: Fetal Bovine Serum Gibco 10437-028  
PKS Invitrogen 15140-163  
Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent Invitrogen 11668-019  
Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe Sigma Z248010-1PAK  
Syringe Filters Nalgene 190-2520  
PEI: High Potency Linear PEI Polysciences 23966  
      Viral Centrifugation
Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore Corning 430314  
Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344058  
Ultracentrifuge Beckman-Coulter optima XL-80K  
SW28 Ultracentrifuge rotor Beckman-Coulter 342207  
      Mouse Injection
Capillary micropipets Drummond 5-000-2005  
Stereotax Narishige SR-5M  
Micromanipulator Narishige SM-15  
Ump injector World Precision Instruments Sys-Micro4  
Four channel microcontroller World Precision Instruments UMP3  
M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt Foredom M.TXB-EM  
H.10 Handpiece, Quick Change Foredom H.10  
Step Drill, 0.5 mm Foredom A-58005P  
Microelectrode holder World Precision Instruments MEH2S  
Ketamine Henry Schein 995-2949  
Xylazine Henry Schein 4015809TV  
Buprenorphine Henry Schein 1118217  
1 ml syringe Becton-Dickinson 309628  
30 gauge injection needle Becton-Dickinson 305106  
Protective Ophthalmic Ointment Doctors Foster and Smith 9N-014748  
Ethanol Sigma 493511  
Iodine Sigma PVP1  
      Surgery and Dissection tools
Scissors Fine Science Tools 91402-12  
Standard Forceps Fine Science Tools 11000-12  
Fine Forceps Fine Science Tools 11255-20  
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15000-00  
Scalpel handle Fine Science Tools 10003-12  
Scalpel blades Fine Science Tools 10015-00  
Sutures Robbins Instruments 20.SK640  
      Dissection and antibody staining
paraformaldehyde Sigma P6148  
Phosphate Buffered Saline Sigma P4417  
Triton X-100 Sigma T9284  
Donkey Serum Jackson Immunoresearch 017-000-121  
      Antibodies
Antibodies millipore AB144P  
Anti-gfp Abcam ab13970  
Donkey anti-chicken Dylight 488 Jackson immunoresearch 703-545-155  
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 Jackson immunoresearch 705-605-147  
DAPI Invitrogen D1306  
      Tissue mounting
Superfrost plus microscope slides Fisher 12-550-100  
Cover glass 22 x 22, 0 thickness Electron Microscopy Sciences 72198-10  
Silicone elastomer Rogers Corp HT-6220  
Clear nail polish Electron Microscopy Sciences 72180  
Prolong Gold antifade reagent Invitrogen P36930  

References

  1. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  2. Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo. Neuron. 67, 562-574 (2010).
  3. Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).
  4. Wickersham, I. R. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  5. Yonehara, K. Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit. Nature. 469, 407-410 (2011).
  6. Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells. Neuron. 68, 456-472 (2010).
  7. Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells. Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).
  8. Seidler, B. A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).
  9. Beier, K. T. Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).
  10. Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).
  11. Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase. PNAS. 83, 8122-8126 (1986).
  12. Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses. J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).
  13. Madisen, L. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).
  14. Franklin, K., Paxinos, G. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
  15. van den Pol, A. N. Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression. J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).

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Cite This Article
Beier, K., Cepko, C. Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry. J. Vis. Exp. (68), e4253, doi:10.3791/4253 (2012).

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