Summary
Synaptically जुड़ा हुआ न्यूरॉन्स का पता लगाने के एक विधि का वर्णन है. हम एक अपस्ट्रीम सेल के TVA विशिष्टता का उपयोग जांच की है कि ब्याज की एक सेल की आबादी आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल प्रकार से synaptic प्राप्त इनपुट.
Protocol
1. सीडीएनए से वायरस: VSV के सीडीएनए से वसूली चेचक-T7 10 सिस्टम का उपयोग कर
- एक प्रयोग करने के लिए पहले दिन 60 मिमी पकवान DMEM + 10% FBS युक्त में BsrT7 कोशिकाओं विभाजित. पकवान प्रति बीज 2E6 कोशिकाओं. BsrT7 कोशिकाओं BHK21, या बच्चा हम्सटर गुर्दे की कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं.
- 1 मिमी मैग्नीशियम और 1 मिमी कैल्शियम के साथ 37 के लिए गर्म पीबीएस ° सी.
- एक छोटे से अशेष भाजक vTF7-3, एक चेचक T7 पोलीमरेज़ व्यक्त वायरस, और कमरे के तापमान पर पिघलना प्राप्त. vTF7-3 एक संक्रामक चेचक T7 11 पोलीमरेज़ व्यक्त वायरस है, और केवल जैवसुरक्षा स्तर 2 रोकथाम में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस अभिव्यक्ति प्रणाली 1.9 चरण में ट्रांसफ़ेक्ट प्लाज़मिड से वांछित टेप के अधिकतम स्तर को उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. अधिकतम गति पर 30 सेकंड के लिए वायरस भंवर. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए पानी में स्नान एक tabletop sonicator में Sonicate. भंवर फिर से 30 के लिए सेकंड वायरल clumps को तोड़ने के लिए.
- BSRT7 कोशिकाओं से मीडिया निकालें.
- 11.7 μl vTF7-3 जोड़ेंमैग्नीशियम और कैल्शियम के साथ 600 μl पीबीएस और कोशिकाओं पर मिश्रण जोड़ें.
- एक 34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ प्लेटों हटो. रॉक धीरे एक बार हर 10 मिनट प्लेटें.
- 45 मिनट के बाद गुजरे हैं, अभिकर्मक शुरू करते हैं. 20 μl lipofectamine 2000 के लिए 1 मिलीलीटर DMEM और मिश्रण जोड़ें. 5 मिनट रुको.
- 5.25 ग्राम पी.एन., 2.3 ग्राम पीपी, 1.2 ग्राम pl, 1 ग्राम RABV जी pCAG, और 6 ग्राम VSV 500 μl DMEM सीडीएनए जीनोमिक जोड़ें. पी.एन. पीपी, और pl plasmids T7 प्रमोटर 10 के तहत कर रहे हैं वायरस का इष्टतम बचाव के लिए empirically निर्धारित मात्रा के साथ VSV वायरल जीनों की अभिव्यक्ति, ड्राइविंग.
- दोनों ट्यूब और मिश्रण जुडा. कमरे के तापमान पर 15 मिनट रुको.
- PBS निकालें और प्लेटें 1.5 मिलीलीटर DMEM के साथ एक बार धो लो.
- मीडिया कुल्ला Aspirate. प्लेट अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें. 34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेटें ले जाएँ.
- 5 घंटे इंतजार है, तो मीडिया को हटाएं.
- 4 मिलीलीटर DMEM + 2% FBS + 1x पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन + 10 मिमी HEPES पीएच 7.4 मीडिया बदलें. पी के अलावाप्रदूषण को रोकने, enicillin स्ट्रेप्टोमाइसिन और HEPES, मीडिया के पीएच बनाए रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं. FBS सामग्री 2% करने के लिए छोड़ा जा सकता है, के रूप में कोशिकाओं वायरस से दिन के एक मामले में नष्ट कर दिया जाएगा और इस प्रकार 10% FBS की जरूरत नहीं है.
- 48-72 घंटे के लिए 34 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेस प्लेटें.
- 3 में मीडिया को ले लीजिए और 6 दिनों के बाद अभिकर्मक, और एक 0.20 फिल्टर सुक्ष्ममापी के माध्यम से तुरंत फिल्टर सिरिंज. इस आकार फिल्टर चेचक वायरस निकालता है, लेकिन नहीं VSV.
- चूंकि हम वायरल लिफाफे RABV - जी की आपूर्ति करना चाहते हैं, और जीनोम जीन नहीं RABV-G सांकेतिक शब्दों में बदलना है, तो यह लगातार ट्रांस में आपूर्ति किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए, 293T (TVA800) TVA800 कोशिकाओं का एक अलग प्लेट बनाने. इन कोशिकाओं कि constitutively TVA रिसेप्टर व्यक्त EnvA की मध्यस्थता वायरल संक्रमण 12 की अनुमति हैं. 80% confluency, DMEM मीडिया केवल तब, बदल प्लाज्मिड एन्कोडिंग जी प्रोटीन (यानी RABV-G pCAG) प्रति प्लेट के 5 ग्राम के साथ कोशिकाओं transfect. हम पीई का उपयोग करेंमैं अभिकर्मक अभिकर्मक, एक polycationic बहुलक जो बहुत तुलनीय लिपिड आधारित तरीकों की तुलना में सस्ता है. हालांकि, lipofectamine भी इस उद्देश्य के लिए प्रभावी ढंग से कर सकते हैं इस्तेमाल किया जा. इष्टतम पी: डीएनए अनुपात empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. एक फ्लोरोसेंट संवाददाता, यानी pCAG GFP के साथ एक अलग प्रयोग में यह मत करो. 4 ग्राम डीएनए: हम 10 μl पी का उपयोग करें.
- TVA800 कोशिकाओं के ट्रांसफ़ेक्ट थाली पर 16 कदम से सतह पर तैरनेवाला लागू.
- इस प्लेट virally व्यक्त की fluorophore प्रतिदीप्ति के सबूत के लिए अगले दिन का निरीक्षण करें. वायरल प्रतिदीप्ति पहले एक एकल कक्ष के रूप में मनाया जाता है, और धीरे - धीरे समय (यानी चित्रा 3) में फैला हुआ है. वायरस के कुछ ही घंटों के भीतर फैल चाहिए.
2. पारित होने और VSV की एकाग्रता
- DMEM 10 +% ऐसी है कि आप ~ 80% अगले दिन confluency चार 10 सेमी प्लेटों FBS वाले मीडिया में TVA800 कोशिकाओं भाजित. 293T आधारित कोशिकाओं को अच्छी तरह से अपने उच्च ट्रॅन कारण काम, और sfectability TVA-व्यक्त कोशिकाओं का उपयोग गति, जिस पर पकवान में कोशिकाओं को संक्रमित हो बढ़ाता है. अन्य अत्यधिक transfectable सेल लाइनों उद्देश्य के रूप में अच्छी तरह से सेवा कर सकते हैं.
- 80% confluency, DMEM मीडिया केवल तब, बदल प्लाज्मिड एन्कोडिंग की 5 ग्राम जी प्रोटीन है कि आप प्रयोग करना चाहते हैं (यानी RABV-G pCAG) प्रति प्लेट के साथ कोशिकाओं transfect. हम पी का उपयोग करते हैं, लेकिन FUGENE / Lipofectamine काम के रूप में अच्छी तरह से.
- ग्लाइकोप्रोटीन संचय / अभिव्यक्ति सतह के लिए अभिकर्मक के बाद एक दिन रुको. मीडिया DMEM + 10% FBS (5 मिलीग्राम प्लेट /) बदलने के लिए, तो संक्रमण का एक बहुलता (MOI) में 0.01 <x <0.1 (एक आरजी /) rVSV वायरस के साथ संक्रमित.
- संक्रमण के 24 घंटे के बाद राशि की जाँच करें. आप संक्रमित कोशिकाओं (GFP प्रतिदीप्ति द्वारा की पहचान), संक्रमित कोशिकाओं (यानी चित्रा 3) के आसपास के पैच के साथ कुछ देखना चाहिए. आमतौर पर यह तैरनेवाला इकट्ठा करने के लायक ही है अगर आप> 50% कोशिकाओं के संक्रमित अन्यथा वायरल titers देख obtaineएकाग्रता से घ suboptimal होगा.
- यदि> 50%, मीडिया / प्लेट के 5 मिलीलीटर इकट्ठा, और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें. अगर बहुत कुछ कोशिकाओं को संक्रमित कर रहे हैं, एक और 12-24 घंटे के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर से जाँच करें. -80 पर एकत्र supernatants रुक डिग्री सेल्सियस
- उसके बाद हर 24 घंटे 4 दिनों की कुल के लिए 3 दिनों के लिए ले लीजिए.
- कुल मिलाकर, अगर आप 4 प्लेटों के साथ शुरू किया था, तो आप प्रत्येक दिन से मीडिया के 20 मिलीग्राम होनी चाहिए तो 80 मिलीलीटर कुल या 2 ultracentrifuge ट्यूबों तैरनेवाला के लायक. 37 में supernatants पिघलना के डिग्री सेल्सियस और बर्फ पर 0.45 सुक्ष्ममापी फिल्टर फिल्टर. Beckman अपकेंद्रित्र ट्यूबों में वायरस के 36 मिलीलीटर अशेष भाजक.
- (एक SW28 रोटर (= ८०००० XG) में 90 मिनट के लिए 21,000 कश्मीर) 4 पर तैरनेवाला ध्यान लगाओ डिग्री सेल्सियस 10% ब्लीच युक्त बीकर में तैरनेवाला छानना, और जबकि ट्यूब उलटा है, एक aspirator का उपयोग करने के लिए संभव के रूप में ट्यूब की ओर से जितना मीडिया को हटाएं.
- जबकि कवर किया. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए वायरल ट्यूबों हिला. Abou में एक मानक हिलनेवालाटी 120 rpm पर्याप्त है.
- धीरे शेष मीडिया में धीरे pipetting और नीचे 30 बार गोली महीन चुर्ण बनाना. हवा बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहो. शेष मीडिया की मात्रा के बारे में 30 μl होना चाहिए. अशेष भाजक कई ट्यूब में इस मात्रा के रूप में तो किसी विशेष शेयर के लिए कई फ्रीज पिघलना चक्र को रोकने के लिए, के रूप में इस वायरल titer में एक कमी में परिणाम कर सकते हैं. ये aliquots -80 में जमे हुए किया जा सकता डिग्री सेल्सियस
- वायरस टिटर. के बारे में 2 दिनों के बाद संक्रमण पर Titering इष्टतम है. आरंभिक संक्रमण के घंटे के एक मामले में देखा जा सकता है, लेकिन आप अनुमापांक की एक underrepresentation यदि आप केवल 1 दिन इंतजार. आदेश में वायरल titer प्राप्त करने के लिए, एक 24 अच्छी तरह से थाली में उचित सेल लाइन (293T कोशिकाओं को अच्छी तरह से काम करते हैं) पर एक सीमित केंद्रित वायरस के कमजोर पड़ने प्रयोग करते हैं, वायरस गिराए 1 से 1 तक 10 गुना: 1,000,000. हम मिल titers 10 8 -10 10 ध्यान केंद्रित गठन (FFU) इकाइयों / मिलीलीटर की रेंज में आम तौर पर कर रहे हैं.
3. वीरहमें इंजेक्शन
- हम चूहों का उपयोग करते हैं, उम्र के 6-10 सप्ताह के बीच आम तौर पर इन प्रयोगों के लिए,. किसी भी उम्र के बाद circuitry स्थापित है पर्याप्त होगा. हम रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (RGCS) से starburst एक उदाहरण के रूप में लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं (एसएसीएस) संचरण का चयन करेंगे. इस प्रयोग के रूप में चित्रा 2 में diagramed, एक ट्रिपल ट्रांसजेनिक पशु और केवल वायरस का एक इंजेक्शन की आवश्यकता है. (सभी दिखाया प्रक्रियाओं हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया है, और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार में थे).
- सबसे पहले, उचित जानवरों को उत्पन्न करने की जरूरत है. लक्ष्य है TVA सेल प्रकार में व्यक्त की है कि एक इच्छाओं में मैप करने के लिए एक वायरस (यानी एडिनो - जुड़े वायरस, AAV) के माध्यम से है, या एक ट्रांसजेनिक एलील. सेल प्रकार विशिष्टता आमतौर पर Cre अभिव्यक्ति द्वारा प्राप्त की है. यहाँ, हम भी एक सशर्त अभिव्यक्ति TVA 7 एलील में एक acetyltransferase Choline (चैट) Cre 13 एलील, को पार कर गया है कि इस तरह के TVA व्यक्त की हैएक Cre अभिव्यक्ति इतिहास (एसएसीएस) के साथ सभी कोशिकाओं में. हम भी TVA-व्यक्त कोशिकाओं के दृश्य के लिए एक सशर्त अभिव्यक्ति tdTomato एलील (R26TdT) को पार कर गया था.
- इंजेक्शन स्थान के लिए समन्वय करने के लिए पहचान करने की आवश्यकता है. ब्याज की ये निर्देशांक एक मस्तिष्क एटलस, यानी फ्रेंकलिन और Paxinos माउस मस्तिष्क 14 एटलस में पाया जा सकता है. ये निर्देशांक माउस खोपड़ी पर एक मील का पत्थर के सापेक्ष ध्यान दिया जाना चाहिए की जरूरत है. हम शीर्षस्थान का उपयोग करते हैं, लेकिन किसी भी प्रणाली समन्वय के लिए पर्याप्त है.
- Stereotaxic तंत्र तैयार करें. Microinjector नियंत्रक पर बारी, और चाल और जगह में इलेक्ट्रोड धारक सवार. तो खनिज तेल के साथ इंजेक्शन सुई वापस भरने के लिए वायरस के साथ एक इंटरफेस प्रदान. सुई तो सवार पर रखो, यकीन है कि कोई हवाई बुलबुले सुई में रहते हैं.
- वायरस, और बर्फ पर जगह पिघलना को वायरल titer में एक बूंद को रोकने के लिए. सेट microinjector "वापस" और वायरस के ट्यूब चाल ऐसी है कि कि contacti हैएनजी पर केशिका microinjector. प्रयोग लिए RABV जी के साथ pseudotyped rVSV (एक आरजी /) के लिए आवश्यक राशि को वापस ले लें.
- पशु buprenorphine (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा) के एक पूर्व ऑपरेटिव खुराक दिया जाता है से पहले सर्जरी शुरू होता है. पशु, या तो isoflurane साँस लेना, या एक ketamine के एक intraperitoneal इंजेक्शन (40-80 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (5-10 मिलीग्राम / किग्रा) anaesthetizing मिश्रण पर्याप्त है. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के विकल्प उपयोगकर्ता पर निर्भर है. एक पैर की अंगुली चुटकी तो सुनिश्चित करें कि पशुओं को पूरी तरह से anesthetized हैं किया जाता है, यदि पशु जवाब नहीं है, तो आप इस प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ सकते हैं. इन दवाओं का उपयोग करने से पहले उचित लाइसेंस प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें.
- पशु एक गरम पैड है, जो एक चल स्टैंड पर माउस स्थिति के लिए खड़ा है पर रखा जाता है. पशु शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की अवधि के दौरान रहता है. आंख के कॉर्निया के सूखने को रोकने के लिए, जबकि पशु anesthetized है मरहम लागू करें.
- माउस सिर तो stereotaxic में स्थिर होने की जरूरत हैpparatus. Stereotaxic तंत्र पर कान सलाखों का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि सिर पूरी तरह सुरक्षित है, जैसे कि सिर जमीन के समानांतर है, और laterally से बारी बारी से नहीं करता है. एक बार यह पूरा हो गया है, काटने के लिए सिर को स्थिर करने में मदद बार समायोजित करें.
- जानवर फर सिर के ऊपर चीरा के क्षेत्र में मुंडा है. इस क्षेत्र में तो इथेनॉल के साथ तीन बार धोया, आयोडीन के साथ तीन बार के द्वारा पीछा किया. एक चीरा तो एक स्केलपेल के साथ त्वचा में किया जाता है, खोपड़ी खुलासा.
- एक बार माउस और इंजेक्शन सेटअप तैयार कर रहे हैं, शीर्षस्थान स्थित होने की जरूरत है. यह सिर कि बाण के समान और दो राज्याभिषेक sutures को पूरा करने के केंद्र में क्षेत्र है. एक बार इस क्षेत्र में स्थित है, stereotaxic तंत्र पर नंबर डायल करता है उचित निर्देशांक microinjector को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, हम पार्श्व geniculate नाभिक (LGN) इंजेक्षन, निर्देशांक शीर्षस्थान से ए / पी -2.46 का उपयोग कर, एल / एम 2, डी / वी 2.75.
- एक बार निर्देशांक में मिलाया है, ड्रिल इकट्ठा किया जाना चाहिए.ड्रिल में ड्रिल बिट रखें, तो ड्रिल पर बारी. इंजेक्शन स्थल के रूप में पहचान की साइट में एक छोटे से छेद drilled किया जाना चाहिए. बहुत ड्रिल के साथ कोमल क्रम में मस्तिष्क पैरेन्काइमा को नुकसान का कारण नहीं है. जब हड्डी बहुत पतली है, ड्यूरा पर रक्त वाहिकाओं स्पष्ट हो गया है. इस बिंदु पर, ध्यान से एक छोटे (30 गेज) सुई और एक ठीक संदंश (# 5) साथ craniotomy के किनारों सालना के लिए शेष हड्डी निकालने.
- एक बस मस्तिष्क की सतह, जहां छेद drilled किया गया था के पृष्ठीय स्थिति केशिका समायोजित करें. सुई काफी तेज करने के लिए आसानी से ड्यूरा मैटर घुसना होना चाहिए. फिर वांछित गहराई सुई कम है, और इंजेक्शन शुरू. हम 100 nl / मिनट की दर पर एक वायरस इंजेक्षन.
- इस बात के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया लगभग दस मिनट लगते हैं. इंजेक्शन के बाद सुई के बारे में सात मिनट के लिए दिमाग में रहता है. यह महत्वपूर्ण है, के रूप में यह इंजेक्शन साइट से वायरस के प्रसार की अनुमति देता है. तेजी से सुई फार्म inje को हटानेction इंजेक्शन के स्थल पर एक कम संक्रमण दक्षता, का पता लगाएं, और सुई पथ साथ संक्रमण में साइट का परिणाम है.
- सुई बहुत धीरे इंजेक्शन साइट से उठाया है, के बारे में दो मिनट के अंतराल पर. यह फिर से सुई पथ साथ संक्रमण को कम करने का इरादा है.
- एक बार हटाया, तो त्वचा sutured है. पशु लगातार निगरानी कर रहे हैं और जब तक वे संज्ञाहरण से उबरने. Buprenorphine (0.05-0.1 मिलीग्राम / किग्रा) 2 दिनों के लिए हर 12 घंटे प्रशासित है.
4. / ऊतक ऊतक तैयार कटाई
- हित के ऊतक को एकत्रित करने के लिए अधिकतम समय प्रयोग के लक्ष्यों पर निर्भर करता है. आम तौर पर, VSV transsynaptic प्रसार पहले कम से कम 24 घंटे के बाद इंजेक्शन द्वारा मनाया जा सकता है. हालांकि, अब समय प्रतीक्षा अधिक प्रसार में परिणाम देगा.
- रेटिना फसल, जानवरों 1 कार्बन डाइऑक्साइड साँस लेना और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था किया जाता है का उपयोग कर euthanized हैं. नेत्रगोलक तो निकाल दिया जाता है, और एक ट्यूब चुनाव में रखाकमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 4% formaldehyde taining.
- नेत्रगोलक तो पीबीएस के साथ एक पेट्री डिश में रखा गया है. रेटिना तो अन्य ऊतकों से दूर dissected.
- , पूरे माउंट विश्लेषण के लिए दृष्टिपटल तो काट रहे हैं के रूप में फ्लैट करना, एक गिलास स्लाइड पर रखा गया है, तो सोने के बढ़ते मीडिया को लम्बा खींच के साथ मुहिम शुरू की और एक गिलास शून्य मोटाई coverslip साथ कवर किया. सिलिकॉन spacers स्लाइड और coverslip रेटिना पर संपीड़न बलों को कम करने के बीच रखा जाता है. अनुभाग विश्लेषण के लिए, रेटिना रेटिना submerges तक पीबीएस में 30% sucrose में रखा गया है. यह तो 50% अक्टूबर के एक मिश्रण में रखा गया है और 3 घंटे के लिए 50% 30% sucrose समाधान. यह तो जमे हुए फ्लैश है, और ° जब तक सी में कटौती के लिए तैयार -80 में रखा.
5. प्रतिनिधि परिणाम
सीडीएनए से बचाया है वायरस है कि TVA800 कोशिकाओं, लेकिन नहीं 293T कोशिकाओं (3 चित्रा) को संक्रमित करने में सक्षम होना चाहिए. RABV - जी की आपूर्ति कई सेल टी के संक्रमण परमिटypes, 293T सहित. हालांकि, बाद से एक आरजी / जीनोम जीनोम में encoded है, कोशिकाओं के बीच TVA-व्यक्त की कोशिकाओं में एक बहुत उच्च दर पर होता है फैल गया.
एक बार वायरस केंद्रित, 10 8 FFU / मिलीग्राम और 10 10 / FFU मिलीलीटर के बीच ठेठ titers रेंज है. इन titers vivo में उपयोग के लिए पर्याप्त हैं.
माउस में LGN इंजेक्शन के दौरान, हम उदर LGN (vLGN) से पृष्ठीय LGN (dLGN) भेद नहीं के रूप में दोनों आमतौर पर संक्रमित हो गया. इसलिए, कई RGC प्रकार (4 चित्रा) लेबल हो जाते हैं कि परियोजना vLGN करने के लिए उन लोगों के लिए, melanopsin (चित्रा 4D) RGCS और DSGCs (चित्रा 4E) के रूप में है, और उन है कि इस तरह के रूप में dLGN परियोजना, छोटे कुंज (चित्रा 4C) RGCS और पर बंद DSGCs (चित्रा 4F). हालांकि RGC के एक से अधिक प्रकार sacs वायरस फैलता है, के रूप में कहीं से रिपोर्ट (Beier एट अल., समीक्षा में), यहाँ हम केवल ध्यान केंद्रितएसएसीएस अच्छी तरह से अध्ययन पर बंद DSGCs के कनेक्शन पर.
(-) जब हम (+) जीनोटाइप cTVA / चैट Cre चूहों इंजेक्षन, जहां कोई TVA व्यक्त किया जाना चाहिए, केवल RGCS (यानी चित्रा 4) लेबल रहे हैं. ये RGCS RABV - जी pseudotyped वायरस के प्रारंभिक तेज के कारण कर रहे हैं, और कोई अंतर नहीं होता है. कोई RGCS एक LGN rVSV के संक्रमण (एक आरजी /) RABV जी के साथ नहीं pseudotyped वायरस, इन virions की इन RGCS की अनुप्रस्थ लंबी axons अक्षमता की वजह से संक्रमित हैं. हालांकि, जब LGN (+) cTVA / ChATCre (+) (और R26TdT (+)) चूहों में इंजेक्शन लगाने, वायरल प्रसार, केवल लाल कोशिकाओं, जो Cre रिपोर्टर (यानी चित्रा 5) व्यक्त घटित नहीं करता है. ये भी विरोधी चैट एंटीबॉडी के साथ सह - लेबल कोशिकाओं, और केवल दो चैट laminae में विभक्त हो जाना, sacs (आंकड़े 5B 'सी') के रूप में उनकी पहचान की पुष्टि. virally DSGC प्रति लेबल sacs की संख्या एक से नौ तक बताया गया.
चित्रा 1 हमारे प्रतिगामी transsynaptic अनुरेखण प्रणाली मूल रूप से विकसित की विधि की तुलना में. (ए) (i) Wickersham और उनके सहयोगियों द्वारा विकसित विधि स्टार्टर कोशिकाओं ", तीन जीनों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं: TVA रिसेप्टर, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की विशेष रूप से करने के लिए संक्रमण की अनुमति के लिए प्रयोग किया जाता है, RABV जी, के लिए RABV पूरक करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो ही जी जीन नष्ट कर दिया था, और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान के लिए एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन. (Ii) आरजी / प्रोटीन के साथ pseudotyped RABV TVA-व्यक्त कोशिकाओं को संक्रमित करता है, उन्हें पीले रंग बनाने. (Iii) प्रतिगामी transsynaptic संचरण अपस्ट्रीम न्यूरॉन्स के लिए होता है. (बी) (i) हमारे विधि में, TVA-व्यक्त कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से परिभाषित कर रहे हैं, कर रहे हैं और एक सशर्त लाल फ्लोरोसेंट prote के साथ लेबलअंदर (ii) "स्टार्टर कोशिकाओं उन एक वायरल जीनोम में एक आरजी जीन / कूटबन्धन VSV द्वारा संक्रमित हैं. ये स्टार्टर कोशिकाओं TVA रिसेप्टर व्यक्त नहीं करते. (Iii) प्रतिगामी transsynaptic संचरण TVA व्यक्त न्यूरॉन्स को तब होती है, केवल अगर इन कोशिकाओं स्टार्टर न्यूरॉन्स पर synaptic इनपुट प्रदान करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2 प्रयोगात्मक प्रक्रिया के योजनाबद्ध. (ए) पहले, इस वायरस सीडीएनए से बचाया है. यह तो और passaged है RABV जी के साथ pseudotyped, और केंद्रित है और titered. यह वायरस फिर मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है, जहां यह करने के लिए समय की अवधि के लिए वांछित सेते हैं की अनुमति दी है. इस के बादसमय, काटा आंख है, और रेटिना dissected और विश्लेषण. (बी) RABV जी के साथ वायरस छद्मरूप के योजनाबद्ध. यह एक मस्तिष्क इंजेक्शन से रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के संक्रमण के लिए आवश्यक है. टिशू कल्चर कोशिकाओं में जीन RABV - जी 1 ट्रांसफ़ेक्ट TVA रिसेप्टर व्यक्त. इन कोशिकाओं को फिर से rVSV (एक आरजी /) वायरस से संक्रमित हैं. वायरल लिफाफे में जारी virions RABV-G है, लेकिन वायरल जीनोम में RABV-G के लिए जीन नहीं होगा. (सी) माउस की एक योजनाबद्ध ट्रिपल ट्रांसजेनिक जानवरों के लिए आवश्यक पार. सशर्त TVA और tdTomato alleles पसंद का एक Cre ड्राइवर, जैसे है कि दोनों TVA और tdTomato केवल एक Cre अभिव्यक्ति इतिहास के साथ कोशिकाओं में व्यक्त कर रहे हैं को पार कर रहे हैं. इस उदाहरण में, हम चैट Cre इस्तेमाल किया. (D) क्रम में रेटिना संक्रमण का एक योजनाबद्ध DSGC - सैक सर्किट का पता लगाने के लिए. चैट कोशिकाओं व्यक्त TVA और tdTomato बना रहे हैं, के रूप में (सी) में दिखाया गया है. RGCS में एक LGN से संक्रमित होते हैंवायरस के fection (बी) में उत्पादन किया. के रूप में वायरस GFP व्यक्त, इन RGCS हरी हो जाएगा. वायरस तो केवल फैल जाएगा TVA व्यक्त चैट लंबे प्रबर्धों से रहित कोशिकाओं अगर वे लेबल RGC से जुड़े हैं. इन कोशिकाओं को दोनों लाल और हरे या पीले रंग हो जाएगा. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3 rVSV (एक आरजी /) वायरस की 293T और TVA800 कोशिकाओं पर व्यवहार. इन कोशिकाओं को एक कम टिटर (एक आरजी /) rVSV RABV - जी के साथ pseudotyped से संक्रमित थे. TVA के बीच वायरस फैलता व्यक्त घंटे के एक मामले में कोशिकाओं के रूप में 6 घंटे के बाद संक्रमण 1 (HPI), और 2 दिनों के बाद संक्रमण (डीपीआई) में दिखाया गया है. मैं हालांकि, 293T कोशिकाओं, जो TVA रिसेप्टर व्यक्त नहीं करते पर फैला है, हालांकिटी होती है, बहुत धीमी गति से होता है. पैमाने बार = 100 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 4 गैर TVA व्यक्त चूहों के RGCS के प्रतिनिधि संक्रमण. पशु LGN में (एक आरजी /) rVSV वायरस RABV जी के साथ pseudotyped के साथ अंतःक्षिप्त थे, और ऊतक 2 डीपीआई काटा. (ए) विरल (RGCS पीले तीर द्वारा इंगित) या (बी) घने संक्रमण वायरस और इंजेक्शन की गुणवत्ता के अनुमापांक के आधार पर हो सकता है, प्राप्त कर सकते हैं. RGCS के कई अलग अलग प्रकार (सी) छोटे कुंज RGCS, (डी) टाइप 1 melanopsin RGCS, (ई) DSGCs, और (एफ) दूसरों के बीच पर बंद DSGCs, सहित आकारिकी, के आधार पर पहचाना जा सकता है. स्केल सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 5 (एक आरजी /) rVSV पर बंद DSGCs से sacs संचरण. अपेक्षित पैटर्न इस प्रकार है. (ए) पर बंद DSGCs संचारित वायरस कई sacs (पीला arrowheads) (हरे रंग भरने के साथ सफेद arrowhead). (एक). सभी हरी कोशिकाओं है कि Cre पत्रकार के साथ सह - लेबल DSGC नहीं कर रहे हैं, यह दर्शाता है कि वे TVA व्यक्त sacs रहे हैं. (ईसा पूर्व) (हरे भरने के साथ सफेद arrowhead) DSGC और SACS (पीला arrowheads) रेटिना आंतरिक उलझन - रूप परत (आईपीएल) के उपयुक्त चैट परतों में विभक्त हो जाना. कोशिकाओं को जो वायरस पहुंचाता है और दोनों पर बंद SACS शामिल हैं. पैनल बी 'और' सी 'में नंबर आईपीएल laminae संकेत मिलता है. DSGC सोमा का स्थान केवल arrowhead ने संकेत दिया है लेकिन दिखाया sacs पर प्रकाश डाला पैनल सी में नहीं है. स्केल सलाखों = 50 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
वायरस का उपयोग करने के लिए तंत्रिका सर्किट का अध्ययन एक अपेक्षाकृत उच्च लॉग न्यूरॉन्स का विश्लेषण करने के throughput विधि है. हालांकि, दोनों VSV और RABV virions पैदा तुच्छ नहीं है. हालांकि सीडीएनए से वायरस से बचाव के लिए ऊपर सूचीबद्ध प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है, यह अभी भी एक घटना कम संभावना है. एन, पी, और एल plasmids के प्रत्येक के स्तर को पतले समायोजित करने की आवश्यकता है, और कई परीक्षणों और replicates वायरल बचाव सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए. ribonucleotide शामिल एक पूर्ण VSV जीनोम आरएनए कण के गठन एक घटना कम संभावना है, और इसलिए कई प्रयास ले सकता है. इस तकनीक के अनुकूलन के लिए समय की आवश्यकता हो सकती है, हालांकि, एक बार इसे अनुकूलित है, वायरस बचाव करना बहुत आसान है.
व्यक्ति RGCS से वायरल संचरण के विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा है जब RGC वृक्ष के समान arbors 4A चित्रा) (यानी ओवरलैप नहीं किया जाता है. वायरस इंजेक्शन और इंजेक्शन निर्देशांक की राशि इष्टतम संक्रमण के लिए समायोजित किया जा सकता है. इसके अलावा टी,वह इंजेक्शन के स्थान लेबल RGCS की संख्या और प्रकार को प्रभावित करेगा (यानी बेहतर colliculus या superchiasmatic नाभिक अलग एक LGN इंजेक्शन से और संख्या RGCS के प्रकार लेबल होगा).
VSV लाभ के एक नंबर इनका उपयोग और RABV तक रिश्तेदार है. VSV की अभिव्यक्ति का स्तर बहुत तेजी से है, 9,15 घंटे के भीतर दिखाई जा रही है. यह कम ऊष्मायन समय परमिट. इस प्रयोग में, एक आरजी / ग्लाइकोप्रोटीन वायरल जीनोम के भीतर इनकोडिंग था, वायरस प्रतिकृति सक्षम बनाने. जबकि प्रतिकृति सक्षम रेबीज वायरस एक BL3 रोकथाम स्तर आवश्यक है, VSV के लिए, यह केवल BL2 है. ग्लाइकोप्रोटीन RGCS में किया गया सकता है ट्रांस में प्रदान की है, यानी एक AAV के पूर्व संक्रमण ए / आरजी संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग. हालांकि, इस रणनीति दोहरे संक्रमण पर निर्भर करता है, और glycoprotein अभिव्यक्ति के स्तर इष्टतम नहीं हो सकता. जब वायरल जीनोम से व्यक्त ग्लाइकोप्रोटीन स्तर सूक्ष्मता के रूप में देखते हैंजंगली प्रकार VSV के मामले. सह संक्रमण के लिए आवश्यकता के बिना, सभी द्वारा लेबल RGCS वायरल संचरण के लिए संभावित है. VSV की बड़ी खामी इसकी अपेक्षाकृत तेजी से सेल विषाक्तता है. हम शरीर विज्ञान के द्वारा VSV संक्रमित कोशिकाओं की जांच की है, और कहा है कि वे physiologically 18 घंटा के बाद संक्रमण से सामान्य थे, लेकिन 48 घंटा के बाद संक्रमण से शारीरिक माप प्राप्त भी बीमार थे. आम तौर पर, न्यूरॉन्स 2-3 दिनों के बाद संक्रमण के लिए morphologically सामान्य लग रही है, लेकिन शीघ्र ही बीमारी के लक्षण (blebbing) दिखाने के लिए शुरू. इस समय जो में transsynaptic संचरण देखा जा सकता है (24 घंटे) के बाद है. हालांकि, RABV और इनका उपयोग सहित सभी transsynaptic वायरस, कोशिकाओं को विषाक्त कर रहे हैं. इसलिए, VSV वर्तमान में सबसे अच्छा एक संरचनात्मक लेबलिंग उपकरण के लिए इस्तेमाल किया है, हालांकि हम इसे और बेहतर शारीरिक जोड़तोड़ के लिए अनुकूल बनाने की प्रक्रिया में हैं.
VSV एक विशेष रूप से शक्तिशाली transsynaptic neuronal अनुरेखक है. अपनी अलग जी को स्वीकार करने की क्षमता के स्वभाव सेlycoproteins, यह अग्रगामी या प्रतिगामी 9 दिशाओं में न्यूरॉन्स ट्रेस कर सकते हैं. यहाँ, हम बताते हैं कि यह भी एक अलग सवाल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - या नहीं, एक स्टार्टर सेल की आबादी पर एक आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल प्रकार आदानों. यहाँ हम दिखाना है रेटिना में अपनी उपयोगिता है, लेकिन हम यह भी इस्तेमाल किया है के लिए आनुवंशिक रूप से परिभाषित interneuronal आबादी बराबर सफलता के साथ मस्तिष्क लेबल,. यह भी एक अलग ग्लाइकोप्रोटीन होते हैं, TVA-व्यक्त कोशिकाओं transsynaptic अग्रगामी संचरण की अनुमति के लिए संशोधित किया जा सकता है. आगे जोड़तोड़ की संभावना है करने के लिए आगे microcircuits का विश्लेषण करने में मदद और तंत्रिका कनेक्शन के जटिल गणनाओं decode करने के लिए की क्षमता प्रदान करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम सहायता लिए पुनः संयोजक VSV वेरिएंट बचाव के साथ शॉन Whelan स्वीकार करना होगा, और didem Goz और तकनीकी सहायता के लिए रयान Chrenek. यह काम HHMI (सीएलसी) द्वारा समर्थित किया गया था, और # NS068012 01 (KTB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Baby Hamster Kidney (BSRT7) cells | available upon request | ||
| vaccinia (vTF7-3) | available upon request | ||
| pN, pP, pl plasmids | available upon request | ||
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEK 293T cells | Open Biosystems | HCL4517 | |
| 60 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430166 | |
| 75 cm2 Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 430641 | |
| Media : DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Invitrogen | 12491-015 | |
| 1 M HEPES pH 7.4 | Gibo | 15630-080 | |
| FBS: Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| PKS | Invitrogen | 15140-163 | |
| Lipofectamine 2,000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-019 | |
| Syringe: 5 ml Luer-Lock syringe | Sigma | Z248010-1PAK | |
| Syringe Filters | Nalgene | 190-2520 | |
| PEI: High Potency Linear PEI | Polysciences | 23966 | |
| Viral Centrifugation | |||
| Corning 150 ml Tube Top Vacuum Filter System, 0.45 μm Pore | Corning | 430314 | |
| Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 ml, 25 x 89 mm ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344058 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | optima XL-80K | |
| SW28 Ultracentrifuge rotor | Beckman-Coulter | 342207 | |
| Mouse Injection | |||
| Capillary micropipets | Drummond | 5-000-2005 | |
| Stereotax | Narishige | SR-5M | |
| Micromanipulator | Narishige | SM-15 | |
| Ump injector | World Precision Instruments | Sys-Micro4 | |
| Four channel microcontroller | World Precision Instruments | UMP3 | |
| M.TXB Bench Motor with C.EMX-1 Dial Control, 115 Volt | Foredom | M.TXB-EM | |
| H.10 Handpiece, Quick Change | Foredom | H.10 | |
| Step Drill, 0.5 mm | Foredom | A-58005P | |
| Micr–lectrode holder | World Precision Instruments | MEH2S | |
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | |
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | |
| Buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | |
| 1 ml syringe | Becton-Dickinson | 309628 | |
| 30 gauge injection needle | Becton-Dickinson | 305106 | |
| Protective Ophthalmic Ointment | Doctors Foster and Smith | 9N-014748 | |
| Ethanol | Sigma | 493511 | |
| Iodine | Sigma | PVP1 | |
| Surgery and Dissection tools | |||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Sutures | Robbins Instruments | 20.SK640 | |
| Dissection and antibody staining | |||
| paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Antibodies | |||
| Antibodies | millipore | AB144P | |
| Anti-gfp | Abcam | ab13970 | |
| Donkey anti-chicken Dylight 488 | Jackson immunoresearch | 703-545-155 | |
| Donkey anti-chicken Alexa Fluor 647 | Jackson immunoresearch | 705-605-147 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Tissue mounting | |||
| Superfrost plus microscope slides | Fisher | 12-550-100 | |
| Cover glass 22 x 22, 0 thickness | Electron Microscopy Sciences | 72198-10 | |
| Silicone elastomer | Rogers Corp | HT-6220 | |
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | |
|
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References
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