Summary
हम एक सरल विधि microfluidic कई अलग उपभेदों के लिए इसी तरह गतिशील शर्तों को लागू करने में सक्षम उपकरणों के एक साफ कमरे या नरम लिथोग्राफी के लिए आवश्यकता के बिना, उत्पादन उपस्थित थे.
Abstract
पर्यावरण परिवर्तन के लिए सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन कई प्रयोगात्मक चुनौतियों poses: कोशिकाओं को बदलती परिस्थितियों में imaged किया जा, एक तुलनात्मक रूप में अक्सर की जरूरत है. Multiwell प्लेटों को नियमित करने के लिए कई अलग अलग उपभेदों या सेल लाइनों की तुलना के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन पर्यावरण की गतिशीलता पर सीमित नियंत्रण की अनुमति. Microfluidic उपकरणों, दूसरे हाथ पर, आसपास की स्थिति पर उत्तम गतिशील नियंत्रण की अनुमति है, लेकिन यह छवि को चुनौती दे रहा है और उन में कुछ उपभेदों से भेद. यहाँ हम आसानी से और तेजी से एक microfluidic कई अलग खमीर उपभेदों के एक चैनल में गतिशील बदलती परिस्थितियों को लागू करने में सक्षम उपकरण के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन है. डिवाइस तैयार की है और नरम लिथोग्राफी के लिए आवश्यकता के बिना सरल साधन के द्वारा निर्मित है. यह प्रवाह वाई के आकार का एक दूसरे को शरण देने परत microwells जुड़ी चैनल से बना है. उपभेदों अलग microwells में रखा जाता है, और सटीक एक ही गतिशील शर्तों के तहत imaged. हम डेमोअलग खमीर उपभेदों में पोषक तत्व परिवर्तन की दालों के लिए प्रोटीन स्थानीयकरण प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए उपकरण के उपयोग nstrate.
Introduction
कोशिकाओं को लगातार एक गतिशील बदलते पर्यावरण के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं, उनके चयापचय, transcriptional प्रोफ़ाइल और सेलुलर कार्यों को बदलने के द्वारा. इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए, तरीकों है कि इस तरह के बदलाव यों कर सकते हैं की जरूरत है. ऐसी प्रतिक्रियाओं के लिए readout का एक प्रकार पोषण तनाव के जवाब में तनाव से संबंधित प्रतिलेखन कारकों के स्थानीयकरण में परिवर्तन है.
Microfluidic 1 उपकरणों के लिए गतिशील 2-4 कोशिकाओं के लिए पर्यावरण की स्थिति में हेरफेर किया गया है. वे जीना सेल इमेजिंग के लिए कई फायदे मौजूद कोशिकाओं के ठीक पर्यावरण और नियंत्रित किया जा सकता है गतिशील बदल कोशिकाओं रहते imaged बाह्य परिस्थितियों के हेरफेर के दौरान सभी समय पर, हो सकता है, और न्यूनतम अभिकर्मक की मात्रा के लिए आवश्यक हैं. एक microfluidic डिवाइस के लिए एक बहुत ही सरल डिजाइन, दो स्थितियों के बीच प्रत्यावर्तन की अनुमति, एक वाई के आकार 2 युक्ति है. हम नियमित वाई के आकार microfluidic उपकरणों कि अनुमति का उपयोगचैनल में कोशिकाओं को गतिशील परिवर्तन के आवेदन. हम खमीर कोशिकाओं में fluorescently टैग तनाव से संबंधित प्रतिलेखन कारकों के स्थानीयकरण परिवर्तन का पालन करने के लिए इस उपकरण का उपयोग. हम पोषण की स्थितियों को बदलने के तहत इन परिवर्तनों का पालन करें. उदाहरण के लिए, हम की एक नाड़ी (या दालों की श्रृंखला) प्रदान कर सकते हैं ग्लूकोज युक्त मध्यम कोई ग्लूकोज माध्यम का एक अवधि के भीतर एक बहुत ठीक अस्थायी समाधान है. अक्सर इस तरह के प्रयोगों में, एक अलग सेल उपभेदों (उदाहरण के लिए, अलग म्यूटेंट, या अलग जंगली आइसोलेट्स) की प्रतिक्रियाओं की तुलना में रुचि रखते है. वाई के आकार का चैनल प्रत्येक चैनल में एक तनाव को सीमित है - अगर एक से अधिक तनाव का उपयोग किया जाता है, वहाँ तनाव के बीच अंतर करने के लिए कोई आसान तरीका है. इस पर काबू पाने, विभिन्न चैनलों का उपयोग किया जा सकता है. अगर हम कई उपभेदों ही गतिशीलता शर्तें लागू करना चाहते हैं, हम वाई चैनल अवधारणा कई चैनलों के साथ गठबंधन करना चाहते हैं. इस समाधान को लागू करने में दो चुनौतियों का सामना कर रहे हैं: यह मुश्किल होने के लिए आवेदन कर सकते हैंसभी चैनलों के लिए एक ही समय में एक ही स्थिति वह है, और वहाँ Y-चैनलों कि एक डिवाइस में लगाया जा सकता है की संख्या के लिए एक ज्यामितीय सीमा है. इसलिए हम एक चैनल में गतिशील शर्तों के तहत कई उपभेदों को देखने के लिए एक तरीका है के लिए देख रहे थे.
यहाँ हम एक दो स्तरित microfluidic ही गतिशील शर्तों के तहत एक चैनल में इमेजिंग कई उपभेदों के लिए इरादा डिवाइस का वर्णन. नीचे की परत में छेद की एक पंक्ति के साथ पतली PDMS के होते हैं. इस परत कांच coverslip कुओं में जो हम अलग अलग उपभेदों जगह, उन्हें कांच के लिए एक concanavalin साथ पालन बनाने के लिए जुड़ा हुआ है. दूसरी परत एक वाई के आकार microfluidic डिवाइस स्कॉच टेप 5 विधि का उपयोग कर बनाया है. कुओं में दबाव डाल के बाद दूसरी परत जल्दी से गठबंधन किया है और पहली बार एक से जुड़ा है, कई कुओं जिनमें अलग अलग उपभेदों के साथ एक चैनल बनाने. यह अंतिम डिवाइस एक चैनल में कई उपभेदों के बाद, सभी जहां की अनुमति देता हैउपभेदों सटीक एक ही समय में एक ही शर्तों के अधीन हैं. पूरे डिजाइन और उत्पादन प्रक्रिया benchtop पर किया जा सकता है, सरल साधन का उपयोग कर कोई नरम लिथोग्राफी के साथ.
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Protocol
1. एक स्कॉच टेप 5 मास्टर बनाना
- ड्रा या बाहर कागज पर वांछित microchannel पैमाने पर, लेआउट मुद्रित. हमारे मामले में डिजाइन दो वाई के आकार का चैनल, प्रत्येक के होते हैं 3 मिमी चौड़े (2 चित्रा).
- स्कॉच टेप की परतों के साथ एक गिलास स्लाइड कवर. परतों की संख्या चैनल (परत प्रति के बारे में 60 सुक्ष्ममापी) की ऊंचाई का निर्धारण करेगा. हम 3 स्कॉच टेप परतों का इस्तेमाल किया.
- एक सपाट सतह पर लेआउट डिजाइन रखें. डिजाइन पैटर्न पर स्लाइड संरेखित करें. एक स्केलपेल के साथ सावधानी से गिलास स्लाइड पर लेआउट के अनुसार टेप में कटौती.
- Microchannel के लेआउट में उन लोगों को छोड़कर गिलास स्लाइड के सभी क्षेत्रों से सेलो टेप निकालें.
- 65 डिग्री सेल्सियस में 2-3 मिनट के लिए एक गर्म ओवन में स्लाइड रखें. इथेनॉल के साथ धीरे साफ करें.
2. एक PDMS microfluidic युक्ति Fabricating
- मिक्स आधार और PDMS के इलाज के घटक के रूप में निर्माता से सिफारिश की है. हम एक 10:01 का उपयोग करेंआधार के इलाज एजेंट अनुपात. ~ 0.5 सेमी की ऊंचाई से एक पेट्री डिश के में PDMS मिश्रण के बारे में 30 मिलीलीटर डालो. Degas निर्वात में PDMS अगर जरूरत है. PDMS में नमूनों स्कॉच टेप का सामना करना पड़ रहा है के साथ डूब गिलास स्लाइड. PDMS बाद पैटर्न रखकर स्लाइड और पकवान नीचे के बीच हवा के बुलबुले के गठन से बचाता है. 65 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए चिकित्सा, यकीन है कि पकवान क्षैतिज एक बुलबुला स्तर का उपयोग कर रही है.
- एक नया 90 मिमी पेट्री डिश में मिश्रण के PDMS 3 मिलीलीटर डालना, 0.5 गहरी मिमी के बारे में एक परत में जिसके परिणामस्वरूप. (यदि एक स्पिन coater उपलब्ध है, यह इस चरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है).
- Degas और 2.1 के रूप में इलाज.
- धीरे बाहर एक स्केलपेल के साथ वांछित आकार microfluidic डिवाइस में कटौती. इस परत "प्रवाह परत" कहा जाएगा.
- 2 पेट्री डिश से एक पतली परत PDMS के समान आकार टुकड़ा काट. यह "कुओं परत" करार दिया जाएगा.
- और inlets प्रवाह परत में दुकानों के लिए पंच छेद करने के लिए एक उचित आकार बायोप्सी छेदने का शस्र (हम 1.2 मिमी आईडी का उपयोग) का प्रयोग करें. डिजाइन और कुओं बाहर लेआउट पंच पर एक मोटी गिलास स्लाइड लेआउट पर microchannels साथ संरेखण में 2 मिमी आईडी बायोप्सी छेदने का शस्र, का उपयोग पर कुओं परत रखें.
- दोनों PDMS के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक 24 मिमी x 60 मिमी इथेनॉल के साथ कांच coverslip परतों को साफ करें. एयर सूखी और साफ रखें.
- प्लाज्मा दोनों कांच coverslip और कुओं परत PDMS प्रतिवर्ती संबंधों के लिए या तो मानक प्लाज्मा नक़्क़ाश (गैर प्रतिवर्ती संबंध के लिए) का उपयोग कर या एक हाथ से आयोजित प्रभामंडल 6 treater इलाज. ध्यान coverslip के शीर्ष पर कुओं परत जगह आसंजन के कारण (3 चित्रा). धीरे बाहर किसी भी हवाई बुलबुले (यदि आवश्यक) रगड़ें.
3. सेल इमेजिंग प्रयोग
- सुनिश्चित करें कि आप इच्छित मीडिया लचीले प्लास्टिक ट्यूब के लिए 0.02 के आंतरिक व्यास "सिरिंज पंप में (Tygon) के साथ जुड़ा हुआ उपयुक्त सीरिंज में तैयार.
- एस आगे बढ़ें तरल चरण YPD में वांछित cerevisiae उपभेदों. अच्छी तरह से भंवर और जगह 300 μmicrocentrifuge ट्यूब में प्रत्येक तनाव के एल.
- धीरे से concanavalin (सिग्मा) 2 प्रत्येक कुएं में मिलीग्राम / मिलीलीटर ए के 1 μl जगह. हर अच्छी तरह से दो बार से बाहर धीरे पानी pipetting द्वारा अतिरिक्त concanavalin धो.
- है जबकि concanavalin एक सूख रहा है, उपभेदों दो बार धोने SC मध्यम कमी ग्लूकोज के 300 μl के साथ. सेल दीवारों से अवशिष्ट ग्लूकोज वॉशिंग concanavalin ए उचित पालन में मदद करता है
- भंवर अच्छी तरह से कोशिकाओं. पिपेट 0.75 μl या अपने स्वयं के अच्छी तरह से (3 चित्रा) में प्रत्येक कोशिका निलंबन की कम. धीरे अमीर माध्यम से अवशिष्ट कोशिकाओं धो लो. अगले दो चरणों के लिए जल्दी से प्रदर्शन किया जा क्रम में सुखाने से कोशिकाओं को रोकने की जरूरत है.
- प्लाज्मा चिप के इलाज और कुओं अच्छी तरह से हाथ से आयोजित प्रभामंडल treater का उपयोग कर, सावधान किया जा रहा है नहीं कुओं सीधे मारा. कुओं पर ध्यान चिप जगह है, दोनों के बीच तालमेल के लिए करीब ध्यान दे (इस कदम त्रिविमदर्शी के तहत किया जा सकता है). धीरे पीडी के दो परतों पालन करना दबाएँएमएस. धीरे धीरे डिवाइस पूरी तरह से के बारे में 50 μl समृद्ध माध्यम से भर यकीन है कि कोई हवाई बुलबुले के चैनल के अंदर छोड़ दिया कर रहे हैं.
- डिवाइस कनेक्ट, उपयुक्त inlets में ट्यूब डालने और मीडिया प्रवाह शुरू. लो ख्याल है कि कोई हवाई बुलबुले डिवाइस में पेश कर रहे हैं के रूप में इन को हटाने के मुश्किल हो सकता है, यह एक इनलेट या आउटलेट रखती द्वारा पूरा किया जा सकता है और धीरे डिवाइस जहां बुलबुले पर दोहन, कांच coverslip नहीं तोड़ सावधान किया जा रहा है.
- खुर्दबीन के नीचे रखें और एक अच्छी तरह से उपयुक्त इमेजिंग अंक मिल सकते हैं.
- अमीर मध्यम प्रवाह के तहत कोशिकाओं को 1 घंटे या उससे अधिक समय के लिए करने के लिए वसूली की अनुमति देने के लिए अगर जरूरत रखें.
- प्रयोग शुरू: हम प्रत्येक से दो सिरिंज पंप के निरंतर प्रवाह का उपयोग करने के लिए मीडिया की backflow को रोकने के लिए, रिश्तेदार प्रवाह दरों में परिवर्तन के रूप में वांछित. पंप की स्थापना एक मध्यम में एक चैनल की चौड़ाई (4 चित्रा) की 80% से अधिक बह परिणाम 0.8 मिलीग्राम / घंटा और पंप बी 0.2 मिलीग्राम / घंटा. यह गतिशील हो ग कर सकते हैंदो प्रवाह दर बदलने द्वारा फांसी की सजा दी है. नई शर्तों के 2 चैनल की पूरी लंबाई के साथ सेकंड के भीतर स्थिर.
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Representative Results
विभिन्न प्रकारों के बीच अलगाव को प्रदर्शित करने के लिए हम वैकल्पिक कुओं में दो वर्गो में विभाजनीय खमीर उपभेदों imaged. इमेजिंग पूर्ण कुओं कुओं (चित्रा 5a, ख) के बीच कोई सेल रिसाव से पता चलता है. दोनों उपभेदों प्रतिलेखन कारक YFP साथ टैग MSN2 है. गतिशील स्थितियों को बदलने के साथ - साथ प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, हम दो इनपुट चैनल में प्रवाह की दर बंद है, कोई ग्लूकोज माध्यम है, जो YFP Msn2 - स्थानीयकरण में नाभिक (चित्रा 5c, घ) के लिए परिणामस्वरूप एक कदम बनाने. एक ही समय में सभी कुओं में मापा प्रतिक्रिया हुई, दिखा डिवाइस समवर्ती गतिशील शर्तों के कई कुओं के लिए आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चित्रा 1. डिवाइस डिजाइन. डिवाइस एक coverslip, एक पतली "वेल्स" परत और एक "Flow" परत को जो टयूबिंग conne है बना हैcted.
चित्रा 2. फ्लो परत डिजाइन एक स्कॉच टेप ढालना इस परत के लिए किया जाता है. यहाँ हम दो दिशाओं विरोध के वाई के आकार में चैनलों का इस्तेमाल.
चित्रा 3. वेल्स परत कुओं छिद्रित बाहर के साथ PDMS की पतली परत एक गिलास coverslip पालन किया है. तब CONA प्रत्येक कुएं में रखा गया है और सूखे की अनुमति दी. कोशिकाओं को फिर से 10 कुओं में लोड कर रहे हैं.
चित्रा 4. एक वाई चैनल, उसकी चौड़ाई का एक विशिष्ट अंश के दो आदानों की रिश्तेदार प्रवाह की दर को नियंत्रित करने के द्वारा नियंत्रित चैनल कवरेज. मध्यम एक बनाम मध्यम बी (एक) वाम chann के साथ कवर किया जाता है एल: 0.8ml/hr (लाल) और 80% / 20% कवरेज में 0.2 मिलीग्राम / घंटा (स्पष्ट) के परिणामों में बह रही है. सही चैनल: 50% / 50% कवरेज में 0.5 मिलीग्राम / घंटा परिणामों पर दोनों मीडिया की ओर बहने वाली. (ख) 10% / 90%, 50% / 50% और 90% / 10% प्रवाह की दर के साथ डिवाइस का फोटो.
चित्रा 5. कई खमीर उपभेदों के साथ गतिशील प्रयोग (क, ख) कुओं की अच्छी तरह से छवियों पूरे (ख) या (क) टैगिंग HTB2 Mcherry बिना खमीर कोशिकाओं से युक्त, कुओं के बीच कोई सेल रिसाव दिखा. (ग, घ) = 0 टी में एक कदम नहीं ग्लूकोज कोशिकाओं के दो कुओं में उत्तर. Msn2 YFP कदम के बाद एक ही समय में नाभिक के लिए localizes, दो कुओं में एक साथ मीडिया परिवर्तन का प्रदर्शन. (ई) एकल कक्षों में परमाणु Msn2 YFP स्तरों के समय पटरियों कुओं में (ग, घ) के एक से विश्लेषण किया./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "लक्ष्य ="> _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस पत्र में हम एक microfluidic युक्ति है कि गतिशील शर्तों के तहत निम्नलिखित कई खमीर उपभेदों अनुमति देता है बनाने के लिए एक सरल benchtop विधि प्रस्तुत करते हैं. एक चैनल में कई उपभेदों के बाद कई उपभेदों के में एकल कोशिका प्रतिक्रियाओं के गतिशीलता की तुलना करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है. हमारे दृष्टिकोण का एक लाभ यह सरल तकनीक के साथ एक साफ कमरे के लिए आवश्यकता के बिना डिवाइस बनाना करने की क्षमता है. वास्तव में, हम भी प्रोटोकॉल किए गए प्लाज्मा उपचार आपरेशन (2.9 कदम और 3.6 में) लंघन और अच्छा परिणाम मिला है, इसलिए किसी भी प्लाज्मा उपकरणों के बिना प्रयोगशालाओं अभी भी प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कर सकते हैं.
अपने आप में अलग अलग उपभेदों के प्रत्येक बोने से अच्छी तरह से हम सेल डिवाइस के विधानसभा दौरान मिश्रण से बचने के लिए है, जबकि अभी भी मध्यम प्रवाह की अनुमति के प्रयोग के दौरान कोशिकाओं तक पहुँचने. इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण बिंदु नहीं दे रहा है कोशिकाओं से पहले उन्हें (3.4 कदम - 3.6) से अधिक मध्यम reflowing बाहर सूखी. Dryinछ बाहर गंभीर रूप से कोशिकाओं की व्यवहार्यता को प्रभावित करता है, जबकि बहुत माध्यम से दो PDMS परतों के बीच आसंजन समस्याओं में एक अच्छी तरह से परिणाम पर डिवाइस को बंद करने की कोशिश कर रहा है. इन बाधाओं हमें कुओं परत डिवाइस में छोड़ने के लिए, न तो इसे छील के बाद कोशिकाओं को उनके स्थान में बसे है मजबूर. कुओं परत है, इसलिए, करने के लिए पर्याप्त गहरी वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के प्रारंभिक छोटी बूंद शामिल हो गया है, लेकिन संभव के रूप में पतली है, तो कुओं का पहलू अनुपात मध्यम प्रवाह उनके नीचे तक पहुँचने के लिए अनुमति देता है और कोशिकाओं को प्रत्यक्ष प्रवाह के माध्यम से बाहरी संकेत मिलता है.
डिवाइस के रूप में हम यहाँ का वर्णन प्रति चैनल के बारे में 5 उपभेदों के लिए सीमित है. हम नियमित रूप से दो का विरोध directionalities पर आसन्न वाई चैनल (2 चित्रा) के साथ उपकरणों को बनाने. हालांकि यह कुछ अधिक चैनलों या चैनल के प्रति कुछ अधिक कुओं के लिए बढ़ाया जा सकता है, यह अभी भी वीएलएसआई शैली 7 उपकरणों के कुछ है, कि अब तक जीवित कोशिकाओं को लागू नहीं किया है के रूप में उच्च throughput के रूप में नहीं है.हम ध्यान दें, तथापि, कि जब से इस उपकरण के मुख्य उद्देश्य के लिए सटीक एक ही परिस्थितियों के लिए अलग अलग उपभेदों विषय है जबकि इमेजिंग उनकी प्रतिक्रियाओं समवर्ती इमेजिंग कि उपभेदों की संख्या से स्टेम imaged सीमाएं हैं, भले ही डिवाइस कार्यान्वयन के पर: उच्च बढ़ाई, उपभेदों के लिए क्रमिक रूप से imaged किया जा है, इसलिए अधिक उपभेदों imaged, बड़े इमेजिंग की पहली और आखिरी तनाव के बीच मतभेद रहे हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
YG आईडीबी से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है. में एक Alon साथी और एडमंड जम्मू के एक संकाय साथी है. तेल अवीव विश्वविद्यालय में बायोइनफॉरमैटिक्स लिए Safra केंद्र इस शोध ISF 1499/10 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
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