Summary
Biz temiz oda ya da yumuşak litografi gerek kalmadan, birden çok farklı suşları için benzer dinamik koşullar uygulanarak yeteneğine microfluidic cihazlar üretmek için basit bir yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Çevresel değişimlere hücre yanıtlarının çalışmada birçok deneysel zorluklar teşkil etmektedir: hücreler karşılaştırmalı bir şekilde sık sık değişen koşullar altında yansıması gerekmektedir. Multiwell plakaları rutin birçok farklı suşları veya hücre hatları karşılaştırmak için kullanılan, ancak çevre dinamikleri üzerinde sınırlı kontrole izin verir. Microfluidic cihazlar, diğer taraftan, çevreleyen koşullara üzerinde mükemmel dinamik kontrol etmek için kullanılır, fakat görüntü için zorlu ve bunları birkaç soyu daha fazla ayırt edilir. Burada kolay ve hızlı bir kanalda birden çok farklı maya suşları için dinamik olarak değişen koşullar uygulanarak yetenekli bir mikroakışkan cihaz üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır. Cihaz yumuşak litografi gerek kalmadan tasarlanmış ve basit araçlarla üretilir. Bu, mikro barındıran bir ikinci tabaka bağlı Y-şekilli bir akış kanalı oluşturmaktadır. Suşları ayrı mikro yerleştirilir ve aynı dinamik koşullar altında görüntülü. Biz demofarklı maya suşunda besin değişikliklerin darbelerinin protein yerelleştirme tepkilerini ölçmek için cihazın kullanımı nstrate.
Introduction
Hücreler sürekli olarak metabolizması, transkripsiyonel profili ve hücresel fonksiyonları değiştirerek, dinamik olarak değişen bir ortama tepki. Bu olayların incelenmesi, bu tür değişikliklerin sayısal olarak yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu tür tepkiler için okuma bir tipi, besin strese cevap olarak strese bağlı transkripsiyon faktörleri lokalizasyonu için bir değişimdir.
Mikroakışkan cihazlar 1 dinamik hücreleri 2-4 çevre koşulları işlemek için kullanılır olmuştur. Hücrelerin ortam hassas bir şekilde kontrol ve dinamik olarak değiştirilebilir; hücre harici koşullar manipülasyon sırasında dahil olmak üzere, her zaman, canlı-görüntülü olabilir, ve en az reaktif hacimleri gereklidir: Bunlar, canlı hücre görüntüleme için çeşitli avantajlar sunmaktadır. İki durum arasındaki ardalanması izin mikroakışkan cihaz için çok basit bir tasarım, bir Y-şeklindeki cihaz 2'dir. Biz rutin izin Y-şekilli mikroakışkan cihazları kullanmakKanal sistemindeki hücrelerden dinamik değişiklikler uygulanması. Biz maya hücreleri floresan etiketli strese bağlı transkripsiyon faktörlerinin lokalizasyonu değişiklikleri takip için bu cihazı kullanabilirsiniz. Biz beslenme değişen koşullarda bu değişiklikleri uygulayın. Örneğin, bir puls (veya puls dizisi) sağlayabilir glikoz-ihtiva eden çok ince bir zamansal çözünürlükte, no-glikoz orta bir süre içinde ortamı. Genellikle bu tür deneylerde, bir farklı hücre suşları (örneğin, farklı mutantlar veya farklı yabani izolatlar) tepkileri karşılaştırarak ilgileniyor. Y-şekilli kanal her bir kanalın bir suşu ile sınırlı - Birden fazla suşu kullanıldığında, suşları arasında ayırt etmek için basit bir yolu yoktur. Bunun üstesinden gelmek için, farklı kanalları da kullanılabilir. Biz birden suşlar aynı dinamikleri koşulları uygulamak istiyorsanız, biz birden fazla kanal ile Y-kanal kavramı birleştirmek istiyorum. Bu çözümü uygulamaya iki zorluklar vardır: Bu t uygulamak zor olabilironun bütün kanallar için aynı anda aynı koşullar, ve orada bir cihaz içine monte edilebilir Y-kanallarının sayısı için bir geometrik sınırlamasıdır. Bu nedenle dinamik koşullar altında bir kanal birkaç suşları görüntülemek için bir yol aradılar.
Burada aynı dinamik koşullar altında bir kanal görüntüleme Birden fazla suşu için tasarlanmış bir iki katmanlı mikroakışkan cihaz tarif. Alt tabaka delikli bir sıra ile ince PDMS oluşur. Bu tabaka, cam lamel bu cam, Concanavalin A ile yapıştırma, farklı suşları yer hangi kuyu içine oluşturmak için eklenir. İkinci katman seloteyp kullanılarak oluşturulan yöntem 5 Y-şekilli bir Mikroakışkan cihazdır. Kuyularda suşların yerleştirdikten sonra ikinci kat hızlı hizalanır ve farklı suşlar içeren birkaç kuyuları ile bir kanal oluşturarak, ilk bağlı. Bu, nihai cihaz burada her bir kanal içinde çeşitli suşları aşağıdaki sağlarsuşlar aynı anda aynı şartlarına tabi tutulur. Tüm tasarım ve üretim sürecinin hiçbir yumuşak litografi, basit araçları kullanarak, benchtop yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Scotch-bant Master 5 Oluşturma
- Beraberlik veya kağıt üzerinde istenilen mikrokanal düzeni, ölçeklendirme, yazdırabilirsiniz. Bizim durumumuzda tasarımı iki Y-şekilli kanal, her bir meydana 3 mm genişliğinde (Şekil 2).
- Séloteyip katmanları ile cam slayt örtün. Katman sayısı, kanal (kat başına yaklaşık 60 um) yüksekliğini belirler. Biz 3 séloteyip katmanları kullanılır.
- Düz bir yüzeye düzeni tasarım yerleştirin. Tasarım deseni üzerinde slayt hizalayın. Dikkatle düzenine göre bir neşter ile cam slayt üzerine bandı kesti.
- Mikrokanalın düzeni dışındaki cam slayt tüm bölgelerinden seloteyp çıkarın.
- 2-3 dk için 65 ° C sıcaklıkta bir ısıtma fırını içinde kayar yerleştirin. Etanol ile nazikçe temizleyin.
2. Bir PDMS mikroakışkan Cihaz Fabricating
- Üretici tarafından tavsiye edilen şekilde PDMS taban ve tedavi edici bileşenler karıştırılır. Biz 10:1 kullanınsertleştirici baz oranı. ~ 0.5 cm yüksekliğinde bir Petri kabı içine PDMS karışımı yaklaşık 30 ml dökün. Vakum Degas PDMS gerekirse. Yukarı bakacak desenli bant ile PDMS daldırın cam slayt. PDMS sonra desen yerleştirme slayt ve çanak alt arasındaki hava kabarcıklarının oluşmasını engeller. Yemek bir su terazisi kullanarak yatay olduğundan emin olarak, 65 ° C'de 48 saat süreyle Cure.
- Yeni bir 90 mm Petri kabı PDMS karışımı, 3 ml derin 0.5 mm bir tabaka ile sonuçlanan, dökün. (A spin lak mevcut ise, bu aşama için kullanılabilir).
- Degas ve 2.1 gibi tedavi.
- Hafifçe bir neşter ile istenilen boyutta mikroakışkan cihaz kesip. Bu katman "akış tabaka" terimi olacaktır.
- İkinci Petri çanak ince tabaka PDMS aynı boyutlu bir parça kesin. Bu işlem, "kuyu tabaka" terimi olacaktır.
- Akış katmanda giriş ve çıkışları için delikler için uygun boyutta bir biyopsi puncher (Biz 1.2 mm ID kullanınız). Düzeni üzerinde mikrokanallar ile uyum içinde 2 mm ID biyopsi zımba kullanılarak kuyuları dışında tasarım düzen ve yumruk üzerinde kalın bir cam slayt üzerinde kuyular katmanı yerleştirin.
- Her iki PDMS katmanlar hem de etanol ile birlikte, 24 mm x 60 mm ebadındaki bir cam lamel temizleyin. Hava kuru ve temiz tutun.
- Plazma tersinir yapıştırma için ya standart plazma yakıcısı (tersinir olmayan yapıştırma için) veya bir el corona işlemcinize 6 kullanarak cam lamel ve kuyular katmanı PDMS hem tedavi. Dikkatlice (Şekil 3) yapışma neden lamel üstüne kuyular katmanı yerleştirin. Yavaşça herhangi bir hava kabarcığı (gerekirse) dışarı sürün.
3. Hücre Görüntüleme Deneyi
- Eğer şırınga pompası 0.02 iç çapı "(Tygon) ile esnek plastik borular bağlı uygun şırınga hazır İstenen ortam olduğundan emin olun.
- S. büyütün YPD sıvı halinde arzu edilen faz için cerevisiae suşları. Iyice vorteksleyin ve yerde 300 μBir mikrosantrifüj tüpüne her bir suş l.
- Yavaşça Concanavalin A (Sigma) her oyuğuna 2 mg / ml 'lik 1 ul koyun. Yavaşça su pipetleme bir her iyi iki kez gelen aşırı Concanavalin yıkayın.
- Concanavalin A kurutma iken, glukoz eksik SC orta 300 ul ile iki kez suşlar yıkayın. Hücre duvarlarından kalan glukoz Çamaşır Concanavalin A. uygun bağlılık olur
- Iyice Vortex hücreler. Pipet 0.75 ul ya da kendi başına da (Şekil 3) her bir hücre süspansiyonu daha az. Yavaşça zengin orta rezidüel hücreleri yıkayın. Sonraki iki adım kurumasını önlemek hücreleri için hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gereklidir.
- Plazma çip tedavi ve kuyuların iyice doğrudan kuyu vurmak için dikkatli olmak, el korona işlemcinize kullanarak. Ikisi arasındaki uyumu yakından ilgilenerek, kuyular üzerinde çip dikkatlice yerleştirin (Bu adım stereoskop altında yapılabilir). Yavaşça PD iki kat uymak için basınMS. Yavaş yavaş hava kabarcığı kanal içinde kalır emin, yaklaşık 50 ul zengin bir ortam ile tamamen cihazı doldurun.
- , Aygıtı bağlayın uygun girişleri içine tüpler ekleme ve medya akışını başlatmak. Bu kaldırmak için zor olabilir gibi hiçbir hava kabarcığı cihazın içine tanıtıldı dikkat edin, bu bir giriş veya çıkış kesme gerçekleştirilir ve yavaşça cam lamel kırmak için dikkatli olmak, kabarcıkları olan cihaza dokunarak olabilir.
- Mikroskop altında yerleştirin ve her kuyuya uygun görüntüleme noktalarını bulabilirsiniz.
- Gerekirse kurtarma izin vermek için 1 saat veya daha uzun süre zengin orta akış altında hücreler tutun.
- Denemeyi başlat: biz istediğiniz gibi göreceli akış oranları değişiyor, medyanın geri akışı önlemek için iki şırınga pompaları her birinden sürekli akış kullanın. Orta bir kanal genişliği (Şekil 4)% 80 üzerinde akan bir 0.8 ml / saat ve pompa B ile 0.2 ml / saat sonuçlar pompa ayarlanması. Bu dinamik c olabilirİki akış oranları değiştirerek astı. Yeni koşullar kanal 2 tam uzunluğu boyunca saniye içinde stabilize eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklı suşlar arasındaki mesafeyi göstermek için biz alternatif kuyularda iki ayırt maya suşları görüntülendi. Görüntüleme tam kuyu kuyu (Şekil 5a, b) arasında bir hücre kaçağı gösterir. Her iki suş YFP ile etiketlendi transkripsiyon faktörü MSN2 var. Dinamik koşullar arasında değişen eşzamanlı etkisini test etmek için, çekirdeğin (Şekil 5c, d) MSN2-YFP lokalizasyonu ile sonuçlanmıştır no-glikoz, orta bir adım oluşturarak, iki giriş kanalı içinde, akış hızı değiştirmiş. Bütün kuyucuklara ölçülen yanıt cihaz birden kuyulara eşzamanlı dinamik koşullar uygulama için kullanılabilir gösteren, aynı zamanda olmuştur.
Şekil 1. Cihaz tasarım. Cihazı lamel, ince bir "Wells" katmanı ve boru Conne olduğu bir "Akış" katmanı oluşurcted.
Şekil 2. Akış katman tasarımı. Viski-bant kalıp bu katman için yapılır. Burada tarifi karşıt iki Y-şekilli kanalı kullanılmaktadır.
Şekil 3,. Wells katmanı. Kuyu delinmiş-çıkışı ile PDMS ince tabaka bir cam lamel yapıştırılır. Daha sonra her oyuğa ConA yerleştirilir ve kurumaya bırakılır. Hücreler daha sonra 10 kuyu ile yüklenir.
Şekil 4. Kontrollü kanal kapsama. Bir Y kanal genişliği belirli bir fraksiyonun iki girişi arasında nispi akış oranları kontrol edilerek orta bir vs orta B. (a) sol chann ile kaplı El: 0.8ml/hr (kırmızı) ve% 80 /% 20 kapsama 0.2 ml / saat (net) sonuçlarına akıyor. Sağ kanal:% 50 /% 50 kapsama 0.5 ml / saat sonuçları hem medya Akan. (B)% 10 /% 90,% 50 /% 50 ve% 90 /% 10 debilerde cihazın fotoğrafları.
Şekil 5,. Birden maya suşları ile dinamik deney. (B) veya (a) HTB2-mCherry etiketleme olmadan ile maya hücreleri içeren kuyuların (a, b) Tüm-iyi görüntü, kuyular arasında hiçbir hücre sızıntı gösteren. T = 0 anında bir no-glukoz adıma iki kuyu hücrelerin (c, d) Tepki. MSN2-YFP iki kuyu eşzamanlı ortam değişikliği gösteren aşamasını takiben aynı zamanda çekirdek için sınırlanmasına neden olur. (E) tek bir hücre nükleer MSN2-YFP düzeylerinin zamana parça olarak kuyulara (c, d) bir ikinci analiz edildi./ Ftp_upload/4257/4257fig5large.jpg "target =" _blank "> büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yazıda dinamik koşullar altında aşağıdaki birkaç maya suşları eş zamanlı sağlayan bir mikroakışkan cihaz oluşturmak için basit benchtop yöntemi sunuyoruz. Bir kanal birkaç suşları takiben birden suşları tek hücre yanıtlarının dinamikleri karşılaştırmak için güvenilir bir araç sağlar. Bu çalışmanın yaklaşımının bir avantajı, bir temiz oda için ihtiyaç olmadan basit tekniklerle cihaz imal etme kabiliyetidir. Aslında, biz de plazma işlemler (adım 2.9 ve 3.6) atlanıyor protokolü yapılmış ve iyi sonuçlar aldım, bu yüzden herhangi bir plazma ekipman olmadan laboratuarları hala protokolü gerçekleştirebilirsiniz var.
Yine deney esnasında hücre ulaşmak için orta akış izin verirken, kendi içinde farklı soylarının her bir tohumlama ile de biz, aygıtın montaj sırasında karıştırma hücre kaçının. Bu protokol bir kritik nokta hücreleri bunları (- 3.6 Adım 3.4) üzerinde orta akıtmadan önce kurumasına izin vermiyor. Kurutma dolaPDMS iki tabaka arasında yapışma sorunların her iyi sonuçlar çok fazla orta cihazı kapatmak çalışırken g dışında ciddi bir şekilde, hücrelerin canlılığı etkiler. Bu kısıtlamalar hücreler kendi yerinde yerleşmiş sonra bize soyma ziyade, cihazda kuyuları tabakasını terk etmeye zorlamak. Kuyular tabakası, bu nedenle, seribaşı hücrelerin başlangıç damlacık içerecek kadar derin olması gerekir, ama mümkün olduğunca ince, bu nedenle kuyuların boy oranı kendi alt ulaşmak için orta akış sağlar ve hücreleri doğrudan akış yoluyla harici sinyaller alıyorum.
Burada açıklandığı gibi cihaz kanal başına yaklaşık 5 suşları ile sınırlıdır. Biz rutin karşıt directionalities az iki bitişik Y kanalları (Şekil 2) sahip cihazlar oluşturun. Bu bir kaç daha fazla kanal ya da kanal başına birkaç kuyu daha uzatılabilir olsa da, bugüne kadar canlı hücreler uygulanan edilmemiş olması VLSI tarzı cihazlar 7 bazıları gibi yüksek throughput halen değildir.Biz ne olursa olsun cihazın uygulanması, bu cihazın ana amacı aynı koşullarda farklı suşları tabi olmaktır yana görüntüleme verdikleri yanıtlar ise, sınırlamalar suşların sayıda kök görüntülü eşzamanlı görüntüleme için orada olduğunu, ancak dikkat: at yüksek büyütme, suşları bu nedenle daha fazla suşları daha büyük bir ilk ve son gerilim arasında görüntüleme zamanı farklar vardır, görüntülenmiştir, sıralı olarak görüntülenmek üzere gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
YG İDB bir burs tarafından desteklenmektedir. IN Alon dost ve Edmond J bir öğretim görevlisidir. Tel Aviv Üniversitesi Biyoenformatik Safra Merkezi . Bu araştırma ISF hibe 1499-1410 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ||
| Vacuum desiccator | Nalgene | 5310-0250 | |
| Biopsy punchers | Ted Pella Inc. | Harris Uni-Core 15076 (2 mm), 15074 (1.2 mm) | |
| Syringe pumps | Chemyx | Fusion 200 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20 | |
| Tygon tubing | Tygon | S-54-HL | |
| Concanavalin-A | Sigma | C7275 | |
| Scotch tape | 3M Scotch | Transparent Tape 1/2" |
References
- Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).
- Paliwal, S. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446, 46-51 (2007).
- Bennett, M. R., Hasty, J. Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells. Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters. Chips & Tips. , (2010).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).
