Modeller för benmetastaser

Summary

Djurmodeller ofta utnyttjas för att studera cancermetastas till ben. I detta protokoll kommer vi att beskriva två vanligaste metoderna för tumörympning för skelettmetastaser studier och kortfattat beskriva några av de analyser som används för att övervaka och kvantifiera dessa modeller.

Abstract

Benmetastaser är en vanlig företeelse i många maligniteter, inklusive bröst, prostata och lunga. När etablerade i ben, tumörer svarar för betydande morbiditet och mortalitet ^1. Det finns således ett stort behov av att förstå de molekylära mekanismer som styr anläggningen, tillväxt och aktivitet av tumörer i ben. Flera in vivo-modeller har inrättats för att studera dessa händelser och alla har specifika fördelar och begränsningar. Den vanligast använda modellen utnyttjar intrakardiell inokulering av tumörceller direkt i den arteriella blodtillförseln av atymiska (nakna) möss BalbC. Detta förfarande kan tillämpas på många olika tumörtyper (inklusive PC-3 prostatacancer, lungcancer och mus juverfett tumörer pad), men i detta manuskript vi kommer att fokusera på bröstcancer modellen, MDA-MB-231. I denna modell använder vi en mycket ben selektiv klon, ursprungligen härstammar i Dr Mundy grupp i San Antonio ^2, att Hsom sedan dess transfekterats för GFP uttryck och åter klonats av vår grupp ^3. Denna klon är en ben metastatisk variant med en hög osteotropism och mycket lite metastas till lungan, levern, eller binjurarna. Medan intrakardiella injektioner används oftast för studier av skelettmetastaser ^2, i vissa fall intratibial ⁴ eller bröst fettkudden injektioner är mer lämpligt. Intrakardiella injektioner utförs typiskt när humana tumörceller med målet att övervaka senare stadier av metastaser, speciellt förmågan hos cancerceller att gripa i ben, överleva, föröka sig och upprätta tumörer som utvecklas till cancer-inducerad bensjukdom. Intratibial injektioner utförs om att fokusera på förhållandet mellan cancerceller och ben efter en tumör har spridit sig till ben, som korrelerar ungefär till etablerade benmetastaser. Ingen av dessa modeller rekapitulerar tidiga steg i metastatiska processen innan emboli och inträdeav tumörceller in i cirkulationen. Om övervakning primär tumörtillväxt eller metastaser från den primära platsen för ben, sedan juverfett pad vaccinationer är oftast föredras, men kommer mycket få tumörcellinjer konsekvent metastasera till ben från den primära platsen med 4T1 ben företrädesrätt kloner, en mus bröst karcinom, som undantag ^5,6.

Detta manuskript detaljer ympning förfaranden och höjdpunkter steg nyckel i analyser efter inokulering. Specifikt omfattar den cellodling, tumörcellinjer förfaranden inokulering för intrakardiell och intratibial vaccinationer samt kort information om varje vecka övervakning av röntgen, fluorescens och histomorfometriska analyser.

Protocol

1. Cell Underhåll

1. Många ben metastatiska subkloner av MDA-MB-231 finns som har varierande benägenhet för ben kolonisation och tillväxt. För våra experiment använder vi en klon härledd från GFP-märkta MDA-MB-231 utvecklats vid UTHSCA ^2. Denna speciella subklon bildar synliga osteolytiska benlesioner vid ca 3 veckor efter inokulering, med offer vid 4 veckor.
2. Upprätthålla celler i DMEM innehållande 10% FBS och 0,1 mg / ml penicillin-streptomycin vid 37 ° C i 5-8% CO ₂ ^7.
3. Passage celler vid 80-90% konfluens och re-plattan vid en 1:10 spädning (detta varierar beroende på celltyp och storlek plattan. För MDA-MB-231-celler i en T-75 är ungefär 6x10 ^5), som är ungefär var 72 timme.
4. MDA-MB-231-celler att upprätthålla en allmänt fibroblastisk utseende med många pseudopodia. Varje avrundning indikerar trängsel eller andra oönskade stress och bör undvikas eftersom dettakan påverka metastatisk potential in vivo.
5. Helst bör celler hållas i kultur endast kort före inokulering (vi rekommenderar mindre än 1 vecka eller tills du har tillräckligt många celler för experimentet), och en ny injektionsflaska ska tinas om avrundning eller förändringar i cellens tillväxt ske.

2. Cellberedning

1. Trypsinisera celler vid 80-90% konfluens med 0,15% trypsin / EDTA (späd 0,5% Gibco Trypsin EDTA 1:2 i PBS). Denna koncentration möjliggör snabb lösgöring (<2 min) och minskar klumpning av cellerna.
2. Omedelbart ta bort celler från plattan med 10 ml iskall DMEM innehållande 10% FBS, pipett i 15 ml koniskt rör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
3. Återsuspendera pelleten i en 50 ml koniskt rör i 25 ml iskall PBS (utan Ca och Mg) och räkna.
4. Centrifugera på nytt pelleten, och återsuspendera vid 10 ⁶ celler per ml (intrakardiella) eller vid 250.000 celler/10 pl (intratibial) i iskall PBS. Temperaning av PBS är viktigt att förebygga klumpning av celler och efterföljande emboli efter injektion. Cellsuspensionen bör förbli på is när de utför injektioner och kommer att vara livskraftig och förbli un-hopklumpade i 30 min. Även om den exakta antalet nödvändiga plattor kommer att variera från utredare till utredare använder vi vanligtvis 1 T-75 för mellan 8-10 möss.

3. Intrakardiell Inokulering

1. 4-6 veckor gamla honråttor (Foxn Nu-/ -: Harlan) möss användes för dessa experiment, även om andra immun-komprometterade möss (RAG1-/ -, RAG2-/ -, SCID, XID, och etc.) kan också vara används med mänskliga experiment cancercell.
2. De nakna möss bör utfodras Teklad 2920x kost 5-10 dagar före injektion för att minska dödligheten i injektionsproceduren och minska bakgrundsfluorescens i avbildningsförfaranden (eftersom maten är alfalfa gratis).
3. Om du använder möss än nu / nu, ta bort hår genom rakning eller använda Nair (i vår erfarenhet Nair fungerar bättre) på ventrala buken area innan proceduren.
4. Söva mus i en isoleringskammare med en isofluran förångaren (2,5% Iso: 2-3 l / min O ₂₎ eller andra föredragna anestesi (i vår erfarenhet isofluran är bäst tolereras för intrakardiella ympningar).
5. Flytta en mus i taget till noskonen på anestesiapparaten i en rostfri ventilerad stål huva.
6. Placera varje mus på rygg med bröstet uppåt.
7. Tvätta bröstet med en 10% povidon / jod tops / lösning följt av 70% etanol, upprepa 2 gånger.
8. Mark mus bröst för injektion (med en steril markör eller märkning lite åt sidan för att hålla injektionsstället steril). Vi använder en halvvägs märke läge mellan sternala skåran och toppen av xyphoid process och något vänster (anatomisk) av bröstbenet. Rita en liten luftbubbla i sprutan för att skapa utrymme mellan kolven och menisken (viktigt för att se hjärtpulsgenerator) av en 300 | il 28 g ½ insulinspruta, ochupprätta 100 pl celler.
9. Håll nålen upprätt. Håll hud av mus spänd med andra handen in nålen.
10. Framgångsrik insättning i hjärtats vänstra kammare bör resultera i en tydlig klarröd puls av blod i sprutan. Vid detta djup, noggrant trycka kolv av sprutan (100 ul volym), utan betydande rörelse av nålen för att undvika punktering av hjärtat eller spiller celler in i brösthålan.
11. Efter det att cellerna injiceras, dra upp något på kolven för att skapa en liten mängd negativt tryck för att minska droppning av celler in i brösthålan.
12. Dra nålen direkt ur bröstet samtidigt som du undvika att luta nålen under avlägsnande, vilket kan riva slemhinnan i hjärtat och orsaka blödning.
13. Tryck lätt till bröstet över injektionsstället för att minska blödning.
14. Avlägsna mus från noskonen och fortsätta att tillämpa lätt tryck under ca 1 minut.
15. Flytta musen för att värmedyna tills den är helt konveten.
16. Om musen börjar snurra eller rycka efter återhämtning, är den troliga orsaken en blodpropp. Injicera musen intraperitonealt med 80-120 mg / kg ketamin att öka blodflödet och hjärtminutvolym och samtidigt minska vaskulär resistans. Detta bör hjälpa musen passera proppen. Efter detta sker, är det bäst att byta cellberedningar, eftersom det indikerar att cellerna klumpar. Vi byter cellpreparat efter ca 8 möss, eller 30 minuter.

4. Intratibial

1. Injicera mus med Buprenex (0,1 mg / kg) eller liknande godkänd analgetikum omedelbart före proceduren.
2. Söva musen med isofluran, sedan flytta till noskonen och bibehålla anestesi.
3. Rengör båda benen med 10% povidon / jod kompress / lösning, följt av etanol, upprepa 2 gånger. Vaxning varar ben (med Nair eller liknande produkt) innan rengöring om päls närvarande.
4. Försiktigt tag laterala fotknölen, mediala malleolen och nedre halvan av skenbenet med pekfingret och thUMB, sedan böja benet (en kombination av böjning och lateral rotation, så att knäet är synlig och tillgänglig.
5. Blöt huden med 70% EtOH för att öka synligheten för underliggande patellar ligament, som bör vara synlig som en distinkt, tjock, vit linje. Medan ordentligt tag fotled / ben av mus insats 28g ½ nål i patella, genom mitten av patellar ligament och in i den främre interkondylära området toppen av skenbenet.
6. När du sätter nålen i skenbenet, noggrant genom tillväxt plattan med stadig, fast tryck med lätt borrning åtgärder.
7. Vid penetration av tibiala tillväxtplattan, kommer nålen möter markant mindre motstånd.
8. Använd en mild, sidoförflyttning av nålen för att säkerställa nålen är i tibia och genom tillväxt plattan. Rörelse kommer att begränsas om nålen är i rätt plats i skenbenet.
9. Tryck långsamt kolven för att injicera 10 pl cellösning. Liten eller ingen motstånd bör kännas vid denna punkt.
10. Slowly extrahera nål.
11. Genom att följa samma förfarande, vidare till nästa etapp för att injicera 10 | il PBS.
12. Ta musen från anestesi och hålla på värmedyna tills återvinnas.
13. Övervaka mössen under de kommande 24 timmar och injicera ytterligare Buprenex var 12 timmar om djuren fortsätter att visa tecken på stress.

5. Imaging Tidsförlopp

1. Luciferas Imaging: I förekommande fall, luciferas avbildning bör utnyttjas med början vid 7 dagar efter tumörcell ympning (även i de flesta skelettmetastaser modeller detekterbar närmare dag 14). Mus injiceras intraperitonealt med 150 mg / kg luciferin, bedövades, och avbildas 8 min efter injektion med användning IVIS utrustning ^8.
2. GFP avbildning: Normalt GFP-uttryckande tumörer börjar kunna detekteras runt dag 10-14 för intratibial injektioner och 16-21 för intrakardiella experiment med Maestro bildutrustning (CRI) ^9. Kortfattat, möss bedövades med isofluran (3%) Och hölls under anestesi genom en noskon i Maestro avbildning kammaren. För våra EGFP-uttryckande celler använder vi det blå filtret set (498 excitation/515 emission för EGFP) vid 500 ms exponering i 10 nm steg.
3. Faxitron (röntgen): röntgenstrålar tas veckovis börjar mellan dag 7 till 14. Lesioner kommer att synas i den intrakardiella modellen på dag 21 och en vecka tidigare i intratibial injektioner ^3. Vår radiografiska data för ex vivo och in vivo förvärvades med en Faxitron LX-60 vid 35 kV för 8 sekunder av exponering.
4. Andra Imaging: avbildningsmetoder kommer helt baserat på specifik forskning. Utöver ovanstående metoder, kan levande djur avbildning baserad på 3D mikro-datortomografi (μCT), mikro-positronemissionstomografi (μPET) och andra metoder ^10,11 ge värdefull information.

6. Mus Sacrifice

1. Varje modell har en något annorlunda tidsförlopp. Med MDA-MB-231 celler möss blir oftast kakektiska eller förlamad mellan 21 och 35 dagar och vanligtvis runt dag 28 (IT injicerade möss mellan 21-28 dagar).
2. När flera möss utvecklar lesioner som börjar bryta igenom det kortikala benet, blir förlamad, eller förlora mellan 10-20% av kroppsvikten, offra alla möss i studien med hjälp av ketamin / xylazin överdosering med halsdislokation (eller annan IACUC godkänd metod).
3. Ta ben behövs för vidare studier och förvara i buffrad 4% formalin.
4. Möss med bröstet tumörer är ett tecken på en missad injektion och bör undantas från studien.

7. Ex vivo analys

1. μCT: scanning i 70% EtOH möjliggör strukturella och histologiska parametrar som skall mätas på samma ben prov.
2. Kontur och analysera efter individuell experimentell design och tillgänglig utrustning ^10. Våra data erhölls med en Scanco μCT 40 med användning av 12 pM upplösning.
3. Histomorphometry: Process prover med föredragna histologiska metoder och fläckar med hematoxylin / eosin ⁷

8. Representativa resultat

Efter intrakardiala eller intratibial inokulering av tumörceller (Figur 1) möss övervakas varje vecka med radiografi och fluorescens (eller luminescens). Lesioner bli normalt uppenbara genom röntgen mellan vecka 2 och 3, medan de kan vara synliga genom fluorescens och luminiscens så tidigt som vecka 2, beroende på modell (figur 2). Lesioner är synliga som mörka hål i benet, och blir mer uttalad med tiden (figur 3). Lesioner kvantifieras med hjälp Metamorph analys av röntgenbilder och fluorescens kvantifierades med Maestro (CRI) avbildning och analys programvara. Som lesioner börjar växa, möss blir ofta kakektiska. Offer krävs när mössen har förlorat mellan 10-20% av sin ursprungliga kroppsvikt. Tillståndet hos möss kan förändras snabbt och måste övervakas flera gånger under dagen. Mellan 3-4 veckor möss började dra en eller båda bakbenen och hela studien offrades. Bilder togs före offra. Efter anestesi överdosering, uppsamlades blod för att mäta markörer för benomsättning eller andra faktorer. Efter halsdislokation var huden bort från musen och utskurna ben och rengöras för ex vivo imaging (Figur 3) som kommer att möjliggöra visualisering av tumörfokus minst 7 dagar tidigare än in vivo avbildningstekniker. När avbildning slutfördes ben placerades i märkta kassetter och lagras i formalin för fixering och ytterligare histologisk bearbetning eller μCT analys. Histomorfometri utfördes på proverna för att ange tumörbördan och BV / TV efter μCT utfördes på en tibia för att kvantifiera mängden benförstöring (Figur 4).

/ 4260/4260fig1.jpg "/>
Figur 1. Korrekt placering av injektion. Ventrala radiographical (A) i vuxen mus thorax visar korrekt placering av nålen i ^{4: e} interkostalrummet och in i vänster kammare för intrakardiell ympning. Anatomiska landmärken visas med horisontella streckade linjer på bröstbenet (beskrivs i vitt). På musens hud sternala skåran och xyphoid processen fungerar som landmärken, och nålen sätts in något kvar av bröstbenet. Ventral radiographical view (B) av vuxna möss ben visar korrekt placering av nålen i proximala tibia, linje mellan kondylerna. Från en lateral perspektiv spets nålen placerats bakom den tibiala tuberositas och djup till epifys plattan. Perfekt läge för injektion visas genom vit cirkel.

Figur 2. Tidsförlopp för skelettmetastaser modeller. Progression av cancer-inducerad bensjukdom visas med röntgen och GFP + fluorescerande bilder av tumörer in vivo från intratibial injektioner (A) och intrakardiell injektioner (B).

Figur 3. Tidsförlopp för intrakardiell MDA-MB-231-modellen Övre raden:. Ex vivo-bild som visar GFP-fluorescens vid dag 0, 14, 21, och 28 efter intrakardiell injektion av MDA-MB-231. Observera att tumörfokus dag 14 syns bara i ex vivo efter mjuk vävnad. Nedre raden: Ex vivo radiografiska bilder av samma lårbenen illustrerar osteolytiska benlesioner. Observera att benförstöring är vanligtvis inte syns förrän 3 veckor efter hjärt injektion.

Figur 4. Kvantifiering av ben metastatisk utveckling. GFP + tumör som visualiseras genom Maestro avbildning ex vivo av Tibiae ett icke-tumörbärande mus (A) och en mus 4 veckor efter intrakardiell injektion av en GFP-uttryckande MDA-MB-231 subklon (B). Tumörfokus korrelerar med områden av benförstöring såsom visas av Faxitron (D) jämfördes ett ben utan tumör (C). Bone strukturella och mineral data från microCT mätningar återges som 3D-bilder av en frisk ben (E) och en tumörbärande ben (F) när det gäller områden bendestruktion visas som tomrum område. Ytterligare ben och tumör detaljer syns i motsvarande H & E färgade histologiska sektioner (G & H).

Discussion

Studier av tumörinducerad bensjukdom bygga på flera djurmodeller av vilka två vanligaste är intrakardiell och intratibial vaccinationer. I många fall intrakardiella är det bästa alternativet för att studera metastaser till ben, men det inte representerar hela metastatisk processen och därför juverfett pad eller andra ortotop injektioner bör helst användas mot detta syfte. Tumörceller inte metastaser inte lätt från den primära platsen i de flesta studier med humana celler, och i så fall de primärt metastasera till lungorna. Vissa stammar av 4T1 cellerna metastasera till ben ^5,6, men skadorna är mindre, svårare att kvantifiera, och cellerna är murina snarare än mänskliga. Dessutom kan GFP-uttryck framkalla ett immunsvar i immunkompetenta modeller där 4T1 kloner används ofta som kan komplicera långvariga metastas studier ^12. Andra modeller av tumör-inducerad bensjukdom, som myelom, använda svansvenen injections ^13. Dock kommer detta tillvägagångssätt fungerar inte för fasta tumörmetastaser studier eftersom det kommer överväldigande frö tumörerna till lungorna, vilket gör att mössen att dö av lungsjukdom innan utveckla skelettmetastaser. Intratibial injektioner i allmänhet ses sämre än de andra metoderna, eftersom den inte utgör en modell för metastaser, utan snarare utvecklingen av etablerade metastatisk bensjukdom, och kan orsaka inflammation vid injektionsstället. Ändå är detta förfarande användbart för att separera de första metastaserande steg och etablering av de direkta effekterna på slutstadiet cancer-inducerad bensjukdom. Dessutom, i fallet med många modeller prostatatumörceller, är det den enda metod som ger en konsekvent tumörtillväxt i ben ^4.

Valet av tekniker för övervakning skelettsjukdom är så kritisk och specifika för studien som vägen för ympning. I vår grupp vi använder många olika tekniker beroende på studien, than vanligaste av dessa är röntgen, fluorescens och histologi. Även om många grupper har övergått till luciferas avbildning, har vi funnit att vi får färre skelettmetastaser med luciferas-transfekterade celler och att vi får bättre anatomiska detaljer med fluorescerande avbildning och lättare samlokalisering med röntgen. Dessutom har direkt jämförelse mellan formerna ger inte en signifikant fördel för luciferas avbildning för tidig upptäckt i ben. Dock kommer varje grupp utför dessa experiment måste utvärdera nyttan av varje strategi för sina studier.

Dessutom, även om används i många andra modeller, de detaljerade ex vivo analystekniker är specifika för ben. Vi analyserar ofta benförlust genom μCT. Medan genomfördes på liknande sätt studier som analyserar normalt ben är analysen av tumör-bärande ben kompliceras av de täta förlust eller avbrott i tillväxten plattan som en markör. Histologiska analyser också något nyanserade i tumörenBärande ben jämfört med protokoll som utvecklats för icke-tumörbärande ben och mjukdelar. I detta protokoll har vi begränsat beskrivningen av ex vivo analyser för att hålla fokus på de vanligaste som används av vår grupp. Som med in vivo analyser kommer varje grupp att behöva bestämma vad metoder som fungerar bäst för deras studier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MDA-MB-231 human breast cancer cells	Originally ATCC-Internally cloned and selected
DMEM	GIBCO	11885
PBS	Mediatech Inc	21-040-CV
FBS	Atlas Biological	F-0050a
Trypsin	GIBCO	15400
Faxitron	Faxitron
Maestro	CRi
μCT scanner	Scanco
Athymic Nude Mice	Harlan	Fox nu -/-
Insulin Syringes (300 μl, 28.5 g)	Becton Dickinson	309300
IVIS	Caliper
Irradiated Rodent Diet	Teklad	2920x