Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l'aide d'électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Summary

Les mesures de KV7 (KCNQ) l'activité des canaux potassium dans les myocytes isolés des artères (l'utilisation du patch clamp techniques électrophysiologiques) en parallèle avec des mesures de constricteurs / dilatateur réponses (en utilisant myographie pression) peut révéler des informations importantes sur le rôle des canaux KV7 dans la physiologie du muscle lisse vasculaire et pharmacologie.

Abstract

Contraction ou la relaxation des cellules musculaires lisses dans les parois des artères de résistance détermine le diamètre et commande ainsi l'artère écoulement de sang à travers le vaisseau et contribue à la pression artérielle systémique. Le processus de contraction est régulée par la concentration en calcium cytosolique ([Ca ^{2 +]} _cyt), qui est à son tour commandé par une série de transporteurs d'ions et des canaux. Les canaux ioniques sont des intermédiaires communs dans les voies de transduction du signal activées par les hormones vasoactives pour effectuer une vasoconstriction ou une vasodilatation. Et des canaux ioniques sont souvent pris pour cible par des agents thérapeutiques soit intentionnellement (par exemple inhibiteurs calciques utilisés pour induire une vasodilatation et hypotension) ou non (par exemple, pour induire des effets secondaires indésirables cardio-vasculaires).

KV7 (KCNQ) canaux potassiques voltage-activés ont récemment été identifié comme targ physiologique et thérapeutique importanteets de régulation de la contraction du muscle lisse. Pour élucider les rôles spécifiques des KV7 canaux à la fois dans la transduction du signal physiologique et dans les actions des agents thérapeutiques, nous devons étudier la façon dont leur activité est modulée au niveau cellulaire ainsi que d'évaluer leur contribution dans le cadre de l'artère intacte.

Les artères mésentériques de rats constituent un système modèle utile. Les artères peuvent être facilement disséquées, débarassés des tissus conjonctifs, et utilisé pour préparer des myocytes artériels isolés pour patch clamp électrophysiologie, ou une canule et mis sous pression pour les mesures de vasoconstricteurs / réponses vasodilatateur dans des conditions relativement physiologiques. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour les deux types de mesures et de donner quelques exemples de la façon dont la conception expérimentale peut être intégré à fournir une meilleure compréhension des rôles de ces canaux ioniques dans la régulation du tonus vasculaire.

Protocol

1. L'excision chirurgicale de la petite arcade mésentérique intestinale vasculaire Anesthésier un 300-400 g rat Sprague-Dawley avec de l'isoflurane (4%), administré par inhalation. Effectuer une laparotomie médiane pour exposer le mésentère de l'intestin grêle. Extérioriser l'intestin grêle et du gros par l'incision abdominale avec le plus grand soin pour éviter de traumatiser l'intestin et du mésentère exposé. Doucement attiser le mésentère au-dessus de gaze …

Discussion

Les méthodes et approches expérimentales décrites ici sont très robustes et peuvent produire des résultats clairs et reproductibles lorsqu'ils sont appliqués avec une attention méticuleuse aux détails. De bons enregistrements électrophysiologiques et la constriction / dilatation des segments artériels sont tributaires de la santé des cellules et des segments d'artère, respectivement. Préparations de cellules peut varier de jour en jour, même en utilisant le même protocole. Solutions d'isolatio…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
			*11
			Table 1. Components of solutions used in the experiment.