Summary

Explorer muscle lisse artériel KV7 fonction des canaux potassiques à l'aide d'électrophysiologie patch-clamp et myographie pression

Published: September 14, 2012
doi:

Summary

Les mesures de KV7 (KCNQ) l'activité des canaux potassium dans les myocytes isolés des artères (l'utilisation du patch clamp techniques électrophysiologiques) en parallèle avec des mesures de constricteurs / dilatateur réponses (en utilisant myographie pression) peut révéler des informations importantes sur le rôle des canaux KV7 dans la physiologie du muscle lisse vasculaire et pharmacologie.

Abstract

Contraction ou la relaxation des cellules musculaires lisses dans les parois des artères de résistance détermine le diamètre et commande ainsi l'artère écoulement de sang à travers le vaisseau et contribue à la pression artérielle systémique. Le processus de contraction est régulée par la concentration en calcium cytosolique ([Ca 2 +] cyt), qui est à son tour commandé par une série de transporteurs d'ions et des canaux. Les canaux ioniques sont des intermédiaires communs dans les voies de transduction du signal activées par les hormones vasoactives pour effectuer une vasoconstriction ou une vasodilatation. Et des canaux ioniques sont souvent pris pour cible par des agents thérapeutiques soit intentionnellement (par exemple inhibiteurs calciques utilisés pour induire une vasodilatation et hypotension) ou non (par exemple, pour induire des effets secondaires indésirables cardio-vasculaires).

KV7 (KCNQ) canaux potassiques voltage-activés ont récemment été identifié comme targ physiologique et thérapeutique importanteets de régulation de la contraction du muscle lisse. Pour élucider les rôles spécifiques des KV7 canaux à la fois dans la transduction du signal physiologique et dans les actions des agents thérapeutiques, nous devons étudier la façon dont leur activité est modulée au niveau cellulaire ainsi que d'évaluer leur contribution dans le cadre de l'artère intacte.

Les artères mésentériques de rats constituent un système modèle utile. Les artères peuvent être facilement disséquées, débarassés des tissus conjonctifs, et utilisé pour préparer des myocytes artériels isolés pour patch clamp électrophysiologie, ou une canule et mis sous pression pour les mesures de vasoconstricteurs / réponses vasodilatateur dans des conditions relativement physiologiques. Nous décrivons ici les méthodes utilisées pour les deux types de mesures et de donner quelques exemples de la façon dont la conception expérimentale peut être intégré à fournir une meilleure compréhension des rôles de ces canaux ioniques dans la régulation du tonus vasculaire.

Protocol

1. L'excision chirurgicale de la petite arcade mésentérique intestinale vasculaire Anesthésier un 300-400 g rat Sprague-Dawley avec de l'isoflurane (4%), administré par inhalation. Effectuer une laparotomie médiane pour exposer le mésentère de l'intestin grêle. Extérioriser l'intestin grêle et du gros par l'incision abdominale avec le plus grand soin pour éviter de traumatiser l'intestin et du mésentère exposé. Doucement attiser le mésentère au-dessus de gaze …

Discussion

Les méthodes et approches expérimentales décrites ici sont très robustes et peuvent produire des résultats clairs et reproductibles lorsqu'ils sont appliqués avec une attention méticuleuse aux détails. De bons enregistrements électrophysiologiques et la constriction / dilatation des segments artériels sont tributaires de la santé des cellules et des segments d'artère, respectivement. Préparations de cellules peut varier de jour en jour, même en utilisant le même protocole. Solutions d'isolatio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par une subvention du National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) pour KLB et pré-doctorales de l'American Heart Association (09PRE2260209) et Arthur J. Schmitt Fondation pour BKM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium Chloride Sigma S5886 Dissecting Solution: 145
Bath solution for Electrophysiology*: 140
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 140
Bath solution for pressure myography: 145
Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride Sigma P5405 Dissecting Solution: 4.7
Bath solution for Electrophysiology*: 5.36
Internal solution for electrophysiology: 135
Isolation solution for myocytes*: 5.36
Bath solution for pressure myography: 4.7
Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA Sigma E4378 Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES Sigma H9136 Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 10
Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate Sigma S5136 Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate Sigma P5655 Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride Sigma M2393 Bath solution for Electrophysiology*: 1.2
Internal solution for electrophysiology: 1
Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride Sigma C7902 Bath solution for Electrophysiology*: 2
Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate Fisher Scientific BP331-1 Dissecting Solution: 1.2
Bath solution for pressure myography: 1.2
Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate Sigma M2643 Dissecting Solution: 1.17
Bath solution for pressure myography: 1.17
Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS Fisher Scientific BP308 Dissecting Solution: 3
Bath solution for pressure myography: 3
Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid Sigma P4562 Dissecting Solution: 2
Bath solution for pressure myography: 2
Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate Research Organics 9572E Dissecting Solution: 0.02
Bath solution for pressure myography: 0.02
Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose Sigma G7021 Dissecting Solution: 5
Bath solution for Electrophysiology*: 10
Internal solution for electrophysiology: 20
Isolation solution for myocytes*: 10
Bath solution for pressure myography: 5
Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin Sigma A3912 Dissecting Solution: 1%
Lumen solution for pressure myography: 1%
pH Dissecting Solution: 7.4
Bath solution for Electrophysiology*: 7.3
Internal solution for electrophysiology: 7.2
Isolation solution for myocytes*: 7.2
Bath solution for pressure myography: 7.4
Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity Dissecting Solution: 300
Bath solution for Electrophysiology*: 298
Internal solution for electrophysiology: 298
Isolation solution for myocytes*: 298
Bath solution for pressure myography: 300
Lumen solution for pressure myography: 300

*11

Table 1. Components of solutions used in the experiment.

References

  1. Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
  2. Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
  3. Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
  4. Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
  5. Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
  6. Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
  7. Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
  8. Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
  9. Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
  10. Brueggemann, L. I., Kaneez, F. S. . Patch Clamp Technique. , (2012).
  11. Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).

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Cite This Article
Brueggemann, L. I., Mani, B. K., Haick, J., Byron, K. L. Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography. J. Vis. Exp. (67), e4263, doi:10.3791/4263 (2012).

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