パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

Summary

収縮/拡張器応答の測定と並行して孤立した動脈筋細胞（電気生理学的手法をクランプするパッチを使用）（圧力筋運動記録法を用いて）でKV7（KCNQ）カリウムチャネル活性の測定は、血管平滑筋生理学でKV7チャネルの役割に関する重要な情報を明らかにすることができますし、薬理学。

Abstract

抵抗動脈の壁内の平滑筋細胞の収縮や弛緩が動脈径を決定して、それによって血管を通る血液の流れを制御し、全身血圧に貢献しています。収縮過程は主に順番にイオントランスポーターやチャネルの多様によって制御され細胞質カルシウム濃度（[Ca ^{2 _+]} cytの）によって規制されています。イオンチャネルは、血管収縮または血管拡張をもたらすために血管作動性ホルモンによって活性化されるシグナル伝達経路における共通の中間体である。とイオンチャネルはしばしば故意治療薬または意図せずに（不要な心血管系の副作用を誘発するなど ）（ 例えば 、カルシウムチャネル遮断薬は血管拡張と低血圧を誘発するために使用）が対象とされています。

KV7（KCNQ）電圧活性化カリウムチャネルは、最近の重要な生理学的および治療ターグとして関与している平滑筋収縮を調節するためのETS。両方の生理学的信号伝達において、治療薬の作用でKV7チャネルの特定の役割を解明するために、我々は、彼らの活動をそのまま動脈のコンテキストでの貢献を評価するだけでなく、細胞レベルで変調されているかを研究する必要があります。

ラット腸間膜動脈は、有用なモデル系を提供する。動脈は簡単に、解剖し、結合組織を除去し、パッチクランプ電気生理学のために隔離動脈筋細胞を調製するために使用される、またはカニューレを挿入し、相対的に生理的条件下での血管収縮剤/血管拡張反応の測定に加圧することができる。ここでは、測定値の両方のタイプのために使用するメソッドを記述し、実験的なデザインは血管緊張の調節におけるこれらのイオンチャネルの役割の明確な理解を提供するために統合することができる方法のいくつかの例を提供します。

Protocol

1。小腸腸間膜血管アーケードの外科的切除

1. 吸入によって投与イソフルランで300〜400グラムのSprague-Dawleyラット（4％）を麻酔。
2. 小腸腸間膜を露出させるために正中開腹術を行います。露出した腸と腸間膜への外傷を避けるために細心の注意を払って腹部を切開して、小腸および大腸を体外に出す。優しく滅菌ガーゼの上腸間膜をファンアウト。
3. 外科的に小腸と盲腸（血管が慎重に縁に沿ってカットし、上腸間膜動脈/静脈の主枝からの起源で）を含む大腸の部分切除。
4. 氷冷解剖溶液（ 表1）を含むビーカーに切除した組織を移す。
5. 腸の切除後、ラットは麻酔下人道的に安楽死させなければなりません。

2。解剖動脈のdのクリーニング

1. 冷却ソリューションを含む解剖室（4-5℃）を解剖し摘出小腸と腸間膜のアーケードを転送します。チャンバーは、解剖ピンを収容するためにSYLGARD 184エラストマーベースで100mmのガラスシャーレで構成され、ペトリ皿を循環水浴で4から5℃に維持されている水冷ベースに配置されます。
2. 手術用のハサミを使用すると、腸全体のうち約10〜12 cm商品セグメントをカット。その血管系が添付保つ腸セグメントの各端部で切断した後、分離してそれに接続されている血管系（腸間膜アーケード）と1セグメントを残し室から未使用の腸を削除します。
3. 上腸間膜動脈/静脈の主枝は中心部と中央（ 図1）からの枝が放射状のその後の受注にあるようなチャンバーの手前側の上腸間膜を広げ、小腸のセグメントを突き止める。ポーランドエースだけ腸部分（ない血管上）上のピン。
4. むしろ静脈に見られるU字型の枝ではなく、それらの比較的明るい赤色、厚い壁と特徴的なV字型の枝によって静脈から動脈を区別する。
5. 近いマイクロ鉗子、はさみを使用して腸（ 図1の破線の円）から4 ^番目の注文動脈-慎重に脂肪組織と第2 ^回を取り巻く結合組織をクリアし、照らされた解剖顕微鏡を通して可視化。隣接した静脈を保持することは、脂肪組織や結合組織のクリアが容易になります。動脈の伸縮不必要なことは避けてください。
6. 結合組織のクリア腸間膜動脈のセグメントは、解剖や細胞単離のために使用（単一セルパッチクランプ研究のために、セクション3-4）または圧力筋運動記録法（第5節）のためにカニューレを挿入することができます。通常、最大長さ1cmに、分岐点間のセグメントをカットします。

パッチクランプ研究のためのCellアイソレーションjove_title "> 3。

1. アイソレーション·ソリューション0.5Lの（ 表1）を調製し、pHを調整する前に、2つの部分に分ける。最初の部分（通常100ミリリットル）を37に温めなければならない℃、pHは37℃で7.2に調整されるべき℃（37℃アイソレーション·ソリューション）。アイソレーション·ソリューションの第二の部分は℃、pHを4℃（氷冷分離ソリューション）で7.2に調整されるべきである4に冷却する必要があります。 pH調整した後、両方の溶液の浸透圧は、D-グルコースまたはH _{2 O}の適切な量を追加することによってmOsmを298ように調整する必要があります必要があります
2. 37℃でガラスバイアルとインキュベートする37℃分離溶液2 mlを3.4°ステップで使用するためのC。 37 10mlに（BSA）をウシ血清アルブミン20mgを追加〜37℃アイソレーション·ソリューション、解散、再暖かい℃、7.2にpHを調整してください。 633 U：この溶液2mlに4 mgのコラゲナーゼタイプVIII型（シグマ、ロット089K8612追加シラミ/ mgのコラゲナーゼ活性、285単位/ mg Caseinaseアクティビティ、1.6単位/ mgクロストリパイン活性）、0.64 mgのエラスターゼIV型（シグマ、ロット110M7025V 5.9単位/ mg、37で調製した16 mg / mlの株式の40μlを加える° C分離ソリューション）と12μlのM DL-ジチオスレイトール（DTTシグマ）; 37〜プリ暖かいこの酵素液℃ステップ3.5の準備インチ
3. 氷冷分離溶液2 mlを含む、35 mm組織培養皿に上腸間膜動脈の2-3セグメントを転送して、氷の上で皿を置きます。 3〜4ミリメートル、長さの小片に腸間膜動脈のセグメントをカットします。
4. 37℃で30分間、予め温めておいた2 mlを含有するガラスバイアル（15×45ミリメートル、1ドラム）に動脈セグメントを転送する（動脈の損傷を防ぐために）火磨かれた先端37をパスツールピペットを用いて°Cのアイソレーション·ソリューションとインキュベート℃の
5. 30分後、慎重にパスツールピペットを用いて37℃の分離液を除き、35分間2ミリリットル温かい酵素液とインキュベートを追加37℃
6. 直ちに酵素溶液中で35分間インキュベーションした後、氷上でバイアルを置き、酵素液を吸引し、氷冷分離ソリューション（リピート吸引し、新鮮な氷冷分離Solutionの添加4回）2 mlを加える。その後、氷冷分離溶液1mlの体積で、 ​​穏やかに 10〜20回は、個々の腸間膜動脈平滑筋細胞（MASMCs）を解放するために洗練されたパスツールピペットを用いて動脈セグメントをひいて粉にする。
7. 定期的に35-mmディッシュに細胞懸濁液の液滴を配置し、顕微鏡下で観察することにより心筋細胞の出現を確認してください。健康MASMCsは、滑らかな細長い外観を持っている必要があります。動脈壁の細胞のすべてが解放されません。細胞懸濁液を氷上で保たれるべきである。
8. MASMC健康のもう一つの有用な指標は、生理的なCa ^{2 +}濃度の彼らの許容範囲です。風呂sで記録室（＃サイエンスツールは、CSC-25L）を埋める2mMのCaCl _2（室温でpHを7.3（RT）で、組成は表1を参照）および参照電極（ワーナー音源には、REFに挿入された位置の寒天ブリッジ（曲がったガラスは、2MのKClで2％寒天でいっぱいキャピラリー含むolutionチャンバー内の-3L））。洗練されたパスツールピペットを用いて、記録室に約100〜200μlの細胞懸濁液を移すと、細胞が15分間付着することができます。損傷を受けていない細胞は、2mMのCaCl ₂含有溶液（細胞がボールに切り上げていない、あるいは細長い棒状のように表示されるはず）で大幅に縮小するべきではありません。
9. 記録室への細胞懸濁液の最初のアリコートを添加した後、2 mM CaCl _2を含む浴溶液0.25mlの細胞懸濁液の残量に加えられるべきである。この残りの細胞懸濁液を氷上にこの溶液中で維持し、最大6時間のためのパッチクランプ記録のために使用することができます。

4。KV7カリウム電流または膜電圧を測定する全細胞パッチクランプの使用

1. 筋細胞は、記録室（25ミリ1号ラウンドカバースリップ、ワーナー·インスツルメンツ）のガラス基盤に付着した後、浴溶液（ 表1）の連続灌流を開始します。 KV1とKV2家族の遅延整流カリウム電流から分離してKV7電流の記録については、浴溶液を100μMGdCl ₃で補足する必要があります。
2. ピペットプラーとマイクロフォージを使ってホウケイ酸ガラス（Kimax-51、キンブルチェイス）からパッチピペットを作製し、内部液（ 表1）で満たされたとき、その抵抗値は4から5MΩでなければなりません。コートSYLGARD 184とピペット（先端上〜1-2 mm）の^1月 _3日より低い。
3. MASMCsでKV7電流の記録については、穿孔パッチ細胞全体の電圧クランプ法を使用する必要があります。穿孔パッチ構成の使用はdepletioを防ぐのに役立ちます膜ホスファチジルイノシトール4,5 -ビスリ ​​ン酸（PIP _2）と後続の高速（5分以内）は、一般的に従来の破裂パッチ構成を用いて観察されるKV7電流の塁間のn。 120μg/ mlのアムホテリシンBと内部液（ 表1）を補足：内部溶液0.5mlにアムホテリシンBの2 mg / mlストック（DMSO中で調製し、小分けに冷凍し、光から保護し維持）の3μlを添加する。アムホテリシンBを含まない内部液中のピペットチップを浸漬した後、チューブのピース（タイゴンR-を介して結合し、10mlのシリンジを使用してもう一方の端の吸引を適用することにより、アムホテリシンBを含まない内部溶液とパッチピペットの先端を埋める3603）。ピペットが約半分溶液で満たされるまで、エッペンドルフMicroloaderピペットチップを用いて上部からアムホテリシンB含有ピペット溶液を追加します。そっとピペットをタップして、任意の気泡を除去する。直ちにピペットを使用しています。
4. にピペットを挿入電極ホルダーへと細長い筋細胞（の近くではなく、核の上に、 図2）の表面にピペットを下げるためにマニピュレーターを使用しています。ピペットの抵抗に1MΩ6月10日まで増加すると、ギガシール（> 10GΩ）を達成するために吸引を適用します。
5. 膜穿孔を待っている間に0 mVの電圧を保持に設定します。 10 mVにしてから-10 mVから100ミリ秒の電圧ステップを適用し、高速ピペット容量トランジェントを補正するためにアンプを使用します。全細胞キャパシタンスの過渡の出現と同時に、小さな持続的な正の電流（通常は2から10 pAの）官能KV7チャネルの存在を示します。
6. アムホテリシンBとの巧妙な穿孔が35MΩ以下にアクセス抵抗を減らすことができます。現在の記録はその後-4 mVの保持電圧から5秒の電圧ステッププロトコルを使用して開始することができます。我々は、遅延RECの他の種類の最大不活性近く達成するために-4 mVの保持電圧を使用そうでなければ、比較的小さな非活化KV7電流の記録を汚染するtifierカリウム電流（KV1とKV2チャネルによって主に媒介される）。長い（5秒）電圧ステッププロトコルは遅い電圧依存性活性化および不活性化を示すKV7チャンネルの定常状態の活性化を達成するために必要である。 KV7電流が持続電圧ステップの間に不活化されません。
7. KV7電流 - 電圧（IV）の関係を記録するには、KV7チャネルの開確率が最小となる-84 mVで、KV7からチャネルの開確率が到達した時点の16 mVの範囲の電圧に5秒の電圧ステップを適用高原は、各試験電圧で5秒後に、10秒間保持電圧（-4 MV）にバックステップ。それは、テストパルス（ 図3A）の全シリーズには約3.5分かかります。記録された電流が経時的に安定であることを確認するために2から3制御IVのレコーディングを行う。プロット平均的なエ​​ンドパルス電流（平均最後の1秒間記録された電流）対電圧は、IV曲線（ 図3D）を作成します。電流が安定している場合は、コントロールIV曲線は、約重畳されるべきである。
8. 任意の薬理学的薬剤を適用する前に、継続的に-20 mVで現在記録するように設計された時間経過プロトコルを開始する。医薬品申請前に少なくとも5分間電流の安定した記録を確認します。 5から15分間、または定常状態（ 図3C）が達成されるまで、薬理学的薬剤を塗布してから、時間経過プロトコルと記録電圧ステップのプロトコルを使用して、2つのIV曲線を終了します。薬物ウォッシュアウトと2つの追加のIV曲線の記録に続いて、薬物ウォッシュアウトの時間経過を、記録します。
9. 実験の最後に、10μMまたは10μMlinopirdine XE991、KV7チャンネルの不可逆的阻害剤を適用し、これらの薬は完全に-20 mVに（ 図3D）に負の電圧で記録された電流を阻害する必要があります。

5。圧力筋運動記録法無傷の動脈セグメントの使用

1. デンマークミオテクノロジー（DMT A / S、デンマーク、モデル110P）から購入した圧力ミオグラフシステムは圧力筋運動記録法の実験のために使用されます。一端部と他端部に可動右ガラスカニューレ内に水平に固定された左のガラスカニューレを挿入することにより、ステンレス鋼チャンバー内動脈セグメントをマウントします。二つの圧力変換器（左側右側とP2のP1）が動脈管腔内に圧力を監視するために構築されています。右側のガラスカニューレからの流体はその近似生理的レベルに動脈内の圧力を調整するために使用されます。開始するには、ルーメン液（ 表1）と、オープン10mlのシリンジ（重力供給圧力列として）事前に記入してください。ソリューションをプッシュするために注射器を上げるチューブやカニューレ内の気泡を避けるように注意しながら右ガラスカニューレにポリエチレンチューブを介してる。左カニューレを1mlシリンジ経由ルーメン液であらかじめ入力されているはずです。血管浴溶液（ 表1）10mlの圧力ミオグラフ室を埋める。緩くガラスカニューレに隣接する各側に2つの既製の細かいナイロン縫合糸をサスペンドします。
2. マイクロを使用してセグメントの一端につかまって圧力ミオグラフ室に解剖室から、 -慎重に解剖した腸間膜動脈のセグメント（ステップ2.6から、直径350μmの通常約200 3 ^番目または4 ^番目の順序セグメント）を転送鉗子。
3. 照光式解剖顕微鏡を通して可視化、動脈セグメントの一端を保持し、そっと左ガラスカニューレ上にそれをスライドさせ、ナイロン縫合糸を使用してエンドを固定します。ゆっくり血管内血液や破片を除去するために取り付けられた血管内腔を通して流体をフラッシュします。左注射器への弁を、この側は圧力が右側から調整され、それに対して流体の静的な列を提示するようにクローズする必要があります。
4. マイクロマニピュレータ、位置動脈セグメントに近い可動右ガラスカニューレを使用して、その上のセグメントの右端を引っ張り、最後にナイロン縫合糸でそれを固定している。余分な縫合糸を切っクリップ。
5. 圧力ミオグラフ顕微鏡の上にステージ上の圧力ミオグラフユニットをマウントします。圧力ミオグラフ室の上にカバーを置きます。チャンバー用カバーは灌流口とそれに接続されているサクションパイプが入っています。重力による圧力ミオグラフ室に室温浴または60mMのKCl溶液の灌流を可能にするためのマニホールドに灌流口を接続します。そのようなKV7チャネル機能に影響を及ぼすことがパッチクランプ測定において見出されている薬やホルモンなどの被験物質は、一般的に風呂が電源を介して、浴溶液に直接適用されませんerfusionまたはルーメン液インチ浴溶液の灌流は、KCl溶液を洗い流すために使用されます。過剰superfusateを除去するために真空システムにサクションパイプを取り付けます。ミオグラフ室カバーに設けられた開口部を介し浴溶液に温度センサーを挿入します。
6. ミオインターフェースシステム、マイオビューソフトウェア（DMT）にミオグラフユニットの通信を可能にするハードウェアに圧力ミオグラフユニットを接続します。
7. コンピュータにおけるマイオビューソフトウェアを開きます。パラメータウィンドウで、1の温度トレランスで35°Cとして、目標温度を設定℃、80 mmHgで、80 mmHgのような標的流出圧などのターゲット流入圧。キャリブレーションファイルをロードして、動脈径の変化はミクロン単位で正確に記録されるように、血管外径のキャリブレーションを行います。背景にマウントされたセグメントの良いビューを有効にするために、必要に応じてコントラストを調整します。ソフトウェアの使用方法について詳細な説明DMTからユーザマニュアルに記載されています。
8. P1の圧力トランスデューサが80 mmHgに読み取るまで徐々に15分かけて10mlのシリンジ（重力供給圧力列として）提起する。高圧塔を上げながら、容器内の任意の漏れをチェックします。任意のリークがある場合は、セグメントを破棄して（5.2からの手順を繰り返します）別の動脈セグメントをマウントします。カニューレ必要な場合の間の距離を調整します。距離は、加圧された動脈セグメントが（しかし、引き伸ばされません）ほぼ直線であり、絆が作られています肩のようなパターン（ 図4A）を形成するように調整されるべきである。
9. ミオインターフェースシステムのコントロールを介して圧力ミオグラフ室の暖房をオンにします。それは36から37℃に達するまで浴溶液を徐々に温めて許す
10. DMT顕微鏡の対物のXYZ調整を使用するときに、フォーカスに容器を保つとchを正確に追跡を容易にするために必要外側の血管径でアンジェス。
11. 60mMのKClで過渡灌流（〜30秒）でマウント容器の生存を確認してください。実行可​​能な容器はKClの添加に素早く収縮及び60mM塩化カリウム（KClを洗い流す浴溶液約60mlを表面かん流する）のウォッシュアウト直後に拡張させる。この試験後、正確に10 mlと浴溶液の量を調整します。これらのソリューションは室温であるが、チャンバーヒーターは数分以内に36から37℃まで温度が復元されますので、お風呂の温度はKClのテストとウォッシュアウト時に削減されます。
12. 動脈は少なくとも30分（径がこの期間の少なくとも最後の10分間安定していなければならない）のために平衡化させます。直接浴溶液に濃縮された被験物質を追加し、10ミリリットル室容積で適切な最終濃度を得、浴溶液中の被験物質を混ぜて優しく室のエッジ付近で前後に移します。チャン実験が進行中に被験物質を添加し（複数可）の後に血管径でGESは、ライブ映像で監視し、また画像解析ウィンドウでグラフ化することができます。
13. 実験終了後、保存されたデータ（*。ミオ）ファイルは、さらなる分析のためにスプレッドシートファイルとして開くことができます。

6。代表的な結果

図3A、B、図3に示した結果はKV7チャネル·アクティベーター亜鉛ピリチオン（ZnPyr、100nmの治療の前に（ 図3A、Bブラックトレース）との間の電圧ステッププロトコルを使用して腸間膜動脈の筋細胞からKV7電流の代表的な録音を例証赤のトレース）。 3細胞から同様の電圧ステップデータは 、 図3（d）に示すように電流-電圧（IV）のプロットを準備するために平均化した。電流振幅の増強の代表経時変化（-20 mVで連続的な電圧クランプによって測定される）ドゥリン100nMの亜鉛ピリチオンとグラム処理は、図3Cに示されている図4Bは、圧力筋運動記録法を用いて測定した腸間膜動脈外径にZnPyrの効果の経時変化を示す図である。容器は100 pMのアルギニンバソプレシン（AVP）を使ったプレくびれだった前に100nMのZnPyrの追加。 ZnPyr誘発性腸間膜動脈瘤に対する平均用量反応データは、 図4Cに示されています。

図1：解剖室における腸間膜アーケードの写真。

図2は、その表面上のパッチピペットを用いて筋細胞の写真。

KV7電流、薬の時間経過の図3。オリジナルトレースアプリケーション、IVカーブ。治療前の電圧ステップ（上パネル）（制御、黒）と単一MASMCにおいて100nM ZnPyr（赤）の存在下で、次の安定化に応答して、記録された連続した電流トレース（下のパネル）のA.家族。からB.描写電流トレース制御（ブラック）および100nM ZnPyr（赤）用（ように矢印で示されます）。グレーのバーは、現在の振幅は電流 - 電圧（IV）プロットを測定した平均時間間隔を示します。ステップ電圧は矢頭で右側に表示されています。 -20 mVの（バー）で連続電圧クランプを用いて測定し、100nMのZnPyrによってKV7現在のエンハンスメントのC.タイムコース。 D.平均IVは100nM ZnPyr（白丸）を用いた治療中、（制御、黒丸）前に記録KV7電流密度由来曲線（n = 3）で、および10μMXE991（黒三角）で治療中。非特異的なリーク電流がパスモアらによって記載として差し引いた^。1。

ENT ">
100pMのAVPとプリくびれ腸間膜動脈の図4。ZnPyr誘発弛緩。圧力ミオグラフセットアップに搭載された腸間膜動脈のAの写真。 100nMのZnPyr（充填バー）の適用が続い100pMのAVP（オープンバー）のアプリケーションに応じて、容器の外径の変化のB.時間コース。 C.バーグラフは、100nM ZnPyr誘起vasodilaionの結果をまとめた。

Discussion

ここに記載される方法および実験的アプローチが非常に強固であり、細部にまで細心の注意を払って適用されたときに明確かつ再現性のある結果を生成することができます。良い電気生理学的記録及び狭窄/動脈セグメントの拡張は、それぞれ細胞と動脈セグメントの健康に依存しています。細胞調製も同じプロトコルを使用して、日ごとに変化することができる。アイソレーションソリューションは2週間までに使用することができますが、細胞調製の質が2後件日に低ければ新しいアイソレーション·ソリューションを用意する必要があります。我々は、酵素活性が酵素のそれぞれの新しいバッチで最適化を必要とするバッチ間、したがって分離条件（インキュベーションの時間や酵素の濃度）に変わることを発見した。我々はまた、ラット腸間膜動脈のためにここで説明細胞単離プロトコルが異なるミックスや歯を持っているかもしれない他の血管床や他の種のために最適ではないことを発見した細胞外マトリックス成分のITY。各血管の準備が健康的な細胞を作り出す条件を識別するために、独自の最適化を必要とします。私たちは健康な細胞を同定する際に最も役に立ちする基準は次のとおりである：1）細胞形態：2に転送するとき^+、および同じ外観を保持し、50μMのCa ^2を含む絶縁ソリューション、マサチューセッツ州でセグメントを摩砕した後、滑らかな細長いが、わずかにくびれ出現mMのCa ^{2 +の}含有外部溶液。ていないすべての細胞は、そのほぼ完全にリラックスして細長い形状が保持されますが、唯一ほぼ完全にリラックスした筋細胞は電気生理学的記録のために使用されるべきである、2）細胞は無傷無傷の膜を示している、光学的に密であるべき、3）健康な心筋細胞の静止膜電圧を使用膜電圧の現在のクランプ記録のための記録カリウム電流またはイオン条件デ下-40 mVの（通常は-45 mVの範囲内-56 mVにより負でなければなりません）は、ここで我々のプロトコルでcribed。

成功した電気生理学的記録、浴溶液およびピペット溶液（組成は表1を参照のこと ）を確認するには実験当日に準備する必要があります。それは、（298から299 mOsM）同じになるように、両方の内部と風呂ソリューションの浸透圧を調整することが重要です。

より密接に近似アイソメトリック力の測定値が何よりも生理的条件を圧力筋運動記録法を用いた小動脈（<500μm）で作られ重体動脈機能の測定は、ワイヤミオグラフを使用して作りました。圧力ミオグラフの血管は、より密接に生体^5,6で測定感度に近似し、通常は血管収縮薬アゴニスト^2-4に敏感です。アゴニストの低濃度に増加し感度がAVPの生理学的に関連ピコモル濃度によって誘導されるシグナル伝達機構の同定を可能にしました^7,8。

圧力筋運動記録法は、容器の幾何学的形状を保持し、内皮細胞の整合性を維持します。薬の内皮媒介効果は損なわれておらず、裸にされた血管内皮⁹に並列測定を行うことにより、平滑筋媒介効果を区別することができます。内皮の意図的な破壊は、物理的に内皮を（ルーメンを通して前後に人間の髪の毛を渡すことによって ）損壊し、又は動脈の内腔を介して空気を灌流することによって達成することができる。内皮機能（ただし、血管平滑筋機能）の損失は⁹アゴニストとのプレ狭窄血管におけるアセチルコリンに対する内皮減少媒介性血管拡張反応を測定することにより確認されるべきである。

パッチクランプ法および腸間膜arteriの動脈収縮/拡張を使用して腸間膜動脈筋細胞におけるイオン電流/膜電位のパラレル測定圧力筋運動記録法を用いたESは生理的なシグナル伝達カスケードの両方で、治療薬の作用で特定のイオンチャネルの役割の解明を有効にすることができます。治療法は、イオンチャネルの特定のクラスをターゲットにしたり、特定のシグナル伝達中間体は、細胞レベルでの心筋細胞機能の調節で、無傷の動脈の収縮/膨張のこれらのチャネルの役割に関する機構的情報を提供するために、付加的にまたはシーケンスに適用できます。動脈径に対応する効果とイオン電流の特定の種類を拡張したり、抑制する治療法の収束結果自体はどちらかの方法を用いて得ることができるよりもより信頼性の高い解釈を提供します。理想的には、研究中の薬剤の濃度依存性は、両方のシステムで決定されるべきである。生理的または治療的関連性を評価するために、試験された濃度は、生理的環境oの中で測定された濃度に関連していなければならrは、臨床治療で達成。実験的なアプローチ、これらのタイプの例は我々の前の出版物^8-10に記載されています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
*11
Table 1. Components of solutions used in the experiment.