Summary
المهندسة الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة في مجال الطب التجديدي، ونموذج المرض وأيضا كمصدر بديل للحوم. نحن هنا وصف الهندسية لبناء العضلات، في هذه الحالة من خلايا فأر السلف myoblast، والتحفيز من قبل النبضات الكهربائية.
Abstract
ويمكن استخدام هندسة الأنسجة العضلية لأغراض مختلفة، والتي تشمل إنتاج أنسجة لاستخدامها كنموذج المرض في المختبر، على سبيل المثال لدراسة التقرحات الناتجة عن الضغط، للطب التجديدي وكبديل اللحوم 1. تم إجراء المرة الأولى التي يبلغ يبني العضلات 3D قبل سنوات عديدة والرواد في مجال Vandenburgh هي وزملاؤها 2،3. التقدم المحرز في هندسة الأنسجة العضلية ليست سوى نتيجة من مكاسب واسعة في معرفة العوامل البيوكيميائية، والخلايا الجذعية والخلايا الاولية، ولكن هي في مقرها بصفة خاصة على الخبرات المكتسبة من قبل الباحثين أن العوامل المادية تلعب دورا أساسيا في السيطرة على سلوك الخلية و الأنسجة التنمية. دولة من بين الفن العضلات الهندسة يبني تتكون حاليا من يبني هيدروجيل الخلية بالسكان. في مختبرنا هذه تتكون عادة من الفئران الخلايا الاصلية myoblast، معزولة عن الفئران عضلات الأطراف الخلفية أو خلية myoblast خط الفئران C2C12، ميلxed مع خليط من الكولاجين / Matrigel ومطلي بين نقطتين ترسيخ، ومحاكاة الأربطة العضلية. ويمكن اعتبار الخلايا الأخرى أيضا، مثل خطوط الخلايا البديلة مثل الفئران myoblasts L6 4، الوليد خلايا العضلات السلف المستمدة 5، الخلايا المشتقة من الأنسجة العضلية الكبار من الأنواع الأخرى مثل 6 أو بفعل الإنسان حتى الخلايا الجذعية المحفزة (خلايا الجذع) 7 . انقباض الخلايا يسبب محاذاة الخلايا على طول المحور الطويل للبناء 8،9 والتمايز للخلايا العضلات السلف بعد حوالي أسبوع واحد من الثقافة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق التحفيز الكهربائي تعزيز عملية التمايز إلى حد ما 8. بسبب حجمها محدود (8 × 2 × 0.5 مم) ويمكن تحليل الأنسجة باستخدام المجهر متحد البؤر كاملة لرصد جدوى مثل تمايز الخلايا والمواءمة. اعتمادا على تطبيق معين متطلبات engineeسوف تختلف الأنسجة العضلية الحمراء، واستخدام مثل للطب التجديدي يتطلب رفع مستوى حجم الأنسجة والأوعية الدموية، في حين ليكون بمثابة ترجمة لحوم بديلة الأنواع الأخرى أمر ضروري.
Protocol
1. ثقافة الفئران الخلايا الاصلية Myoblast أو خلايا C2C12
- عزل الخلايا وفقا للبروتوكول نشر في البداية من قبل شيفر وزملاؤه (10) وتكييفها في وقت لاحق من قبل كولينز وآخرون (11) وبونين وآخرون 12 و تخزين هذه في النيتروجين السائل. هذا يتطلب الفئران، على سبيل المثال C57BL / 6. وتستخدم أساليب بديلة في مختبرات أخرى، على سبيل المثال طريقة التي نشرت في مجلة التجارب تصور من قبل شركة Y لى وآخرون 13. لالكواشف والمعدات ويشار لك الجدول في الصفحة 7 و 8. من العضلات من الماوس سوف تحصل عموما الخلايا بما يكفي لنحو 20 قارورة cryopreserve في النيتروجين السائل. المقبل، ونحن نبدأ البروتوكول لذوبان الجليد في الخلايا من تخزين النيتروجين السائل.
- وضع الخلايا من 1 فيال في Matrigel 25 2 سم (1 ملغ / مل) قارورة المغلفة زراعة الأنسجة والمتوسطة إضافة النمو (GM)، ويتألف من (335 مل DMEM المتقدمة، بوفين الجنين 100 مله المصل (FBS)، 50 مل HS، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين، 5 مل L-glutamin، 5 مل استخراج الجنين الدجاج (CEE)).
ملاحظة: معطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة وإزالة Matrigel من الطموح.
- ثقافة فرعية الخلايا 1:03 تقريبا كل 3 أيام.
وهذا يعني: في يوم 3: الخلايا المرور من 25 سم إلى احدة 2 قارورة 75 2 سم، في يوم 6: الانتقال من الخلايا 75 قارورة 2 سم لمدة 150 قوارير 2 سم (مع 30 دقيقة في قوارير preplating غير المصقول). على يوم 9 خدمة النقل 150 سم 2 إلى 1 قارورة قارورة الثلاثي 150 2 سم، أو إذا غير متوفرة لثلاث قوارير 150 سم 2 (إذا لزم الأمر preplate يتوقف مرة أخرى على النمط الظاهري للخلايا). على يوم 12 الخلايا على استعداد لزرع البذور في بناء العضلات.
ملاحظات: - لكل 150 سم الثلاثي (2) وعدد الخلايا ستكون حوالي 4.5 × 10 6 خلايا.
عبر استخدام -LS من العزلة مختلفة لمزجها للحصول على مزيج من الخلايا في وقت البذر.
ملاحظة: إذا اخترت عدم العمل مع الخلايا الأولية، C2C12 myoblasts هي بديل جيد.
2. الهندسة الأنسجة العضلية الهيكلية
- إعداد الغراء السيليكون عن طريق خلط "الاستومر" مع "وكيل علاج" (10:1). قطع + / - 5 ملم مربع من شرائح الفيلكرو مع جانب واحد الثلاثي (مثل منزل الشكل، الشكل 1). الغراء الفيلكرو في آبار لوحة الثقافة جيدا في 6 مساحة ما يقرب من 12 ملم بين المربعات.
ملاحظات: - لا تستخدم إلا لينة الجانب من الفيلكرو ومواجهة هذا الجانب الصعودي.
- تأكد من أن أسطح المنازل مواجهة بعضها البعض.
- لا تغطي سوى الفيلكرو مع الغراء السيليكون، لا تنتشر في جميع أنحاء البئر الغراء.
- للحصول على التحفيز الكهربائي في وقت لاحق من ذات الصلة لتحقيق المواءمة بين ثوابت في الاتجاه العمودي للجمع بشكل جيديأكلون (على طول المحور الطويل).
- ترك ليجف بين عشية وضحاها في الفرن فراغ، وليس ساخنة، في المقام الأول لإزالة فقاعات الهواء. تعقيم بإضافة EtOH 70٪ إلى الآبار واحتضان لمدة 15 دقيقة. شطف 3x مع PBS وضعت تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. إزالة جميع PBS من الآبار والفيلكرو ومكان في الحاضنة حتى الاستخدام.
- ذوبان الجليد حل Matrigel في الثلاجة وإعداد الحل الكولاجين إلى التركيز المطلوب قبل فترة وجيزة جعل يبني 3D. تمييع الأسهم الكولاجين مع حمض الخليك العقيمة 0.02٪ (تركيز النهائي 3،2 ملغ / مل).
ملاحظة: ترك كل شيء على الجليد.
- يعرض للتريبسين الخلايا، resuspend في GM والعد. ترك الخلايا في أنبوب الطرد المركزي في الحاضنة.
- إضافة المبلغ المطلوب من محلول المخزون الكولاجين لأعداد التركيبات التي تريد القيام بها لأنبوب (وفقا لجدول 1)، إضافة إلى هيدروكسيد الصوديوم 0.5M هذا الحل الكولاجين حتى كولو ردي فاتحوتشير R الرقم الهيدروجيني من 7.5. مزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا وتجنب تكوين فقاعة. ثم يضاف مزيج Matrigel ولكن بلطف جدا بدقة. وأخيرا، إضافة إلى خليط GM الكولاجين / Matrigel (على الكميات المناسبة انظر الجدول 1).
ملاحظات: - تنفيذ كل خطوة على الجليد! سوف Matrigel والكولاجين هلام بسهولة في زيادة درجة الحرارة.
- مراعاة أن اللون الوردي هو في الواقع! وزيادة في درجة الحموضة حمل أيضا دبق السريع.
- تركيز النهائي من الكولاجين: 1.6 ملغ / مل.
- أجهزة الطرد المركزي المبلغ المطلوب من الخلايا في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
ملاحظة: - اعتمادا على نشاط الخلايا عدد الخلايا في بناء يحتاج إلى تعديل. عادة، وعدد من الخلايا تقع بين 750،000 و 1250000 الخلايا في بناء.
- استخدام بعض من خليط جل ل resuspend بيليه الخليةونقل الخلايا إلى الخليط المتبقي وتخلط جيدا، ولكن دون إدخال فقاعات الهواء.
- تأخذ لوحات محمى بشكل جيد للخروج من الحاضنة وماصة 0.35 -0.4 مل من الخليط خلية جل في أول الفيلكرو. ثم، والبدء في ماصة الخليط من وسط بين المواقع المرفقات وتمتد إلى الفيلكرو. وأخيرا، استخدام ما تبقى من هلام لتملأ الفجوة بين اثنين والمراسي الفيلكرو ماصة حول قطع الفيلكرو.
- تحقق بعناية بعد 5-10 دقيقة إذا كان الهلام صلبة بما فيه الكفاية على أن يتم تحويلها، أي الاستفادة بلطف الأطباق وتفتيش بصريا إذا كان جل جامد. إذا كان الأمر كذلك، بعناية ضع الأطباق في حاضنة. عادة، يمكن اعتقلوا بعد عشر دقائق. ثم، وبعد ساعة 1-2، تراكب بلطف كل هلام مع 4 مل من GM الدافئة.
ملاحظة:-لا تجعل أي حركات قوية عند التعامل مع لوحات.
- استبدال GM من تمايز المتوسطة (متوسطة النمواستخراج الجنين دون كتكوت) بعد 24 ساعة، واستبدال المتوسطة جديدة كل 2-3 أيام. على يوم واحد 7 وأن يكون حاصلا كنت ناضجة ألياف العضلات المنحى، كما يمكن تقييم مع تلطيخ للتنمية تثليم عبر ألياف العضلات في تنصهر.
3. التحفيز الكهربائي
- تعقيم الأقطاب من لوحة ionoptix (انظر الجدول الكواشف والمعدات) قبل استخدامه مع الايثانول 70٪ والجافة في وقت لاحق تحت الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة. وضع لوحة الأقطاب الكهربائية مع الثقافة على طبق مع البنى وتغطية مع غطاء من لوحة الثقافة ونقلها إلى الحاضنة. توصيل Ionoptix C-محدد السرعة مع الكابلات المناسبة.
ملاحظة: يتم وضع أقطاب متوازية جنبا إلى جنب مع بناء العضلات (الشكل 2).
- تطبيق بروتوكول التحفيز كما كان متوقعا.
ملاحظة: نحن نستخدم عموما 4 V / CM،6ms البقول على تردد 2Hz. تغيير ثقافة المتوسط على مدار 24 ساعة خلال كل التحفيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وسوف يكون المنتج النهائي يبني العضلات كما هو مبين في الشكل 3. فإن حجم الأنسجة تكون حوالي 8 مم، 2 مم واسعة و 0.5 مم. سوف التحفيز الكهربائي خلال التمايز تغيير التعبير عن الأشكال الإسوية الميوسين السلسلة الثقيلة، ولكن لا يعزز إلى حد كبير عملية التمايز والناجمة عن تمايز المتوسطة 8، ولكن يمكن أيضا أن تطبق التحفيز الكهربائي في نهاية عملية للتحقق من وظيفة العضلات ، لأن العضلات مع sarcomeres تطويره بالكامل لتكون قادرة على التعاقد مع نبضة كهربائية.
ويمكن أيضا أن التمايز والنضج تحليلها باستخدام PCR الكمي لتقييم التعبير الجيني وتلطيخ لعلامات النضج العضلات أو عبر تثليم التنمية (على سبيل المثال لتلطيخ actinin ألفا) على أي أقسام مصنوعة من أنسجة أو كلها عينات الأنسجة جبل الملون. نضوج العضلات والاسترخاء التمايزالجينات وتيد الميوسين التعبير السلسلة الثقيلة تشمل MyoD على سبيل المثال، myogenin، وMFR4 MLP، وMYH 1 و 2 و 4 و 8 8. وقد تم نشر دليل على أن الأنسجة العضلية التي يتم تشكيلها في الواقع هو الأنسجة العضلية، على أساس التعبير الجيني، stainings المناعى وتحريض من قبل الانكماش التحفيز الكهربائي، في السابق 8 و شخصية مع المقاطع العرضية الملون من الأنسجة العضلية مصنوعة من الخلايا الاصلية myoblast والخلايا C2C12 من هذه الورقة يتم عرض في الشكل 4.
| حل | حجم (إذا ب 10 العضلات) في ميكرولتر |
| الكولاجين (3.2 ملغ / مل، مع حامض الخليك المخفف 0.02٪) | 2570 (51.3٪) |
| هيدروكسيد الصوديوم (0.5M) | 10 (0.2٪) |
| Matrigel | 430 (8.6٪) |
| النمو المتوسط | 2،000 (39.9٪) |
| مجموع | 5010 (ينبغي أن يكون كافيا بما فيه الكفاية مع لإراقة pipetting والخسارة) |
الجدول 1. خليط من الخلايا وهلام لتوليد أنسجة العضلات بناء هندسيا.
الشكل 1. قطع قطعة من الفيلكرو.
الشكل 2. صورة التي مأخوذة من الجزء السفلي من العضلات بناء في بئر من لوحة 6 جيدا تبين وضع الأقطاب الكهربائية. يتم وضع أقطاب كهربائية (المشار إليها مع الأسهم البيضاء) موازية ليبني العضلات.
الشكل 3. A الأنسجةالمهندسة العضلات بين قطعتين من الفيلكرو في لوحة الثقافة 6 أيضا.
الشكل 4. أمثلة نموذجية عبر التصدعات في C2C12 (A) وMPC (B) الهندسة في أنسجة العضلات والهيكل العظمي. كانت ملطخة أقسام المجمدة من mBAMs غير حفز (اليوم 8 التمايز) لsarcomeric α-actinin (أحمر)، sarcomeric الميوسين (الأخضر ) ونوى (الأزرق). (AA-AB وبا BB-) تكبير المناطق محاصر في (A، B) α-Actinin (أحمر) وsarcomeric الميوسين (الخضراء). طبع بإذن من 8. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهندسة من الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة لاستخدام كنموذج المرض، لفحص المخدرات، في الطب التجديدي وإنتاج اللحوم. ومع ذلك، فإن المتطلبات لهذه التطبيقات تختلف. اخترنا العمل مع مجموعة من الكولاجين وmatrigel، لأن الكولاجين يسمح لمحاذاة الخلية ولأن الخلايا الاصلية myoblast تتطلب وجود بروتينات الغشاء القاعدي على النحو المستمد تحديده في دراسات سابقة 2D 12. وعلاوة على ذلك، تم اختبار المواد الهلامية الليفين في مختبرنا ويبدو لا لدعم الخلايا الاصلية C2C12 وmyoblast كما يفعل خليط من الكولاجين و™ Matrigel وخاصة لا تؤدي إلى الضغط الأنسجة 14. وقد استخدم هذا النموذج كما هو موضح هنا بالفعل في دراسات حول الأضرار قرحة الضغط أثناء استخدام خط الخلية 15. لتطبيقات الطب التجديدي، وترجمة للخلايا البشرية الفضائية في الآونة الأخيرة بذلت 6،16. وبالإضافة إلى ذلك،كمصدر بديل للاستهلاك اللحوم التقنية عدد 1 امكانات كبيرة. في رأينا إلا أن التكنولوجيا الحالية يحتاج للتقدم إلى المرحلة التالية لمواصلة استخدامها في العيادة وكذلك للاستهلاك. على سبيل المثال، التفريق يتوقف عند مرحلة حديثي الولادة في جميع أنحاء والإنتاج أيضا قوة أقل بكثير من العضلات تنتج في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن يمكن تنفيذها الخلايا الجذعية الجرذان والفئران والإنسان في بنيات 3D، والعزلة وخاصة لم يتم وضع التمايز والنضج لحيوانات المزرعة الخلايا الجذعية المستمدة العضلات هذا الحد حتى الآن 1. أيضا، ليتم القضاء على استخدام احتياجات Matrigel والحيوان مصل المستمدة 1. لتعزيز التطبيق في الطب التجديدي، وحجم الأنسجة لابد من زيادة، ويتطلب (الجدد) الأوعية الدموية واستخدام نظم رذاذ مفاعل حيوي للتغلب على الأكسجين والمغذيات القيود نشر. بعض الدراسات الأولية على الأوعية الدموية الصغيرة يبني حتم القيام به افي في السنوات الماضية 9،17،18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
كان الكتاب أن أشكر Yabin وو لزراعة الأنسجة المعروضة في الشكل 2، التقاط الصورة من قبل بارت فان Overbeeke. والدعم المالي لعمل SenterNovem، ومنحة ISO 42022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
