مناديل الهندسة العضلات الهيكلية من الفئران الخلايا الاصلية Myoblast وتطبيق تحفيز الكهربائية
Summary
المهندسة الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة في مجال الطب التجديدي، ونموذج المرض وأيضا كمصدر بديل للحوم. نحن هنا وصف الهندسية لبناء العضلات، في هذه الحالة من خلايا فأر السلف myoblast، والتحفيز من قبل النبضات الكهربائية.
Abstract
ويمكن استخدام هندسة الأنسجة العضلية لأغراض مختلفة، والتي تشمل إنتاج أنسجة لاستخدامها كنموذج المرض في المختبر، على سبيل المثال لدراسة التقرحات الناتجة عن الضغط، للطب التجديدي وكبديل اللحوم 1. تم إجراء المرة الأولى التي يبلغ يبني العضلات 3D قبل سنوات عديدة والرواد في مجال Vandenburgh هي وزملاؤها 2،3. التقدم المحرز في هندسة الأنسجة العضلية ليست سوى نتيجة من مكاسب واسعة في معرفة العوامل البيوكيميائية، والخلايا الجذعية والخلايا الاولية، ولكن هي في مقرها بصفة خاصة على الخبرات المكتسبة من قبل الباحثين أن العوامل المادية تلعب دورا أساسيا في السيطرة على سلوك الخلية و الأنسجة التنمية. دولة من بين الفن العضلات الهندسة يبني تتكون حاليا من يبني هيدروجيل الخلية بالسكان. في مختبرنا هذه تتكون عادة من الفئران الخلايا الاصلية myoblast، معزولة عن الفئران عضلات الأطراف الخلفية أو خلية myoblast خط الفئران C2C12، ميلxed مع خليط من الكولاجين / Matrigel ومطلي بين نقطتين ترسيخ، ومحاكاة الأربطة العضلية. ويمكن اعتبار الخلايا الأخرى أيضا، مثل خطوط الخلايا البديلة مثل الفئران myoblasts L6 4، الوليد خلايا العضلات السلف المستمدة 5، الخلايا المشتقة من الأنسجة العضلية الكبار من الأنواع الأخرى مثل 6 أو بفعل الإنسان حتى الخلايا الجذعية المحفزة (خلايا الجذع) 7 . انقباض الخلايا يسبب محاذاة الخلايا على طول المحور الطويل للبناء 8،9 والتمايز للخلايا العضلات السلف بعد حوالي أسبوع واحد من الثقافة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق التحفيز الكهربائي تعزيز عملية التمايز إلى حد ما 8. بسبب حجمها محدود (8 × 2 × 0.5 مم) ويمكن تحليل الأنسجة باستخدام المجهر متحد البؤر كاملة لرصد جدوى مثل تمايز الخلايا والمواءمة. اعتمادا على تطبيق معين متطلبات engineeسوف تختلف الأنسجة العضلية الحمراء، واستخدام مثل للطب التجديدي يتطلب رفع مستوى حجم الأنسجة والأوعية الدموية، في حين ليكون بمثابة ترجمة لحوم بديلة الأنواع الأخرى أمر ضروري.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهندسة من الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة لاستخدام كنموذج المرض، لفحص المخدرات، في الطب التجديدي وإنتاج اللحوم. ومع ذلك، فإن المتطلبات لهذه التطبيقات تختلف. اخترنا العمل مع مجموعة من الكولاجين وmatrigel، لأن الكولاجين يسمح لمحاذاة الخلية ولأن الخلايا الاصلية myobla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان الكتاب أن أشكر Yabin وو لزراعة الأنسجة المعروضة في الشكل 2، التقاط الصورة من قبل بارت فان Overbeeke. والدعم المالي لعمل SenterNovem، ومنحة ISO 42022.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipettes | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 – 1,1 mm | |
| Pasteur pipette* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 – 1,6 mm | |
| Pasteur pipette | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
