Summary
Tejido muscular Engineered tiene un gran potencial en medicina regenerativa, como modelo de la enfermedad y también como una fuente alternativa para la carne. Aquí se describe la ingeniería de una construcción de músculo, en este caso a partir de células progenitoras de mioblastos de ratón y la estimulación por impulsos eléctricos.
Abstract
Engineered tejidos musculares se pueden utilizar para diferentes propósitos, que incluyen la producción de tejidos para su uso como un modelo de enfermedad in vitro, por ejemplo, para estudiar las úlceras por presión, para la medicina regenerativa y como una alternativa de la carne 1. Las primeras construcciones del músculo informaron 3D se han hecho desde hace muchos años y pioneros en el campo son Vandenburgh y sus colegas 2,3. Los avances en la ingeniería de los tejidos musculares no son sólo el resultado de la ganancia enorme en el conocimiento de los factores bioquímicos, células madre y células progenitoras, pero en especial basada en los conocimientos adquiridos por los investigadores que los factores físicos juegan un papel esencial en el control del comportamiento de las células y tejido de desarrollo. State-of-the-art músculo ingeniería construye actualmente consisten en construcciones de hidrogel de células pobladas. En nuestro laboratorio éstas generalmente constan de células mioblastos murinos progenitoras, aislado de músculos de las extremidades traseras murinos o una línea celular de mioblastos de ratón C2C12, millasjado con una mezcla de colágeno / Matrigel y se sembraron entre dos puntos de anclaje, imitando los ligamentos musculares. Otras células pueden ser considerados también, por ejemplo, líneas celulares alternativas tales como mioblastos de rata L6 4, 5 neonatales musculares derivadas de células progenitoras, células derivadas de tejidos musculares adultos de otras especies, tales como humano 6 o incluso células madre pluripotentes inducidas (células iPS) 7 . Contractilidad celular provoca la alineación de las células a lo largo del eje largo de la construcción de 8,9 y la diferenciación de las células progenitoras de músculo después de aproximadamente una semana de cultivo. Además, la aplicación de la estimulación eléctrica puede mejorar el proceso de diferenciación, hasta cierto punto 8. Debido a su tamaño limitado (8 x 2 x 0,5 mm) del tejido completa se pueden analizar utilizando microscopía confocal para controlar la viabilidad por ejemplo, la diferenciación celular y la alineación. Dependiendo de la aplicación específica de los requisitos para la ingetejido muscular rojo variarán, por ejemplo, uso para la medicina regenerativa requiere la ampliación de tamaño del tejido y la vascularización, mientras que para servir como una traducción alternativa de la carne de otras especies es necesario.
Protocol
1. Cultura de mioblastos murinos células progenitoras o células C2C12
- Aislar las células de acuerdo con el protocolo publicado inicialmente por Shefer y colegas 10 y más tarde adaptado por Collins et al. 11 y Boonen et al. 12 y almacenarlas en nitrógeno líquido. Esto requiere ratones, por ejemplo C57Bl / 6. Los métodos alternativos se utilizan en otros laboratorios, por ejemplo, un método publicado en Journal of experimentos visualizados por Li Y et al. 13. Para los reactivos y el equipo que se hace referencia a la tabla de la página 7 y 8. Desde el músculo de un ratón que generalmente obtener suficientes células para criopreservar aproximadamente 20 viales en nitrógeno líquido. A continuación, se inicia el protocolo de descongelar las células del almacenamiento en nitrógeno líquido.
- Colocar las células de 1 vial en un 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) matraz de cultivo de tejido recubierto y se añade medio de crecimiento (GM) que consiste en (335 ml DMEM avanzada, 100 ml bovin fetale suero (FBS), 50 ml HS, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de extracto de embrión de pollo (CEE)).
Nota: la capa por 2 horas a temperatura ambiente y eliminar el Matrigel por aspiración.
- Subcultura de las células aproximadamente 1:03 cada 3 días.
Esto significa: el día 3: Células paso de un 2 a 25 cm a 75 cm 2 frasco, en el día 6: Células pasaje de un 75 cm 2 frasco a dos 150 cm 2 frascos (con 30 min preplating en frascos sin recubrimiento). El día 9 transferencia de un matraz de 150 cm 2 a 1 triple 150 cm 2 matraz, o si no está disponible a tres matraces de 150 cm 2 (si es necesario la presiembra de nuevo dependiendo del fenotipo de las células). En el día 12 las células están listas para la siembra en una construcción de músculo.
Notas: - Por triples 150 cm 2 el número de células será de aproximadamente 4,5 x 10 6 células.
- Utilice víals de diferentes aislamientos de mezclarlos para obtener una población mixta de células en el momento de la siembra.
Nota: Si decide no trabajar con células primarias, C2C12 mioblastos son una buena alternativa.
2. Ingeniería de tejidos del músculo esquelético
- Preparar pegamento de silicona mezclando el "elastómero" con el "agente de curado" (10:1). Cortar + / - 5 mm segmentos cuadrados de velcro con una cara triangular (casa-como la forma, la figura 1). Pegamento el Velcro en los pocillos de una placa de cultivo de 6-así en un espacio de aproximadamente 12 mm entre los cuadrados.
Notas: - Utilice sólo el lado suave del velcro y la cara hacia arriba el lado este.
- Asegúrese de que los tejados se enfrentan entre sí.
- Sólo cubrir el velcro con pegamento de silicona, no se extienden a lo largo de la cola también.
- Para la estimulación eléctrica posterior es importante hacer coincidir los constructos en dirección vertical del pozo plcomió (a lo largo del eje largo).
- Deje secar durante la noche en horno de vacío, no se calienta, principalmente para eliminar burbujas de aire. Esterilizar mediante la adición de 70% de EtOH a los pocillos e incubar durante 15 min. Enjuagar 3 veces con PBS y sometido a UV durante 15 min. Eliminar todo PBS de los pocillos y el Velcro y el lugar en la incubadora hasta su uso.
- Descongelar solución Matrigel en la nevera y preparar la solución de colágeno a la concentración deseada poco antes de hacer los constructos 3D. Se diluye el stock de colágeno con estéril ácido acético 0,02% (concentración final 3,2 mg / ml).
Nota: dejar todo en hielo.
- Tripsinizar las células, resuspender en GM y contar. Deja células en tubo de centrífuga en la incubadora.
- Agregue la cantidad deseada de solución de colágeno valores para el número de construcciones que quieres hacer a un tubo (de acuerdo a la Tabla 1), añadir 0,5 M de NaOH a la solución de colágeno hasta que una luz colo rosar indica un pH de 7,5. Mezclar suavemente pipeteando arriba y abajo y evitar la formación de burbujas. A continuación, añadir el Matrigel y mezclar muy suavemente pero a fondo. Por último, agregue el GM a la mezcla de colágeno / Matrigel (para las cantidades apropiadas véase el cuadro 1).
Notas: - Realice cada paso en el hielo! Matrigel y colágeno fácilmente gel a temperatura creciente.
- Cuidado con que el color en realidad es de color rosa! Un aumento de pH también inducir gelificación rápida.
- La concentración final de colágeno: 1,6 mg / ml.
- Centrifugar la cantidad deseada de las células a 1.000 rpm durante 5 min y eliminar el sobrenadante.
Nota: - En función de la actividad de las células el número de células por construir necesario ajustar. Típicamente, el número de células se encuentra entre 750.000 y 1.250.000 células por constructo.
- Use un poco de la mezcla de gel para resuspender el pellet celulary transferir las células a la mezcla restante y mezclar a fondo, pero sin introducir burbujas de aire.
- Tomar las placas precalentadas fuera de la incubadora y la pipeta 0,35 -0,4 ml de la mezcla de células-gel en la primera Velcro. A continuación, comienzan a pipetear la mezcla desde el centro entre los sitios de unión y se extienden hasta el Velcro. Por último, utilizar el resto de gel para llenar la brecha entre los dos anclajes de Velcro y la pipeta alrededor de las piezas de velcro.
- Revise cuidadosamente después de 5-10 minutos si los geles son lo suficientemente sólido como para ser transferidos, es decir, golpear suavemente los platos e inspeccionar visualmente si el gel es rígido. Si es así, coloque cuidadosamente los platos en una incubadora. Por lo general, pueden ser recogidos después de diez minutos. Entonces, después de 1-2 horas, suavemente superponer cada gel con 4 ml de GM caliente.
Nota:-No haga movimientos vigorosos al manipular las placas.
- Reemplace GM por medio de diferenciación (medio de crecimientosin extracto de embrión de pollo) a las 24 h, y sustituirlo por un nuevo medio cada 2-3 días. En el día 7 que debería haber obtenido fibras musculares maduras orientadas, como se puede evaluar con la tinción para el desarrollo estriación transversal de las fibras musculares fusionados.
3. Estimulación eléctrica
- Esterilizar los electrodos de la placa de ionoptix (véase la tabla de reactivos y equipos) antes de su uso con 70% de etanol y posteriormente se seca bajo UV en una cabina de seguridad. Colocar la placa con unos electrodos sobre la placa de cultivo con las construcciones y cubre con la tapa de la placa de cultivo y la transferencia a una incubadora. Conecte el Ionoptix C-pacer con los cables adecuados.
Nota: Los electrodos se colocan en paralelo junto a la construcción de músculo (Figura 2).
- Aplicar el protocolo de estimulación como se esperaba.
Nota: Por lo general, utilizan 4 V / cm,Pulsos de 6 ms a una frecuencia de 2 Hz. Cambiar medio de cultivo cada 24 horas durante la estimulación.
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Representative Results
El producto final será constructos musculares, como se indica en la Figura 3. El tamaño del tejido será de aproximadamente 8 mm de largo, 2 mm de ancho y 0,5 mm de espesor. La estimulación eléctrica durante la diferenciación cambiará la expresión de las isoformas de cadena pesada de miosina, pero no mejoran en gran medida el proceso de diferenciación inducida por el medio de diferenciación 8, pero la estimulación eléctrica se puede aplicar también al final del proceso para comprobar la funcionalidad del músculo , porque un músculo con sarcómeros plenamente desarrollados serán capaces de contratar a un impulso eléctrico.
Diferenciación y maduración también puede ser analizado mediante PCR cuantitativa para la evaluación de la expresión génica y la tinción para los marcadores de maduración o desarrollo muscular estriado transversal (por ejemplo, la tinción para alfa actinina) en cualquiera de las secciones hechas a partir de los tejidos o muestras enteras de montaje tejido teñido. Muscle maduración y diferenciación relaciónTed y genes de expresión de cadena pesada de miosina incluyen MyoD por ejemplo, miogenina, MFR4 y MLP, y MYH 1, 2, 4 y 8 8. La prueba de que el tejido muscular que se forma de hecho es el tejido muscular, con base en la expresión génica, coloraciones de inmunohistoquímica y la inducción contracción por la estimulación eléctrica, se ha publicado previamente y una figura 8 con manchadas secciones transversales de los tejidos musculares realizados a partir de células progenitoras y células mioblastos C2C12 a partir de este papel se muestra en la Figura 4.
| Solución | Volumen (si hace 10 músculos) en l |
| El colágeno (3,2 mg / ml, se diluyó con 0,02% de ácido acético) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 M) | 10 (0.2%) |
| Matrigel | 430 (8,6%) |
| Crecimiento medio | 2.000 (39,9%) |
| total | 5010 (debería bastar con lo suficiente para derramar y pipeteado pérdida) |
Tabla 1. Mezcla de células y de gel para la generación de un músculo de ingeniería tisular construir.
Figura 1. Cortar los trozos de velcro.
Figura 2. Un cuadro tomado de la parte inferior de un músculo construir en un pocillo de una placa de 6-y que muestra la colocación de los electrodos. Los electrodos (indicado con las flechas blancas) se colocan paralelas a los constructos musculares.
Figura 3. Un tejidodiseñados músculo en entre dos piezas de Velcro en una placa de cultivo de 6 pocillos.
Figura 4. Ejemplos típicos de estrías cruzadas en C2C12 (A) y MPC (B) en ingeniería de tejidos del músculo esquelético. Las secciones congeladas de mBAMs no estimulados (día 8 de diferenciación) se tiñeron para sarcoméricas α-actinina (rojo), miosina sarcomérica (verde ) y los núcleos (azul). (Aa y Ba-Ab Bb-) Aumentos de áreas encuadradas en (A, B) α-actinina (rojo) y sarcoméricas miosina (verde). Reproducido con permiso del 8. Haga clic aquí para ampliar la figura.
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Discussion
La ingeniería de tejidos musculares tiene un gran potencial para el uso como un modelo de enfermedad, para la selección de fármacos, en medicina regenerativa y la producción de carne. Sin embargo, los requisitos para estas aplicaciones varían. Elegimos trabajar con una combinación de colágeno y Matrigel, colágeno porque permite la alineación celular y porque las células progenitoras de mioblastos requieren la presencia de proteínas de la membrana basal derivados como se determinó en estudios previos de 2D 12. Además, los geles de fibrina se han probado en nuestro laboratorio y parece que no soportan las células progenitoras y mioblastos C2C12 como lo hace la mezcla de colágeno y Matrigel ™ y especialmente no conducen a la compactación del tejido 14. El modelo que se describe aquí se ha utilizado ya en los estudios sobre los daños de úlceras por presión durante el uso de una línea celular 15. Para aplicaciones en medicina regenerativa, la traducción de las células satélite humanos se ha hecho recientemente 6,16. Además,como fuente alternativa para el consumo de carne de la técnica tiene un gran potencial 1. En nuestra opinión, sin embargo, la tecnología actual debe avanzar a una siguiente etapa para promover su uso en la clínica, así como para el consumo. Por ejemplo, la diferenciación se detiene en torno a la etapa neonatal y también la producción de fuerza es mucho menor que un músculo produce in vivo. Además, aunque las células de ratón, rata y humano madre puede ser implementado en los constructos 3D, el aislamiento y, especialmente, la diferenciación y maduración de los animales de granja derivados de células madre de músculo no se desarrolla tan lejos todavía 1. Además, el uso de Matrigel y animal derivados de las necesidades de suero a ser omitido 1. Para promover la aplicación en la medicina regenerativa, el tamaño del tejido tiene que ser aumentada, y requiere (neo) vascularización y el uso de los sistemas de biorreactores de perfusión de superar las limitaciones de nutrientes y oxígeno de difusión. Algunos estudios iniciales sobre la vascularización pequeño h construccionesave se ha hecho en los últimos años 9.17.18.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Yabin Wu para el cultivo de tejidos que se presentan en la Figura 2, la foto fue tomada por Bart van Overbeeke. El trabajo fue apoyado financieramente por SenterNovem, ISO 42022 donación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
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