Summary
Tecido muscular de engenharia tem um grande potencial na medicina regenerativa, como modelo de doença e também como uma fonte alternativa para a carne. Aqui descreve-se a engenharia de uma construção de músculo, neste caso, a partir de células progenitoras, mioblastos de rato e a estimulação por pulsos eléctricos.
Abstract
Tecidos musculares engenharia pode ser utilizado para diversos fins, que incluem a produção de tecidos para utilização como um modelo de doença in vitro, por exemplo, para estudar as úlceras de pressão, para a medicina regenerativa e como uma alternativa a carne 1. As primeiras construções relatados musculares 3D foram feitos há muitos anos e pioneiros no campo são Vandenburgh e colegas 2,3. Avanços na engenharia de tecidos músculo não são apenas o resultado do ganho enorme no conhecimento de fatores bioquímicos, células-tronco e células progenitoras, mas estão em base particular em conhecimentos obtidos por pesquisadores que os fatores físicos desempenham papéis essenciais no controle do comportamento de células e tecidos de desenvolvimento. Estado-da-arte da engenharia muscular constrói atualmente consistem de construções de células-povoadas de hidrogel. No nosso laboratório que geralmente são constituídos por células mioblastos de murino progenitoras isoladas, a partir de murinos músculos dos membros posteriores ou de uma linha celular C2C12 de mioblastos de murino, mixado com uma mistura de colagénio / Matrigel e semeadas entre dois pontos de ancoragem, que imita os ligamentos musculares. Outras células podem ser considerados, bem como, por exemplo, linhas celulares alternativos, tais como os mioblastos L6 de rato neonatal musculares 4, células progenitoras, células derivadas 5 derivadas de tecidos musculares adultas a partir de outras espécies, tais como 6 humana ou células pluripotentes estaminais ainda induzidas (células iPS) 7 . Contractilidade celular faz com que o alinhamento das células ao longo do eixo longitudinal da construção de 8,9 e diferenciação das células progenitoras musculares após cerca de uma semana de cultura. Além disso, a aplicação de estimulação eléctrica pode melhorar o processo de diferenciação, em certa medida 8. Devido ao seu tamanho limitado (8 x 2 x 0,5 mm) do tecido completo pode ser analisada utilizando microscopia confocal para monitorar a viabilidade por exemplo, diferenciação de células e de alinhamento. Dependendo da aplicação específica, os requisitos para a engineetecido muscular vermelho pode variar; por exemplo, utilização em medicina regenerativa requer o escalonamento do tamanho dos tecidos e a vascularização, enquanto para servir como uma tradução alternativa a outras espécies de carne é necessário.
Protocol
1. Cultura de Células de mioblastos de murino progenitoras ou células C2C12
- Isolar as células de acordo com o protocolo inicialmente publicado por Shefer e colegas 10 e posterior adaptada por Collins et al. 11 e Boonen et al. 12 e armazená-los em azoto líquido. Isto requer ratos, por exemplo, C57BL / 6. Os métodos alternativos são usadas em outros laboratórios, por exemplo, um método publicado em Journal of Experiments visualizadas por Li Y et al. 13. Para os reagentes e equipamentos que são referidos na tabela da página 7 e 8. A partir do músculo de um rato irá geralmente obter células suficientes para criopreservar cerca de 20 frascos em azoto líquido. Em seguida, inicia o protocolo de descongelar as células a partir da armazenagem de azoto líquido.
- Colocar as células a partir de um frasco para um 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) frasco de cultura de tecido revestido e adicionar meio de crescimento (GM) que consiste em (335 ml de DMEM avançada, 100 ml fetal bovine soro (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicilina / estreptomicina, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de extracto de embriões de galinha (CEE)).
Nota: revestimento durante 2 h à temperatura ambiente e remover o Matrigel por aspiração.
- Subcultura das células de aproximadamente 1:03 a cada 3 dias.
Isso significa que: no dia 3: células passagem de um 25 centímetros 2 para um frasco de 75 cm 2, no dia 6: as células de passagem de um frasco de 75 cm 2 para dois 150 centímetros 2 frascos (com 30 min preplating em frascos sem revestimento). No dia 9 de transferência de um balão de 150 centímetros 2 a 1 150 centímetros triplo Frasco de 2, ou se não estiver disponível a três frascos de 150 centímetros 2 (se necessário preplate novamente dependendo do fenótipo das células). No dia 12, as células estão prontas para semear em uma construção muscular.
Notas: - Por triplo 150 cm 2, o número de células será de aproximadamente 4,5 x 10 6 células.
- Use vials de isolamentos diferentes para misturá-las para se obter uma população mista de células na altura da sementeira.
Nota: Se você optar por não trabalhar com células primárias, mioblastos C2C12 são uma boa alternativa.
2. Engenharia de tecidos músculo esquelético
- Prepare cola de silicone misturando-se o "elastómero" com o "agente de cura" (10:1). Cortar + / - 5 mm segmentos quadrados de velcro com um lado triangular (casa-como a forma, a Figura 1). Cola o velcro para os poços de uma placa de cultura de 6 poços em um espaço de aproximadamente 12 mm entre os quadrados.
Notas: - Só use o lado macio do velcro e enfrentar esta para cima o lado.
- Certifique-se de que os telhados se enfrentam.
- Apenas cobrir o velcro com cola de silicone, não espalhar cola por todo o bem.
- Para a estimulação elétrica depois é relevante para alinhar as construções na direção vertical do pl bemcomeu (ao longo do eixo).
- Deixa-se secar durante a noite num forno de vácuo, não aquecida, principalmente para remover as bolhas de ar. Esterilizar por adição de EtOH a 70% aos poços e incubar durante 15 min. Enxaguar 3x com PBS e colocadas sob UV, durante 15 minutos. Remover todo o PBS a partir dos poços e o Velcro e coloque na incubadora até à sua utilização.
- Descongelar Matrigel solução no frigorífico e preparar a solução de colagénio para a concentração desejada, pouco antes de fazer as construções em 3D. Dilui-se o colagénio de estoque com ácido acético a 0,02% estéril (concentração final de 3,2 mg / ml).
Nota: deixar tudo no gelo.
- Tripsinizar as células, ressuspender em GM e contagem. Deixar as células num tubo de centrifugadora na incubadora.
- Adicionar a quantidade desejada de solução de colagénio para o número de construções que pretende fazer a um tubo (de acordo com a Tabela 1), adicionar NaOH 0,5 M a esta solução de colagénio até uma cor de rosa claro color é o que indica um valor de pH de 7,5. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo e evitar a formação de bolhas. Em seguida, adicione o Matrigel e misture muito delicadamente mas completamente. Por fim, adicionar o GM-se à mistura de colagénio / Matrigel (para as quantidades apropriadas ver Tabela 1).
Notas: - Execute cada passo no gelo! Matrigel e colagénio será prontamente gel à temperatura crescente.
- Lembre-se que a cor realmente é rosa! Um aumento no pH também induzir a gelificação rápida.
- A concentração final de colagénio: 1,6 mg / ml.
- Centrifugar a quantidade desejada de células a 1.000 rpm durante 5 minutos e remove-se o sobrenadante.
Nota: - Consoante a actividade das células do número de células por construção necessita de ser ajustada. Tipicamente, o número de células situa-se entre 750.000 e 1.250.000 células por construção.
- Utilizar parte da mistura de gel para ressuspender o sedimento celulare transferir as células para a mistura restante e misturar cuidadosamente, mas sem a introdução de bolhas de ar.
- Levar as placas pré-aquecidos bem fora da incubadora e pipeta 0,35 -0,4 ml da mistura de células-gel na primeira Velcro. Então, começar a pipetar a mistura a partir do centro, entre os locais de fixação e estender-se ao Velcro. Finalmente, a utilização do restante do gel para encher o espaço entre as duas escoras de velcro e de pipeta em torno dos pedaços de velcro.
- Verifique cuidadosamente após 5-10 min se os géis são sólidos o suficiente para ser transferido, ou seja, bata suavemente os pratos e inspecionar visualmente se o gel é rígida. Se assim for, coloque cuidadosamente os pratos em uma incubadora. Geralmente, eles podem ser recolhidos depois de dez minutos. Em seguida, após 1-2 horas, gentilmente sobrepor cada gel com 4 mL de GM quente.
Nota:-Não faça movimentos vigorosos ao manusear as placas.
- Substitua GM por meio de diferenciação (meio de crescimentosem extrato de embrião de galinha), após 24 horas, e substituir por meio fresco a cada 2-3 dias. No dia 7 deverá ter obtido maduros fibras musculares orientadas, como pode ser avaliado com o desenvolvimento da coloração por estrias cruzadas nas fibras musculares fundidos.
3. Estimulação Elétrica
- Esterilizar os eléctrodos a partir da placa ionoptix (ver tabela de reagentes e equipamento) antes da utilização, com etanol a 70% e, subsequentemente, seco sob UV numa câmara de segurança. Colocar a placa com os eléctrodos para a placa de cultura com as construções e cobrir com a tampa da placa de cultura e transferência para a incubadora. Conecte o Ionoptix C-pacer com os cabos adequados.
Nota: Os eléctrodos são colocados em paralelo ao lado da construção muscular (Figura 2).
- Aplicar o protocolo de estimulação, como previsto.
Nota: Nós usamos geralmente 4 V / cm,Pulsos 6ms com uma frequência de 2Hz. Alterar o meio de cultura a cada 24 h durante a estimulação.
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Representative Results
O produto final será construções musculares, como indicado na Figura 3. O tamanho do tecido será de aproximadamente 8 mm de comprimento, 2 mm de largura e 0,5 mm de espessura. A estimulação eléctrica durante a diferenciação vai alterar a expressão das isoformas de cadeia pesada de miosina, mas não aumentar grandemente o processo de diferenciação, tal como induzida pelo meio de diferenciação 8, mas a estimulação eléctrica também pode ser aplicado no final do processo para verificar a funcionalidade do músculo , porque com um músculo sarcômeros plenamente desenvolvidos será capaz de contrair após um impulso eléctrico.
Diferenciação e maturação pode também ser analisada utilizando PCR quantitativa para a avaliação da expressão do gene e de coloração para marcadores de músculo de maturação ou desenvolvimento de estrias cruzadas (por exemplo, para a coloração de alfa actinina) nas duas secções feitas a partir de tecidos ou integrais de montagem amostras de tecido manchadas. Maturação muscular e relação diferenciaçãoted genes e expressão de miosina de cadeia pesada inclui MyoD eg, miogenina, MFR4 e MLP e MYH 1, 2, 4 e 8 8. A prova de que o tecido do músculo, que é formado de facto é o tecido muscular, com base na expressão do gene, colorações imunohistoquímicas e indução de contração por estimulação eléctrica, foi publicada previamente 8 e uma figura com coradas secções transversais dos tecidos musculares feitos a partir de células progenitoras e mioblastos C2C12 células a partir deste papel é apresentado na Figura 4.
| Solução | Volume (se fazendo 10 músculos) em ul |
| O colagénio (3,2 mg / ml, diluído com 0,02% de ácido acético) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 M) | 10 (0,2%) |
| Matrigel | 430 (8,6%) |
| Meio de crescimento | 2.000 (39,9%) |
| total | 5010 (deve bastar com o suficiente para derramar e pipetagem perda) |
Tabela 1. Mistura de células e de gel para a produção de um músculo da engenharia de tecidos construir.
Figura 1. Corte os pedaços de velcro.
Figura 2. A imagem tomada a partir do fundo de um músculo em construir um poço de uma placa de 6 poços que mostra a colocação dos eléctrodos. Os eléctrodos (indicado com as setas brancas) são colocados em paralelo com os construtos de músculo.
Figura 3. Um tecidoengenharia muscular entre dois pedaços de velcro em uma placa de cultura de 6 poços.
Figura 4. Exemplos típicos de estrias transversais em C2C12 (A) e MPC (B), em engenharia de tecidos do músculo esquelético. Secções congeladas de mBAMs não estimuladas (dia 8 de diferenciação) foram coradas para sarcomérica α-actinina (vermelho), sarcomérica miosina (verde ) e núcleos (azul). (Aa-Ab e Ba-Bb) ampliações de áreas em caixas (A, B) α-actinina (vermelho) e sarcomérica miosina (verde). Reproduzido com permissão da 8. Clique aqui para ver maior figura.
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Discussion
A engenharia de tecidos musculares tem um grande potencial para a utilização como um modelo de doença, para a triagem de drogas, em medicina regenerativa e para a produção de carne. No entanto, os requisitos para estas aplicações variar. Optou-se por trabalhar com uma combinação de colagénio e de matrigel, porque permite o alinhamento de colagénio e células porque as células progenitoras mioblastos requerem a presença de proteínas de membrana basal derivadas, tal como determinado em estudos anteriores 2D 12. Além disso, os geles de fibrina foram testados no nosso laboratório e não parecem suportar as células progenitoras C2C12 de mioblastos e como o faz a mistura de colagénio e de Matrigel ™ e, especialmente, não conduzem a compactação de tecidos 14. O modelo, tal como descrito aqui foi usada já em estudos sobre os danos de úlceras de pressão durante a utilização de uma linha de células 15. Para aplicações de medicina regenerativa, a tradução para as células satélites humanos tem sido feito recentemente 6,16. Além disso,como uma fonte alternativa para o consumo de carne a técnica tem grande potencial 1. Em nossa opinião, no entanto, a tecnologia actual tem de avançar para a próxima etapa para promover a sua utilização na prática clínica, bem como para o consumo. Por exemplo, a diferenciação pára em torno da fase neonatal e também a produção de força é muito menor do que um músculo produz in vivo. Além disso, embora as células estaminais ratinho, rato e humano pode ser implementada nas construções em 3D, o isolamento e, especialmente, a diferenciação e maturação de animais de produção de células-tronco derivadas do músculo não se desenvolveu tão longe ainda 1. Além disso, a utilização de necessidades derivadas Matrigel e animal de soro de ser omitida 1. Para reforçar ainda mais a aplicação em medicina regenerativa, o tamanho do tecido tem de ser aumentada, e requer (neo) vascularização e utilização de sistemas de bioreactores de perfusão para ultrapassar as limitações de difusão de oxigénio e nutrientes. Alguns estudos iniciais sobre a pequena vascularização construções hav sido feito nos últimos anos, 9,17,18.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores querem agradecer Yabin Wu para cultura dos tecidos apresentados na Figura 2, a foto foi tirada por Bart van Overbeeke. O trabalho foi financiado pela SenterNovem, ISO 42022 concessão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
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