Summary
Engineered muskelvæv har et stort potentiale i regenerativ medicin, som sygdommen model og også som en alternativ kilde til kød. Her beskriver vi konstruktionen af en muskel-konstruktion, i dette tilfælde fra muse myoblast progenitorceller, og en stimulering af elektriske impulser.
Abstract
Manipuleret muskelvæv kan anvendes til flere formål, der omfatter fremstilling af væv til anvendelse som en sygdomsmodel in vitro, fx til at studere tryksår, for regenerativ medicin og som kød alternativ 1. De første rapporterede 3D muskel konstruktioner er blevet gjort for mange år siden og pionerer på området er Vandenburgh og kolleger 2,3. Fremskridtene i muskelvæv engineering er ikke kun resultatet fra det store gevinst i viden om biokemiske faktorer, stamceller og stamceller, men er især baseret på indsigt opnået af forskere, at fysiske faktorer spiller afgørende roller i kontrollen af cellernes adfærd og vævsudvikling. State-of-the-art manipuleret muskel konstruktioner består i øjeblikket af celle-befolkede hydrogel konstruktioner. I vores laboratorium Disse består af murine myoblast progenitorceller, isoleret fra murine bagben muskler eller en murin myoblast cellelinje C2C12, miXED med en blanding af collagen / Matrigel og udpladet mellem to forankringspunkter, efterligne den muskel ledbånd. Andre celler kan betragtes som godt, f.eks alternative cellelinjer, såsom L6-myoblaster fra rotter 4, neonatal muskel progenitorceller 5, celler afledt fra voksne muskelvæv fra andre arter, såsom human 6 eller endda induceret pluripotente stamceller (iPS celler) 7 . Cellesammentrækningsevne bevirker tilpasning af cellerne langs den lange akse af konstruktionen 8,9 og differentiering af muskel progenitorceller efter cirka en uge i kultur. Endvidere kan anvendelsen af elektrisk stimulering forbedre processen til differentiering til en vis grad 8. På grund af sin begrænsede størrelse (8 x 2 x 0,5 mm) den komplette væv kan analyseres ved hjælp af konfokal mikroskopi til at overvåge fx levedygtighed, differentiering og cellejustering. Afhængigt af den specifikke anvendelse kravene til engineerøde muskelvæv vil variere, fx anvendelse til regenerativ medicin kræver opskalering af væv størrelse og vaskularisering, medens at tjene som en kød alternativ oversættelse til andre arter er nødvendig.
Protocol
1. Kultur af murine myoblast progenitorceller eller C2C12-celler
- Isolere celler ifølge protokollen oprindeligt offentliggjort af Shefer og kolleger 10 og senere tilpasset ved Collins et al. 11 og Boonen et al. 12 og lagre dem i flydende nitrogen. Dette kræver mus, f.eks C57BL / 6. Alternative metoder anvendes i andre laboratorier, fx en metode offentliggjort i Journal of visualiseret Eksperimenter med Li Y et al. 13. For de reagenser og udstyr du bliver henvist til tabellen på side 7 og 8. Fra musklen fra en mus vil generelt opnå tilstrækkeligt mange celler til at kryopræservere omkring 20 hætteglas i flydende nitrogen. Næste, vi starter protokollen at tø cellerne fra den flydende nitrogen opbevaring.
- Placere cellerne fra 1 hætteglas i en 25 cm2 Matrigel (1 mg / ml) overtrukket vævsdyrkningskolbe og tilsæt vækstmedium (GM) bestående af (335 ml DMEM avancerede, 100 ml føtalt bovine serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml L-glutamin, 5 ml kyllingefoster ekstrakt (CEE)).
Bemærk: coat i 2 timer ved stuetemperatur og fjerne Matrigel ved aspiration.
- Subkultur cellerne cirka 01:03 hver 3 dage.
Betyder: på dag 3: Passage celler fra en 25 cm 2 til en 75 cm2 flaske, på dag 6: passage-celler fra en 75 cm2 kolbe med to 150 cm2 kolber (med 30 min preplating i ikke-overtrukne kolber). På dag 9 transfer en 150 cm2 flaske til 1 triple 150 cm2 kolbe, eller utilgængelig til tre 150 cm2 kolber (om nødvendigt præplade igen afhængigt af fænotypen af cellerne). På dag 12 er cellerne klar til podning i en muskel konstruktion.
Bemærkninger: - Per triple 150 cm2 antallet af celler vil være cirka 4,5 x 10 6 celler.
- Brug vials fra forskellige isolationer at blande dem til opnåelse af en blandet population af celler på tidspunktet for podning.
Bemærk: Hvis du vælger ikke at arbejde med primærelementer, C2C12 myoblaster er et godt alternativ.
2. Engineering skeletmuskel væv
- Forbered silicium lim ved at blande "elastomer" med "hærdningsmiddel" (10:1). Skåret + / - 5 mm kvadratiske segmenter af Velcro med en trekantet side (hus-lignende form, figur 1). Lime Velcro i brøndene på en 6-brønds dyrkningsplade med et mellemrum på cirka 12 mm mellem ruderne.
Bemærk: - Brug kun den bløde side af velcro og står denne side opad.
- Sørg for, at tagene vender mod hinanden.
- Kun dække Velcro med silicium lim, ikke spredes lim hele godt.
- For senere elektrisk stimulering er det relevant at tilpasse konstruktioner i lodret retning af brønden plspiste (langs den lange akse).
- Lad det tørre natten over i vakuumovn, ikke opvarmet, primært for at fjerne luftbobler. Steriliseres ved tilsætning af 70% EtOH til brøndene og inkuberes i 15 min. Skyl 3x med PBS og sat under UV i 15 min. Fjern alt PBS fra brøndene og Velcro og placeres i inkubatoren indtil brug.
- Optø Matrigel løsning i køleskabet og forberede kollagenopløsningen til den ønskede koncentration kort før 3D konstruktioner. Fortynd stock collagen med sterilt 0,02% eddikesyre (slutkoncentration 3,2 mg / ml).
Bemærk: overlade alt på is.
- Trypsinisér cellerne, resuspender i GM og tæller. Efterlade celler i centrifugerør i inkubatoren.
- Tilsættes den ønskede mængde kollagen stamopløsning til det antal konstruktioner, der skal foretage i et rør (ifølge tabel 1) tilsættes 0,5 M NaOH til denne kollagenopløsning indtil en lyserød color angiver en pH på 7,5. Bland forsigtigt ved pipettering op og ned og undgå bobledannelse. Tilsæt derefter Matrigel og blandes meget forsigtigt, men grundigt. Tilsæt til sidst GM til Kollagen / Matrigel-blandingen (for de passende mængder se tabel 1).
Bemærkninger: - Udfør hvert trin på is! Matrigel og kollagen vil let gel ved stigende temperatur.
- Pas, at farven faktisk er pink! En stigning i pH vil også inducere hurtig gelering.
- Slutkoncentration af collagen: 1,6 mg / ml.
- Centrifuger den ønskede mængde celler ved 1.000 rpm i 5 minutter og fjern supernatanten.
Bemærk: - Afhængigt af aktiviteten af cellerne antallet af celler pr konstruktion skal justeres. Typisk antallet af celler ligger mellem 750.000 og 1.250.000 celler pr konstrukt.
- Bruge nogle af gelblandingen for at resuspendere cellepelletenog overføre cellerne til den resterende blanding og blandes, men uden at indføre luftbobler.
- Tag de forvarmede brøndsplader ud af inkubatoren og pipetten 0,35 -0,4 ml af den celle-gelblanding i Velcro først. Derefter begynder at pipettere blandingen fra midten mellem bindingssteder og de når til velcro. Endelig kan du bruge resten af gelen til at fylde hullet mellem de to Velcro ankre og pipette omkring Velcro stykker.
- Kontroller omhyggeligt efter 5-10 min, hvis geler er solid nok til at blive overført, dvs bank forsigtigt på de retter og inspicere visuelt hvis gelen er stiv. Hvis det er tilfældet, skal du placere omhyggeligt retter i en inkubator. Normalt kan de blive afhentet efter ti minutter. Derefter, efter 1-2 timer, overlay forsigtigt hver gel med 4 ml varm GM.
Bemærk:-Du må ikke foretage nogen voldsomme bevægelser ved håndtering af pladerne.
- Erstat GM ved differentiation medium (vækstmediumuden kyllingeembryo ekstrakt) efter 24 timer, udskifte og med frisk medium hver 2-3 dage. På dag 7 du burde have fået modne orienterede muskelfibre, som kan vurderes med farvning for cross stribedannelsesfri udvikling i de sammensmeltede muskelfibre.
3. Elektrisk stimulering
- Steriliser elektroderne fra ionoptix pladen (se tabel af reagenser og udstyr) før brug med 70% ethanol og derefter tør under UV i en sikkerhedsskab. Pladen anbringes med elektroderne fast på dyrkningspladen med konstruktionerne og tildækkes med låget fra dyrkningspladen og overførsel til en inkubator. Slut Ionoptix C-pacer med de rigtige kabler.
Bemærk: elektroder er anbragt parallelt ved siden af musklen konstruktion (figur 2).
- Påfør stimulation protokol som forventet.
Bemærk: Vi plejer at bruge 4 V / CM,6 ms impulser med en frekvens på 2 Hz. Ændre dyrkningsmedium hver 24 timer under stimulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slutproduktet vil være muskel konstruktioner som vist i figur 3.. Størrelsen af vævet vil være ca 8 mm lang, 2 mm bred og 0,5 mm tykke. Elektrisk stimulering under differentiering vil ændre ekspressionen af myosin tung kæde isoformer, men ikke i høj grad forbedre differentieringsprocessen som induceres af differentiering medium 8, men elektrisk stimulering kan også anvendes ved afslutningen af processen for at kontrollere funktionaliteten af musklen , idet en muskel med fuldt udviklede sarkomerer vil kunne optage en elektrisk impuls.
Differentiering og modning kan også analyseres ved hjælp af kvantitativ PCR til genekspression evaluering og farvning for muskel modning markører eller cross stribedannelsesfri udvikling (fx farvning for alpha actinin) på enten sektioner fremstillet fra væv eller hele mount farvede vævsprøver. Muskel modning og differentiering forholdted gener og myosin tung kæde udtryk omfatter f.eks MyoD, myogenin, MFR4 og MLP, og MYH 1, 2, 4 og 8 8. Bevis for, at muskelvæv, der er dannet faktisk er muskelvæv, baseret på genekspression, immunhistokemiske farvninger og sammentrækning induktion af elektrisk stimulation, er blevet offentliggjort tidligere 8 og en figur med farvede tværsnit af muskelvæv fremstillet af myoblast progenitorceller og C2C12 celler fra dette papir er vist i fig. 4.
| Opløsning | Volumen (hvis der gøres 10 muskler) i pi |
| Collagen (3,2 mg / ml, fortyndet med 0,02% eddikesyre) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 M) | 10 (0,2%) |
| Matrigel | 430 (8,6%) |
| Vækstmedium | 2000 (39,9%) |
| total | 5010 (burde være tilstrækkeligt med nok til at spilde og pipettering tab) |
Tabel 1. Blanding af celler og gel til dannelse af et væv manipuleret muskel konstruktion.
Figur 1. Skære stykker af velcro.
Figur 2. Et billede taget fra bunden af en muskel konstruktion i en brønd i en 6-brønds plade viser anbringelsen af elektroderne. Elektroderne (vist med hvide pile) er anbragt parallelt med muskel-konstruktioner.
Figur 3. Et vævmanipuleret muskel i mellem to stykker Velcro i en 6-brønds dyrkningsplade.
Figur 4. Typiske eksempler på kryds-riller i C2C12 (A) og MPC (B) i industrielt skeletmuskel væv. Frosne sektioner af ikke-stimulerede mBAMs (dag 8 for differentiering) blev farvet for sarcomerisk α-actinin (rød), sarcomerisk myosin (grøn ) og kerner (blå). (Aa-AB og BA-Bb) forstørrelser af indrammede områder (A, B) α-actinin (rød) og sarcomerisk myosin (grøn). Genoptrykt med tilladelse fra 8. Klik her for at se større figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den teknik af muskelvæv har et stort potentiale for anvendelse som en sygdom model, til drug screening, regenerativ medicin og til kødproduktion. Men kravene til disse applikationer varierer. Vi valgte at arbejde med en blanding af kollagen og Matrigel, fordi collagen tillader cellejustering og fordi myoblast progenitorceller kræver tilstedeværelse af basalmembran afledte proteiner som bestemt i tidligere 2D studier 12. Desuden har fibringeler blevet testet i vores laboratorium og synes ikke at støtte de C2C12 myoblast og progenitorceller, som gør blandingen af collagen og Matrigel ™ og især ikke fører til væv kompaktering 14. Den model, som beskrevet her, allerede er blevet brugt i undersøgelser af tryksår beskadigelse under anvendelse af en cellelinje 15. Til regenerativ medicin anvendelsesområder, har oversættelse til humane satellit celler for nylig blevet gjort 6,16. Desudensom en alternativ kilde til kødforbruget teknikken har et stort potentiale 1. Efter vores mening imidlertid den nuværende teknologi skal videre til et næste trin til at fremme dens brug i klinikken og til forbrug. For eksempel stopper differentiering omkring den neonatale, og desuden force produktionen er meget mindre end en muskel producerer in vivo. Desuden, selv om mus, rotter og humane stamceller kan implementeres i 3D konstruktioner, isolering og især differentiering og modning af husdyr afledt muskel stamceller er ikke udviklet så langt endnu 1. Også anvendelsen af Matrigel og dyr afledte serum behov udelades 1. At fremme anvendelsen i regenerativ medicin, vævet størrelse skal forøges, og kræver (neo) vaskularisering og anvendelse af perfusionsbioreaktor systemer for at overvinde oxygen og næringsstoffer diffusionsbegrænsninger. Nogle indledende vaskularisering undersøgelser af små konstruktioner have blevet gjort i de seneste år 9,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Yabin Wu til dyrkning af væv præsenteret i figur 2, blev billedet taget af Bart van Overbeeke. Arbejdet blev støttet af SenterNovem, tilskud ISO 42.022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
