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Immunology and Infection

Queratitis herpética estromal recurrente en ratones, un modelo para el estudio HSK Humanos

doi: 10.3791/4276 Published: December 18, 2012

Summary

La mayoría de los estudios de la enfermedad corneal herpética utilizar un modelo de infección primaria. Sin embargo, la infección primaria con el virus HSV-1 no suele conducir a la enfermedad humana. Aquí se describe un modelo de la enfermedad herpética recurrente corneal, que más estrechamente imita la enfermedad humana.

Abstract

Enfermedad herpética ocular, denominada queratitis herpética estromal (HSK), es una infección potencialmente cegamiento de la córnea que causa más de 300.000 visitas clínicas cada año para su tratamiento. Entre 1 y 2 por ciento de los pacientes con enfermedad clínica experimentará la pérdida de la visión de la córnea infectada. La gran mayoría de estos casos son el resultado de la reactivación de una infección latente por el herpes simplex virus tipo I y no debido a la enfermedad aguda. Curiosamente, la infección aguda es el modelo más utilizado para estudiar esta enfermedad. Sin embargo, se consideró que un modelo recurrente de HSK sería más un reflejo de lo que ocurre durante la enfermedad clínica. Los modelos animales recurrentes para HSK han empleado tanto en conejos y ratones. La ventaja de los conejos es que experimentan reactivación de la latencia en ausencia de cualquier estímulo conocido. Dicho esto, es difícil de explorar el papel que juegan muchos factores inmunológicos en HSK recurrente debido a que el modelo de conejo no tiene la inmunidadrecursos metodológicos y genéticos que tiene el mouse. Hemos elegido utilizar el modelo de ratón para el HSK recurrente, ya que tiene la ventaja de que hay muchos recursos disponibles y también sabemos que cuando la reactivación se produce debido a la reactivación es inducida por la exposición a la luz UV-B. Hasta el momento, este modelo ha permitido a los laboratorios de usarlo para definir varios factores inmunológicos que son importantes para esta enfermedad. También ha permitido poner a prueba tanto terapéutico y eficacia de la vacuna.

Protocol

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Nota Animal Care: Analgésicos no se utilizan en este modelo ya que son anti-inflamatoria y por lo tanto invalidaría el modelo.

1. Preparación de Virus

  1. Grow HSV-1 en células Vero (80% confluentes) utilizando una dilución inicial de 0,01 multiplicidad de infección (en matraz T-150, a unos 5 x 10 5 unidades formadoras de placa) durante 3-4 días hasta que todas las células han redondea y son desalojados fácilmente pulsando el matraz.
  2. Retire el medio a tubos de centrífuga estériles y se centrifuga en Sorvall Legend RT a 4 ° C y 3.500 rpm durante 15 min. Después de eliminar el sobrenadante (ver 1,3), se resuspende el pellet grande de cada tubo de 50 ml con 5 ml del total de los medios de comunicación. Someter a ultrasonidos durante 1 min en dos ráfagas de 30 seg.
  3. Remover el sobrenadante y poner en 50 ml tubos estériles de Oak Ridge, y centrifugar a 9.000 rpm, durante 1 hora a 4 ° C en un Beckman J2-21 centrífuga. Esto es para producir un pequeño sedimento viral. Eliminar el sobrenadante.
  4. Combine ultrasonidos de 1,2 ingenioh pellet de 1,3 y sonicar de nuevo durante 45 segundos. Centrífuga Sorvall Legend en RT a 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Guardar el sobrenadante. Esto constituye la reserva de virus que se divide en alícuotas y se almacenó a -70 ° C.
  5. Título de virus en células Vero. Por lo general la placa de 10 0 a 10 -8 dilución (cada una siendo una dilución de 10-veces) 2x de 2 conjuntos de dilución separados. La titulación de virus se realiza en placas de 12 pocillos estériles.

2. Infección del ratón

  1. Inyectar cada ratón con 0,1 ml de anestésico cocktail/20 g de peso corporal del ratón (ketamina, 60 mg / kg + xilazina 5 mg / kg que se diluyó en HBSS). Este cóctel se utiliza porque es uno de los medios más seguros de la anestesia cuando se utilizan dosis adecuadas y los efectos de esta droga son de muy corta duración.
  2. Cuando los ratones se anestesian rayar la córnea del ojo derecho con una aguja de calibre 30 utilizando un microscopio de disección para asegurarse de que la córnea no es perforada.
  3. Cada rece ratónIVED una inyección intraperitoneal de 1 ml de suero humano agrupado (Sigma, Temecula, CA; anti-HSV reactividad con una dosis eficaz para el 50% de neutralización viral de 1:800) con el fin de proteger a las córneas de los daños durante la infección primaria.
  4. Número de los ratones con clips para las orejas, ya sea por el oído o punzón.
  5. Después de que todos los ratones se han numerado; utilizando una pipeta 20 l, se infectan cada ojo con 10 6 PFU (5 l). Nos infectar un solo ojo y típicamente el ojo derecho. También ponemos 5 l de HBSS para el otro ojo para mantenerla húmeda mientras están anestesiados. 5 ul es suficiente para mantener la hidratación de los ojos, ya que los procedimientos se realizan en menos de 10 min, y los animales son dosificados con anestésico en consecuencia. La infección se confirmó en muestras de secreciones ratones 3 días después de la infección con un aplicador de algodón estéril que fue hidratado en 1 ml de medio de Vero. Entonces, 100 l se añade a las células Vero cultivadas en placas de 48 pocillos. Estas placas están monitoreando diariamente por efectos citopáticos (CPE).

3. Reactivación de ratones de la latencia

  1. Los ratones son anestesiados por lo menos 5 semanas después de la infección primaria. Cabe señalar que hemos reactivado ratones hasta un año después de la infección primaria y no han observado diferencias significativas en la respuesta.
  2. Una vez anestesiados se colocan TM20 cromato-Vu transiluminador, que emite radiación UV-B en una longitud de onda máxima de 302 nm tal que solamente un solo ojo se expone a la luz UV-B. Cada ratón se expone a la luz mJ 250 cm de UV-B 2.
  3. La reactivación se determinaron en muestras de secreciones ojos con aplicador de algodón estéril que se coloca primero en 1 ml de medio de Vero en el día 0 (antes de la exposición UV-B en el control de excretores espontáneas) y después en los días 1 a 7 después de la irradiación UV-B. El material de frotis se evaluaron como se describe en 2,5). Para aquellos que tienen hisopos virus infeccioso de la cantidad de virus se tituló por un ensayo de placa estándar usando placas de 12 pocillos.
ove_title "> 4. Evaluación Clínica

  1. Los ratones se evalúan para la enfermedad de ojo clínico de un observador enmascarado utilizando un microscopio binocular de disección.
  2. La opacidad corneal se califica en una escala de 0 a 4, donde 0 indica estroma claro, 1 indica opacificación estromal leve, 2 indica opacidad moderada con discernibles características del iris, 3 indica opacidad densa con pérdida de detalle definido iris excepto los márgenes de la pupila, y 4 indica opacidad total sin vista posterior.
  3. La neovascularización se califica en una escala de 1 a 8 dividiendo la córnea en 4 cuadrantes iguales y determinar el grado de vascularización en cada uno de estos cuadrantes.
  4. La blefaritis se mide de la siguiente manera: 0, sin lesiones: 1, hinchazón de párpados mínimo, 2, descarga ocular moderada hinchazón y costras, 3, inflamación severa, moderada pérdida de pelo periocular, y lesiones en la piel, y 4, inflamación grave con ojos cerrados con costra, pérdida severa del pelo periocular y lesiones cutáneas.
  5. Evidencia de la encefalitis inclusiónded espalda encorvada, de pelo rizado, y evidentes anomalías neurológicas. Los ratones son sacrificados cuando muestran importantes signos de encefalitis.

5. Los resultados representativos

El modelo recurrente que se ha descrito anteriormente se publicó por primera Shimeld, et al. 1-3. Probaron y nuestro laboratorio ha estado usando una versión modificada de este modelo a publicar muchos manuscritos durante los 4-15 años. El modelo se utilizó para definir el papel que la citocina interferón γ-juega en recurrente por VHS-1 enfermedad 10. Como se muestra en la Figura 3, los ratones que carecen de IFN muestra peor enfermedad corneal que hizo ratones de tipo salvaje 14. También fue utilizado con éxito para definir el valor terapéutico de la vacuna varias distintas construcciones 6,10,11. Tenga en cuenta que en un caso prueba la vacuna funcionó bien profilácticamente pero no demostrar ser terapéuticamente eficaz 6. Sin embargo,cuando una vacuna incompetente para la replicación viral fue probado, no fue sólo profilácticamente eficaz, pero también fue muy eficaz terapéuticamente 10,11, véase la Figura 5 en la referencia 10. Más recientemente, hemos utilizado este modelo para determinar si las diferencias de género fueron detectables en ratones sometidos a HSK recurrente. Como muestra la Figura 1 muestra, los ratones machos C57BL / 6 muestran significativamente menos opacidad corneal que hacer C57BL hembra / 6 ratones. Del mismo modo, cuando la neovascularización corneal se evaluó, los ratones machos demostrado el crecimiento de vasos significativamente menos nuevo en la córnea que los ratones hembra (Figura 2). Actualmente estamos estudiando si este fenotipo es cepa específica mediante la realización de análisis similares en otras cepas de ratones. También determinará si la diferencia se debe a la falta de testosterona o la presencia de estrógenos.

Figura 1
Figura 1. Enfermedad corneal en C57BL macho y hembra / 6 cepas de ratón después de UV-B reactivación inducida. Ratones con infección latente se indujeron para reactivar con irradiación UV-B y los ratones se monitorizaron para la opacidad de la córnea durante 35 días. El número de ratones utilizados en estos estudios fueron los siguientes: machos, n = 15; hembras, n = 15. Los resultados indican media ± SEM. * No fue significativamente mayor inducida por el virus de la enfermedad en ratones hembra C57BL / 6 de 14 a 35 días (P = 0,001 a 0,01).

Figura 2
Figura 2. Enfermedad corneal en C57BL macho y hembra / 6 cepas de ratón después de UV-B reactivación inducida. Ratones con infección latente se indujeron para reactivar con irradiación UV-B y los ratones se monitorizaron para la neovascularización corneal durante 35 días. El número de ratones utilizados en estos estudios fueron los siguientes: machos, n= 15; hembras, n = 15. Los resultados indican media ± SEM. * No fue significativamente mayor inducida por el virus de la enfermedad en ratones hembra C57BL / 6 de 14 a 28 días (P = 0,001 a 0,01).

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Discussion

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El modelo recurrente de la queratitis estromal herpética (HSK) aquí descrito permite al investigador para estudiar HSK humano en un modelo que sea más coherente con la que se observa durante la enfermedad humana. Por lo tanto, los puntos fuertes del modelo son que la enfermedad se produce en el contexto de un sistema inmune que ya tiene por estimulada durante la enfermedad primaria. Dado que estos ratones tienen ya una respuesta inmune a HSV-1, los factores que reactivan que la respuesta inmune son probablemente diferentes de aquellas que originalmente generado. Por lo tanto, la intervención terapéutica para prevenir HSK primario no siempre conducirá a la mejora de HSK recurrente, que hemos demostrado en diversas publicaciones evaluar las diferencias entre primario y recurrente HSK 6,8,10-13,15. Como se ha indicado anteriormente, este es en particular el caso cuando el desarrollo de vacunas para prevenir el HSK humano. La mayoría de las vacunas prevenir el desarrollo de HSK primario pero muy pocas han demostrado ser eficaces en la reducción de recurrent HSK 6,10,11.

Las debilidades de este modelo es que se necesita mucho más tiempo para llevar a cabo un experimento. Hay un período de semanas casi 6 después de la infección primaria durante el cual los ratones se infección latente y el suero humano administrado metabolizado. Por otra parte, no todos los ratones que están latentemente infectadas eliminan virus detectable en la película lagrimal del ojo infectado. Esto no quiere decir que no reactivó, sólo que no se puede detectar su reactivación por virus cultivo. Es altamente probable que la mayoría, si no todos los ratones se reactivar pero que no producen cantidades suficientes de virus para ser detectado por la placa de ensayo.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer al Dr. Jay Pepose para ayudar a enseñar el modelo para nosotros. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) y una subvención sin restricciones de Investigación para Prevención de la Ceguera en el Departamento de Oftalmología.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma D5796
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Human Serum Sigma S7023
L-Glutamine Cellgro 25-005-C1
Pen/ Strep Sigma P4333
Fungizone Invitrogen 15290018
Centrifuge Sorvall Legend RT
Centrifuge Beckman 52-21
Transilluminatior UVP 95-0452-02
Sonicatior Branson Sonifier 450
Oak Ridge Tubes Nalgene Z 720410
Flasks- 7150 Corning 430823
Plates- 12 well Corning CLS 3513
Plates- 48 well Corning CLS 3548
Sterile Conical Tubes- 30 ml Corning CLS 430828
Sterile Cotton-tipped Applicators Fisher 23-400-125
30G Needles Becton-Dickinson 305106
25G Needles BD 305122
10 ml Syringe BD 309602
10 ml Syringe BD 309604

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References

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Morris, J., Stuart, P. M., Rogge, M., Potter, C., Gupta, N., Yin, X. T. Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK. J. Vis. Exp. (70), e4276, doi:10.3791/4276 (2012).More

Morris, J., Stuart, P. M., Rogge, M., Potter, C., Gupta, N., Yin, X. T. Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK. J. Vis. Exp. (70), e4276, doi:10.3791/4276 (2012).

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