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Biology

Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas

Published: January 7, 2013 doi: 10.3791/4301
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

Los efectos de la activación de la proteína quinasa C (PKC) las isoenzimas en las funciones mitocondriales asociadas con la respiración y la fosforilación oxidativa y en la viabilidad celular se describen. El enfoque se adapta técnica adenoviral para sobreexpresar selectivamente las isozimas de la PKC en cultivo de células primarias y una diversidad de ensayos para determinar las funciones mitocondriales y el estado de energía de la célula.

Abstract

La proteína quinasa C (PKC), la familia de isoenzimas está implicado en numerosos procesos fisiológicos y patológicos. Nuestros datos recientes demuestran que la PKC regula la función mitocondrial y estado de energía celular. Numerosos informes demuestran que la activación de la PKC-a y PKC-ε mejora la función mitocondrial en el corazón isquémico y media la cardioprotección. En contraste, se ha demostrado que la PKC-α y PKC ε-están implicados en nephrotoxicant inducida por disfunción mitocondrial y la muerte celular en células de riñón. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo in vitro de células renales que mantienen activas las funciones mitocondriales en los que las isoenzimas PKC podría ser selectivamente activados o inhibidos para determinar su papel en la regulación de la fosforilación oxidativa y la supervivencia celular. Los cultivos primarios de células renales tubulares proximales (POCT) se cultivaron en condiciones mejoradas resultantes en la respiración mitocondrial y la actividad de Mitoenzimas mitocondriales similares a los de POCT in vivo. Debido a las técnicas tradicionales de transfección (Lipofectamine, electroporación) son ineficientes en cultivos primarios y tienen efectos adversos sobre la función mitocondrial, PKC-ε ADNc mutantes fueron entregados a través de POCT vectores adenovirales. Este enfoque implica la transfección de más del 90% RPTC culto.

A continuación, se presentan los métodos para evaluar el papel de la PKC-ε en: 1. regulación de la morfología mitocondrial y funciones asociadas con la síntesis de ATP, y 2. supervivencia de POCT en cultivo primario. PKC-ε es activada por la sobreexpresión constitutivamente activa PKC-ε mutante. PKC-ε es inhibida por la sobreexpresión del mutante inactivo de la PKC-ε. La función mitocondrial se evalúa mediante el examen de la respiración, la integridad de la cadena respiratoria, actividades de complejos respiratorios y F 0 F 1-ATPasa, la tasa de producción de ATP, y el contenido de ATP. La respiración es unssessed en digitonina-permeabilizadas POCT como el estado 3 (respiración máxima en presencia de exceso de sustratos y ADP) y las respiraciones no acoplados. Integridad de la cadena respiratoria se evaluó midiendo las actividades de los cuatro complejos de la cadena respiratoria en las mitocondrias aisladas. Capacidad de la fosforilación oxidativa se evalúa midiendo el potencial de membrana mitocondrial, la tasa de producción de ATP, y la actividad de F 0 F 1-ATPasa. El estado de energía de POCT se evalúa mediante la determinación del contenido intracelular de ATP. Morfología mitocondrial en células vivas se visualizaron usando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente que se acumula específicamente en las mitocondrias, y las monocapas en vivo se examina bajo un microscopio de fluorescencia. Viabilidad RPTC se evalúa utilizando anexina V / yoduro de propidio tinción seguido por citometría de flujo para determinar la apoptosis y oncosis.

Estos métodos permiten una activación selectiva / inhibición de las isoenzimas PKC individuopara evaluar su papel en las funciones celulares en una variedad de condiciones fisiológicas y patológicas que pueden ser reproducidos en in vitro.

Protocol

1. El aislamiento de los túbulos renales proximales de cultivos primarios

  1. Se anestesia el conejo, especial ambos riñones y colocarlos en una placa de Petri llena con tampón de preparación estéril (medio DMEM/F12) en una campana de flujo laminar.
  2. Perfundir cada riñón con 50 ml de tampón de preparación seguido por 50 ml de agua estéril tamponada con fosfato salino, pH 7,4 (PBS), y PBS-hierro solución de óxido de (45 ml + 5 ml). De-capsulados riñones y transferirlos al búfer de preparación que contiene deferoxamina.
  3. Cosecha de la corteza de cada riñón.
  4. Homogeneizar el tejido usando un homogeneizador Dounce de 15 ml. Vierta el homogeneizado tamiz de malla de 2 estériles (85 m en la parte inferior y 235 micras en la parte superior) se coloca sobre un vaso de precipitados estéril L 1. Enjuague los tamices con deferoxamina que contiene buffer.
  5. Recoger cualquier tejido remanente en el tamiz de 85 micras en un tubo de centrífuga cónico estéril llena con 35-40 ml de tampón que contiene deferoxamina. Mezclar suavemente la suspensión celular.
  6. Coloque una fuerte mAgnet exterior del tubo para eliminar el hierro lleno de glomérulos y dejar que la suspensión se asiente. Aspirar el hierro del imán utilizando una pipeta Pasteur. Repita este proceso.
  7. Preparar 1 ml de medio de digestión que contiene 2,400-2,500 unidades de colagenasa I y 0,6 mg de inhibidor de tripsina de soja disuelta en el tampón que contiene la deferoxamina. Filtrar a esterilizar el medio digestión.
  8. Ajustar el volumen de la suspensión celular a 40 ml, y añadir 1 ml de medio de digestión. Incubar a temperatura ambiente durante 17 min mezclando suavemente la suspensión, centrifugar a 50 x g durante 2 min a 4 ° C, se aspira el medio, y añadir tampón de deferoxamina fresco.
  9. Repetir el procedimiento de eliminación de hierro con el imán varias veces, girar la suspensión de nuevo, aspirar el medio, y añadir 46 ml de medio que no contiene glucosa.
  10. Mezclar suavemente y medir 500 l de la suspensión en dos pesadas previamente tubos Eppendorf. Haga girar celdas hacia abajo a 10.000 xg durante 1 min, aspirar los medios de comunicación, y pesar el pellet. Calcular el rendimiento total de la masa húmeda y proteína.
  11. Las células en placas estériles de 35 mm cultura platos a la densidad de la proteína de 1 mg / cápsula, utilizando la glucosa libre DMEM/F12 medio. Células de cultivo en 2 ml de glucosa en un medio libre de DMEM/F12 siempre en un agitador orbital en la incubadora a 37 ° C (95% de aire / 5% CO 2) 1,2.

2. Túbulo proximal renal cultivo celular

  1. El medio de cultivo es una mezcla 50:50 de DMEM y Ham F-12 de mezcla de nutrientes sin rojo fenol, piruvato, y glucosa, suplementado con 15 mM NaHCO 3, 15 mM de HEPES, y 6 mM de lactato (pH 7,4, 295 mOsm / KGH 2 O). Los medios se suplementan con L-ascórbico-2-fosfato (50 mM), insulina bovina (10 nM), transferrina humana (5 mg / ml), hidrocortisona (50 nM), y selenio (5 ng / ml) inmediatamente antes medios de cambio diario.
  2. Aspirar los viejos medios de platos utilizando una técnica estéril. Añadir 2 ml de medio caliente, fresco a cada placa usando una técnica estéril. Renales células tubulares proximales (POCT) llegan a la confluencia en aproximadamente 5-6 días después de la siembra 1,2.

3. Infección adenoviral de POCT

  1. Infección adenoviral se lleva a cabo en cultivos confluentes, en reposo de POCT después del cambio de medio cada día. Dominante negativo PKC-ε mutante (dnPKC-ε) se construyó mediante la sustitución de: 1) lisina por arginina en la posición 436 del sitio de unión a ATP y 2) alanina con glutamato en la posición 159 del dominio pseudosustrato. Estas mutaciones destruyó la actividad del constructo de quinasa sin cambiar la conformación activa de la PKC-ε. 3 PKC-ε se hizo constitutivamente activa por deleción de los residuos 154-163 de su dominio pseudosustrato inhibidora. 4
  2. Añadir la solución de reserva de adenovirus que porta caPKC-ε ADNc o ADNc dnPKC-ε a cada placa para obtener multiplicidad deseado de infección (MOI) que resulta en un incremento significativo en la PKC-& epsilen; niveles de proteína. Incubar POCT con adenovirus durante 24 horas. Cambio de medio y células de cultivo de otras 24 horas. Aumentado significativamente los niveles de fosforilados y total ε PKC-proteínas se pueden obtener utilizando 25-50 MOI de vector adenoviral codificante caPKC-ε. Mayores resultados MOI en incrementos aún mayores en los niveles de PKC-ε activo, pero no se recomienda en RPTC debido a la rápida muerte celular y la pérdida. Niveles significativamente aumentados de la inactiva PKC-ε proteína se puede obtener utilizando 50-100 MOI en POCT sin producir efectos adversos. 5
  3. A las 48 h después de la infección, los medios de aspirado, se lavan las monocapas con PBS, y recoger las células para análisis de inmunotransferencia para determinar los niveles de proteína de la PKC-ε. 5

4. Medición de la respiración POCT

  1. Preparar un tampón de ensayo para medir el estado 3 respiración (120 mM KCl, 5 mM KH 2 PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO 4, y 2 mM EGTA, pH 7,4). Para medir el complejo I-acoplado estado 3 respiración, suplementar el tampón de ensayo con 5 mM de glutamato, 5 mM malato y 0,1 digitonina mg / ml. Para el complejo II-coupled estado 3 respiración, suplementar el tampón de ensayo con succinato 10 mM, 0,1 mM rotenona, y 0,1 digitonina mg / ml. Para el complejo IV-coupled estado 3 respiración, suplementar el tampón de ensayo con ascorbato 1 mM, 1 mM de N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD), y 0,1 digitonina mg / ml. Coloque las soluciones en un baño de agua a 37 ° C.
  2. Aspirar los medios de comunicación a partir de una placa de cultivo que contiene monocapa POCT, añadir 2 ml de un tampón de respiración estado caliente 3, raspar suavemente las células de la cápsula, utilizando una goma de policía, y transferir la suspensión a la cámara de consumo de oxígeno equipado con un electrodo de tipo Clark.
  3. Medida de estado 2 respiración (en ausencia de ADP). Iniciar estado 3 respiración mediante la adición de ADP a una concentración final de 0,4 mM. Inicie el estado 4 respiración añadiendo oligomicina a una concentr definitivoción de 0,5 g / ml. Respiración desacoplada se mide mediante la adición de FCCP 0,5 M a las células que respiran en el estado 3. 6,7
  4. Recoger la suspensión celular de la cámara, precipitar la proteína usando ácido perclórico, y girar hacia abajo el precipitado. Determinar la concentración de proteínas en el pellet celular.

5. Análisis del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

  1. Preparar 0,5 mM JC-1 en la solución de medio de cultivo estéril.
  2. Añadir lentamente 20 l de solución de JC-1 a cada placa para obtener una concentración final de 5 mM. Agite el plato para mezclar el tinte a fondo. Devolver las placas en la estufa durante 30 min.
  3. Ponga los platos en el hielo, los medios de aspirado y lavado monocapas dos veces con helado de PBS. Aspirar el PBS, añadir 1 ml de PBS fresco, raspar las células de la placa y transferir a un tubo Eppendorf. Romper monocapas en células individuales mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo.
  4. Girar hacia abajo la suspensión a 1.000 xg durante 2 min, aspirate el sobrenadante, añadir 1 ml de PBS al sedimento y volver a suspender, para recibir una suspensión de células individuales. Repita este paso de nuevo si es necesario.
  5. Girar las células hacia abajo a 1.000 xg durante 2 min, aspirar el sobrenadante, añadir 0,5 ml de PBS, y volver a suspender el sedimento. Analizar fluorescencia por citometría de flujo usando la excitación por un 488-nm láser de ion argón. Leer la emisión en dos canales separados, FL1 a 525 nm y FL2 a 590 nm. Potencial de membrana mitocondrial se expresa como FL2/FL1 proporción de fluorescencia. 6

6. Aislamiento de mitocondrias

  1. Preparar tampones de aislamiento: tampón A (10 mM HEPES, 225 mM de manitol, 75 mM de sacarosa, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), tampón B (tampón A que contienen inhibidores de la proteasa, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF), y el Tampón C (10 mM HEPES, 395 mM de sacarosa, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Realice todos los pasos en el hielo.
  2. Lávese las monocapas POCT dos veces con helado de PBS. Raspar monocapas en tubos Eppendorf y centrifugar losa 500 xg durante 5 min. Lavar el sedimento en 1 ml de tampón A.
  3. Se resuspende el sedimento en 1 ml de tampón B, y transferir la suspensión a un homogeneizador de 2 ml Dounce.
  4. Homogeneizar las células en el homogeneizador Dounce hasta que la mayoría de las células en el homogeneizado se rompen cuando inspeccionado bajo el microscopio.
  5. Se centrifuga el homogeneizado a 1.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y se lo hace girar hacia abajo a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet crudo que contiene mitocondrias en 1 ml de tampón C. girar los sobrenadantes abajo a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Repita el lavado del pellet dos veces más. 5
  7. Para medir la actividad de los complejos respiratorios, volver a suspender el pellet en mitocondrial 50-100 l de tampón de ensayo y la congelación en nitrógeno líquido. Descongelar las muestras lentamente en hielo.

7. Medición de la actividad de NADH-ubiquinona oxidorreductasa (complejo I)

  1. Prepare el tampón de ensayo: 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. Añadir ácido graso libre de BSA y NADH para obtener concentraciones finales de 0,25% y 0,25 mm, respectivamente. Añadir 2 l de solución de antimicina A (1 mg / ml) a una concentración final de 2 mg / ml.
  2. Ejecutar las muestras en una placa transparente 48-y. Incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 500 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 5 min.
  3. Se inicia la reacción mediante la adición de 10 l de ubiquinona 3,25 mM a cada pocillo. Leer la absorbancia (340 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Añadir 5 l de solución de rotenona (1 mg / ml) a cada pocillo y la absorbancia durante 2 min. Cálculo de actividad del complejo I como la rotenona sensible a la oxidación de NADH. 7

8. Medición de la actividad de oxidorreductasa succinato-ubiquinona (complejo II)

Preparar el tampón de ensayo que contenía 0,25% de ácido graso libre BSA, 20 mM de succinato de potasio, 0,25 mM 2,6-dicloroindofenol, 2 g / ml de antimicina A, y 10 g / ml de rotenona.
  • Ejecutar las muestras por duplicado en una placa transparente 48-y que incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 500 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 2 min.
  • Se inicia la reacción mediante la adición de 10 l de ubiquinona 3,25 mM a cada pocillo. Leer la absorbancia (595 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Cálculo de la actividad del complejo II, siguiendo la reducción de 2,6-dicloroindofenol. 7

    • 9. Medición de la actividad de ubiquinol-citocromo c oxidorreductasa (complejo III)

    1. Preparar el tampón de ensayo que contenía 0,1% de ácido graso libre de BSA, 80 mM de succinato de potasio, rotenona 10 g / ml, y 0,24 mM de potasio cianuro.
    2. Ejecutar las muestraspor duplicado en una placa transparente 48-y que incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 291 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 5 min.
    3. Se inicia la reacción mediante la adición de 3 l de 6 mM oxidada del citocromo c a cada pocillo. Leer la absorbancia (550 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Añadir 5 l de solución antimicina A (1 mg / ml) a cada pocillo y la absorbancia durante 2 min. Cálculo de la actividad del complejo III como la antimicina A-sensible reducción del citocromo c. 7

    10. Medición de la actividad de la citocromo oxidasa (complejo IV)

    1. Preparar citocromo c reducido mediante la adición de ascorbato de sodio a la solución mM 9 de citocromo c y dializar la solución durante la noche a 4 ° C en 1 L de tampón fosfato (10 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) que contenía 5 mM de MgCl 2. Preparar el tampón de ensayo que contiene0,1% de ácido graso libre de BSA y antimicina A (2 ug / ml).
    2. Ejecutar las muestras en una placa transparente 48-y que incluye una muestra en blanco que tiene todas las adiciones, pero no las mitocondrias. Para cada pocillo, añadir 233 l de tampón de ensayo con las adiciones y las mitocondrias, y se incuba la placa a 30 ° C con agitación durante 5 min.
    3. Se inicia la reacción mediante la adición de citocromo c reducido (90 mM concentración final). Leer la absorbancia (550 nm) durante 3 min en intervalos de 20 seg. Añadir 2 l de solución de KCN (8 ug / ml) a cada pocillo y la absorbancia para otro min 2. Cálculo de la actividad del complejo IV como la oxidación KCN-sensible citocromo c. 7

    11. Medición de la actividad de F 0 F 1-ATPasa (ATP sintasa)

    1. Preparar F 0 F 1-ATPasa tampón de ensayo (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM de MgCl 2, pH 8,2). Vuelva a suspender el pellet en el mitocondrial tampón de ensayo, congelar las muestras mitocondriales en liquid nitrógeno y descongelar las muestras lentamente en hielo.
    2. Ejecutar las muestras por triplicado en una placa transparente 48-y. Para cada grupo de tratamiento, 2 pozos se ejecuta para medir la actividad ATPasa total de (275 l de tampón de ensayo, 5 l de suspensión mitocondrial, y 5 l de 95% de etanol) y 1 pocillo para medir oligomicina insensible actividad ATPasa (275 l de el tampón de ensayo, 5 l de suspensión mitocondrial, y 5 l de 1 mg / ml de solución oligomicina en 95% de etanol).
    3. Incubar las muestras a 31 º C durante 10 min con agitación constante. Añadir 16 l de 100 mM de solución de ATP (pH 7,0) y se incuba a 31 ° C durante 5 min con agitación constante.
    4. Transferir 200 l de la mezcla de incubación a un tubo que contiene 50 l de 3 M TCA. Incubar las muestras en hielo durante 10 min y girar hacia abajo a 10.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Use sobrenadantes y pellets para determinar fosfato y el contenido de proteína, respectivamente.
    5. Determine el contenido de fosfato en los sobrenadantes utilizando elensayo de fosfato inorgánico. Preparar 100 ml de reactivo de Sumner mediante la adición de 0,88 g FeSO 4 a 10 ml de 3,75 MH 2 SO 4 y ajustar a 90 ml con H 2 O. Añadir 10 ml de solución de molibdato de amonio (0,66 g/10 ml de H 2 O) a la solución de FeSO4 en H 2 SO 4. Proteger de la luz.
    6. Carga placa de 96 pocillos con 50 l de cada estándar con fosfato (0 - 1.000 mM KH 2 PO 4) y 50 l de cada sobrenadante en los duplicados. Añadir 250 l de reactivo de Sumner a cada pocillo y se incuba la placa a 30 ° C durante 15 min con agitación constante.
    7. Leer la absorbancia a 595 nm a temperatura ambiente. F 0 F 1-ATPasa actividad se determina midiendo la oligomicina sensible a la liberación de P i a partir de ATP como hemos descrito anteriormente. 7,8 Calcular total y oligomicina insensibles F 0 F 1-ATPasa actividades. Para calcular el oligomicina-ATPasa sensible actividad, restar oligomicina insensible a la actividad de la ATPasa total de 8,9.

    12. Medición del contenido intracelular de ATP

    1. Coloque los platos de cultivo que contienen monocapas POCT en hielo, medio aspirado y se lavan las monocapas dos veces con tampón PBS frío hielo. Añadir 1 ml de PBS a cada monocapa, raspar cada monocapa en PBS, y recoger la suspensión de células en un tubo Eppendorf. Girar los tubos Eppendorf en la microcentrífuga durante 5 seg.
    2. Determinar el contenido de ATP en cada muestra por el método POCT luciferasa usando el ATP bioluminiscencia Kit de ensayo de HS II (Roche) y el protocolo del fabricante. Determinar la concentración de proteína en cada muestra y se calcula la concentración de ATP por mg de proteína. 8

    13. Observación de morfología mitocondrial

    1. Cambie medios de cultivo. Añadir 2 l de solución de 100 mM de MitoTracker Red 580 a cada placa (conc. final. 100 nM) y devolver los platos a la incubator durante 30 min.
    2. Examine las monocapas en vivo bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un objetivo de inmersión en agua. 5

    14. Análisis de la viabilidad celular

    1. A las 24 h antes de comenzar el ensayo de preparar una solución de 50 mM de cisplatino para el tratamiento de las células que servirán como control positivo para la apoptosis (anexina V de células positivas). Además, preparar una solución 500 mM de terc-butilo para tratar las células que sirven como controles positivos para oncosis (propidio positivos con yoduro de células).
    2. Tratar 2 platos con 2 l de cisplatino 50 mM y 2 platos con 2 l de 500 mM de terc-butilo. Dedicar un plato para un control sin mancha.
    3. A las 24 h después del tratamiento con cisplatino y TBHP, preparar el tampón de unión (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2) y una solución de yoduro de propidio (PI) (50 ug / ml) en el tampón de unión.
    4. Lávese las monocapas de una vez con la ventaja de la unióner. Añadir 1 ml de tampón enfriado con hielo y 50 l de solución de PI para cada plato, excepto para los no-tinción de anexina V y de células positivas. Cubrir los platos y se incuba en hielo durante 15 min con agitación orbital suave.
    5. Lavar las monocapas con el tampón de unión (10 min) y se añade 1 ml del tampón de unión y 2 l de anexina V-FITC solución a cada placa, excepto para las células no-manchas y PI-positivo. Cubrir los platos y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min con agitación orbital suave.
    6. Aspirar el tampón y se lavan las monocapas con 1 ml del tampón de unión enfriado con hielo en hielo durante 10 min con agitación orbital suave. Repetir el paso de lavado.
    7. Aspirar el tampón de unión y añadir 500 l de tampón de unión a cada plato. Raspar suavemente las células utilizando una goma de policía y transferir las células a tubos de citometría de flujo. Dispersar las células en una única suspensión celular pipeteando arriba y abajo de las muestras. Romper las agrupaciones de células.
    8. Cuantificar PI y anexina V-FITC fluorescencia inmediatamente por flow usando citometría de excitación a 488 nm y emisión a 590 y 530 nm para FITC y PI, respectivamente. Cuente 10.000 eventos en cada muestra.
    9. Ponga la fluorescencia FITC en el eje X y la fluorescencia PI en el eje Y de las figuras de citometría de flujo gráfico de puntos. Las células positivas para anexina V y negativas para PI se consideran apoptótica. Las células positivas para el PI y negativa para anexina V se consideran oncótica 10,11.

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    Representative Results

    La Figura 1 muestra que la entrega adenoviral de ADNc que codifica los constitutivamente activos (caPKC-ε) e inactiva (dnPKC-ε) mutantes de resultados PKC-ε en los niveles de proteína significativamente mayores de PKC-ε en POCT y en las mitocondrias. Las células infectadas con el vector de ADNc que lleva caPKC-ε sobreexpresa el fosforilada (activa) forma de PKC-ε mientras que las células infectadas con el ADNc que codifica dnPKC-ε overexpressed PKC-ε que era inactivo (no fosforilado) (figura 1). La presencia de activa PKC-ε disminución de la respiración mitocondrial en POCT independientemente del sustrato utilizado para energizar las mitocondrias, mientras que los inactivos PKC-ε no tuvo ningún efecto (Figura 2). Con el fin de determinar los objetivos de la PKC-ε activo dentro de la cadena respiratoria, se determinó la actividad de todos los complejos enzimáticos de la cadena respiratoria. Como se muestra en la figura 3 (Figura 4). Estos cambios fueron acompañados por disminuciones en la actividad de F 0 F 1-ATPasa (ATP sintasa) en mitocondrias aisladas de POCT sobreexpresan la activa PKC-ε (Figura 5A). Como resultado, el contenido de ATP de POCT sobreexpresan la activa PKC-ε disminuyó (Figura 5B). Activación sostenida de PKC-ε tenido profundos efectos en la morfología mitocondrial mediante la inducción de la fragmentación mitocondrial (fisión) (Figura 6B). La inhibición de PKC-ε de activación, pero no, también dio lugar a cambios en la morfología POCT causando una contracción de la célula nd alargamiento de las células supervivientes. La disfunción mitocondrial y alteraciones en la morfología mitocondrial en POCT sobreexpresan la activa PKC-ε fueron acompañadas por una muerte celular por tanto oncosis y la apoptosis (Figura 7). A las 48 horas después de la entrega del vector adenovírico, aproximadamente el 50% de la POCT overexpressing activa PKC-ε no eran viables. La sobreexpresión de la forma inactiva de la PKC-ε no tuvo ningún efecto sobre la función mitocondrial y la morfología, y en la viabilidad RPTC.

    Por lo tanto, la entrega adenoviral de ADNc que codifican diferentes isozimas de la PKC es una herramienta eficaz que permite la sobreexpresión selectiva de isozimas PKC individuales y sus mutantes activos o inactivos en cultivos primarios de células renales. Permite para la transfección eficiente de las células cultivadas en cultivo primario y para el estudio de la regulación de diferentes funciones celulares y para la evaluación de la morfología celular y la viabilidad de las proteínas quinasas.

    ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 1
    Figura 1. Los niveles de proteína de fosforilados (activo) PKC-ε (p-PKC-ε) y el total de PKC-ε en homogeneizados celulares (panel izquierdo) y las mitocondrias (panel derecho) aislados de cultivos primarios de POCT infectadas con el vector adenoviral que lleva el mutantes constitutivamente activos (caPKC-ε) o inactiva (dnPKC-ε) de PKC-ε en diferentes puntos temporales después de la entrega de vectores adenovirales. Los niveles de β-actina y F 0 F 1-ATPasa se ​​usan como controles de carga de gel para homogeneizados celulares y mitocondrias, respectivamente. Figura modificada de Nowak et al. 5

    Figura 2
    Figura 2. Estado3 y desacoplado respiraciones en POCT expresar los mutantes activos e inactivos de la PKC-ε a las 48 h después de la entrega adenoviral. Para el estado 3 respiración, las mitocondrias en las células permeabilizadas con digitonina-fueron energizados usando 5 mM de glutamato + 5 mM malato (sustratos oxidados a través de complejo I), succinato 10 mM + 0,1 rotenona mu M (sustrato oxidado a través de complejo II), o ascorbato 1 mM + 1 mM de N, N, N ', N'-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) (sustratos oxidados a través de complejo IV). Los resultados son la media ± SE. * - P <0,05.

    Figura 3
    Figura 3. Actividades del complejo I y IV complejo en mitocondrias aisladas de POCT expresar los mutantes activos e inactivos de la PKC-ε a las 48 h después de la entrega de vectores adenovirales. Los resultados son la media ± SE. * - P <0,05.

    Figura 4
    Figura 4. Cambios dependientes del tiempo en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) después de la infección en POCT con vector adenoviral que lleva los mutantes constitutivamente activos (caPKC-ε) e inactiva (dnPKC-ε) de PKC-ε. Los resultados se expresan como la relación de agregado a las formas monoméricas de JC-1. Los resultados son la media ± SE. * - P <0,05.

    Figura 5
    Figura 5. Actividad de F 0 F 1-ATPasa en las mitocondrias aisladas (A) y el contenido de ATP (B)en POCT expresar los mutantes activos e inactivos de la PKC-ε a las 48 h después de la entrega de vectores adenovirales. Los resultados son la media ± SE. * - P <0,05.

    La figura 6
    Figura 6. Morfología mitocondrial en POCT vivo que expresa los mutantes activos e inactivos de la PKC-ε a las 48 h después de la entrega de vectores adenovirales. Una. Los controles no infectados. B. RPTC expresar caPKC-ε. C. RPTC expresar dnPKC-ε. Imágenes representativas de células vivas se examina bajo un microscopio de fluorescencia. Ampliación original, X630.

    Figura 7
    Figura 7. Cambios dependientes del tiempo en RPTC oncosis (A) y la apoptosis (B) después de la infección con el vector adenoviral que lleva los mutantes constitutivamente activos (caPKC-ε) o inactiva (dnPKC-ε) de PKC-ε. La infección con partículas adenovirales que codifican un vector vacío pShuttle (MOI = 50) resultó en 5,2 ± 2,3% oncosis y 5,5 ± 1,0% de apoptosis a las 48 h después de la infección. Los resultados son la media ± SE. * - P <0,05. C. representativos dot parcelas que demuestran la anexina V y la fluorescencia de yoduro de propidio en POCT overexpressing caPKC-ε y ε-dnPKC a las 48 h después de la entrega de vectores adenovirales.

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    Discussion

    El enfoque aquí presentado permite la sobreexpresión de isoenzimas individuales de la PKC en el cultivo primario de las células tubulares renales proximales. Hay varias ventajas de este enfoque: 1. Permite la investigación de los mecanismos de regulación en una población homogénea de células (células tubulares renales proximales) que son el objetivo principal de diversos insultos (isquemia, hipoxia, estrés oxidativo), drogas y nephrotoxicants dentro del riñón. 2. Funciones mitocondriales en este modelo in vitro de POCT crecido en cultivo primario en las mejores condiciones se asemejan a las funciones mitocondriales de los túbulos renales proximales en vivo. 1,2 3. Respuesta de las mitocondrias a las sustancias tóxicas diferentes, en este modelo in vitro es similar a la respuesta de los túbulos renales proximales en vivo. 4. Este enfoque permite una transfección eficiente y la entrega de genes que codifican proteínas específicas, incluyendo proteínas implicadas en la transducción de señales mecánicassms que regulan las funciones mitocondriales. Así, este modelo permite la expresión selectiva de las isoenzimas constitutivamente activas e inactivas de las quinasas y fosfatasas y reemplaza la necesidad de inhibidores y activadores farmacológicos que no son tan selectivos y con frecuencia tienen efectos secundarios tóxicos. Las limitaciones de este modelo son los siguientes: 1. utilizando POCT cultivadas en un ambiente in vitro no permite estudiar endocrina y paracrina señales que contribuyen a la regulación de la función mitocondrial en los túbulos proximales renales in vivo, y 2. este modelo no permite el estudio de las condiciones crónicas.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgments

    Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales, 2R01DK59558 (para GN). UAMS Traslacional del Instituto de Investigación financiado por los Institutos Nacionales de Salud Centro Nacional para la Investigación de los Recursos subvención UL1 RR029884 proporcionó financiación parcial para Core Citometría de Flujo en UAMS. Agradecemos al Dr. Peipei Ping (Universidad de California en Los Angeles, Los Angeles, CA) para proporcionar una alícuota de adenovirus que lleva el ADNc que codifica el dominante negativo (inactivo) mutante de PKC-ε y el Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) para proporcionar una alícuota de vector adenoviral que codifica el mutante constitutivamente activa de PKC-ε. También queremos agradecer a los Dres. Peter Parker y Peter Sugden (Imperial College London, Londres, Reino Unido) para proporcionar cDNA que codifica constitutivamente activa PKC-ε.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W    		 Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

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    References

    1. Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
    2. Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
    3. Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
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    Tags

    Biología Celular número 71 Bioquímica Biología Molecular Genética Farmacología Fisiología Medicina proteínas disfunción mitocondrial las mitocondrias la proteína quinasa C las células tubulares renales proximales las especies reactivas de oxígeno consumo de oxígeno la cadena de transporte de electrones los complejos respiratorios ATP adenovirus cultivo primario la isquemia las células por citometría de flujo
    Evaluación de las funciones mitocondriales y la viabilidad celular renal de células que sobreexpresan la proteína quinasa C Isoenzimas
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    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment… More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

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