Évaluation des fonctions mitochondriales et la viabilité cellulaire dans les cellules rénales surexprimant la protéine kinase C Isozymes

Summary

Les effets de l'activation de la protéine kinase C (PKC) isozymes de la fonction mitochondriale associés à la respiration et la phosphorylation oxydative et sur la viabilité cellulaire sont décrites. L'approche technique s'adapte adénoviral de façon sélective surexprimer isoenzymes de PKC dans une culture cellulaire primaire et une variété de tests pour déterminer les fonctions mitochondriales et l'état énergétique de la cellule.

Abstract

La protéine kinase C (PKC) de la famille des isoenzymes est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Nos données récentes démontrent que la PKC régule la fonction mitochondriale et l'état énergétique cellulaire. De nombreux rapports ont démontré que l'activation de la PKC-a et de la PKC-ε améliore la fonction mitochondriale dans la cardiopathie ischémique et cardioprotection médiateur. En revanche, nous avons montré que la PKC-α et PKC-ε sont impliqués dans nephrotoxicant induite par la dysfonction mitochondriale et la mort cellulaire dans les cellules rénales. Par conséquent, l'objectif de cette étude était de développer un modèle in vitro de cellules rénales maintenir actives les fonctions mitochondriales dans lequel isoenzymes de PKC pourrait être sélectivement activés ou inhibés afin de déterminer leur rôle dans la régulation de la phosphorylation oxydative et la survie cellulaire. Les cultures primaires de cellules tubulaires proximales rénales (RPTC) ont été cultivées dans de meilleures conditions résultant de la respiration mitochondriale et l'activité des mitochondrial enzymes analogues à celles RPTC in vivo. Parce que les techniques de transfection traditionnels (Lipofectamine, l'électroporation) sont inefficaces dans des cultures primaires et avoir des effets néfastes sur la fonction mitochondriale, PKC-ε ADNc mutants ont été livrés à travers RPTC vecteurs adénoviraux. Cette approche se traduit par la transfection de plus de 90% RPTC culture.

Ici, nous présentons les méthodes pour évaluer le rôle de la PKC-ε dans: 1. la régulation de la morphologie des mitochondries et des fonctions associées à la synthèse d'ATP, et 2. survie des RPTC en culture primaire. PKC-ε est activé par surexprimant constitutivement active de la PKC ε-mutant. PKC-ε est inhibée par la surexpression de la mutant inactif de la PKC-ε. La fonction mitochondriale est évaluée en examinant la respiration, de l'intégrité de la chaîne respiratoire, les activités des complexes respiratoires et F ₀ F _1-ATPase, le taux de production d'ATP, et la teneur en ATP. La respiration est unssessed dans digitonine-perméabilisées RPTC que l'état 3 (respiration maximale en présence de substrats en excès et ADP) et les respirations découplés. L'intégrité de la chaîne respiratoire est évaluée par la mesure des activités des quatre complexes de la chaîne respiratoire dans les mitochondries isolées. Capacité de phosphorylation oxydative est évaluée par mesure du potentiel de membrane mitochondriale, le taux de production d'ATP, et une activité de F ₀ F _1-ATPase. Statut énergétique de RPTC est évaluée par la détermination de la teneur en ATP intracellulaire. Morphologie mitochondriale dans les cellules vivantes est visualisée à l'aide Mitotracker Red 580, un colorant fluorescent qui s'accumule spécifiquement dans les mitochondries, et des monocouches vivants sont examinés sous un microscope à fluorescence. RPTC viabilité est évaluée à l'aide annexine V / iodure de propidium suivie coloration par cytométrie en flux afin de déterminer l'apoptose et oncose.

Ces méthodes permettent une activation sélective / inhibition de la PKC individuelle isozymesafin d'évaluer leur rôle dans les fonctions cellulaires dans une variété de conditions physiologiques et pathologiques qui peuvent être reproduits in vitro.

Protocol

1. Isolement des tubules proximaux de la culture primaire

1. Anesthésier le lapin, les deux reins d'accise et les placer dans une boîte de Pétri remplie de tampon de préparation stérile (DMEM/F12) dans une hotte à flux laminaire.
2. Perfuser chaque rein avec 50 ml de tampon de préparation suivis par 50 ml de solution stérile saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (PBS) et une solution d'oxyde de fer PBS (45 ml + 5 ml). De-capsulate reins et les transférer dans la mémoire tampon de préparation contenant la déféroxamine.
3. Récolter le cortex de chaque rein.
4. Homogénéiser le tissu en utilisant un homogénéisateur Dounce de 15 ml. Verser l'homogénat plus de 2 mailles des tamis stériles (85 um sur le fond et 235 um sur le dessus) placé au-dessus d'un bécher de 1 L stérile. Rincez le tamis par la déféroxamine contenant du tampon.
5. Recueillir tous les tissus à gauche sur le tamis 85 um dans un tube à centrifuger conique stérile rempli de 35-40 ml de tampon contenant la déféroxamine. Mélanger délicatement la suspension cellulaire.
6. Placez une forte magnet extérieur du tube pour enlever le fer rempli de glomérules et laissez la suspension en place. Aspirer le fer de l'aimant à l'aide d'une pipette Pasteur. Répétez ce processus.
7. Préparer 1 ml de milieu de digestion contenant 2,400-2,500 unités de collagénase I et 0,6 mg d'inhibiteur de trypsine de soja dissoutes dans le tampon contenant de la déféroxamine. Filtrez-stériliser le milieu de digestion.
8. Réglez le volume de la suspension cellulaire à 40 ml, ajouter 1 ml de milieu de digestion. Incuber à température ambiante pendant 17 min doucement le mélange de la suspension, centrifugeuse à 50 xg pendant 2 min à 4 ° C, aspirer le moyen et ajouter la déféroxamine tampon frais.
9. Répétez la procédure de retrait de fer avec l'aimant à plusieurs reprises, tourner la suspension à nouveau, aspirer moyen et ajouter 46 ml de milieu contenant pas de glucose.
10. Mélanger doucement et mesurez 500 ul de la suspension dans deux tubes Eppendorf préalablement pesés. Spin cellules vers le bas à 10.000 xg pendant 1 min, aspirer les médias, et peser le culot. Calculez le rendement total de la masse humide et de protéines.
11. Plaque les cellules stériles boîtes de 35 mm de la culture à la densité de 1 mg de protéine / plat en utilisant du glucose sans DMEM/F12. Cellules en culture dans 2 ml de milieu sans glucose DMEM/F12 toujours sur un agitateur orbital dans l'incubateur à 37 ° C (95% d'air / 5% de CO _2). ^1,2

2. Rénale proximale Culture cellulaire Tubule

1. Le milieu de culture est un mélange 50:50 de DMEM et Ham F-12 de mélange nutritif sans rouge de phénol, le pyruvate et le glucose, supplémenté avec 15 mM NaHCO _3, 15 mM d'HEPES, et 6 mM de lactate (pH 7,4, 295 mosmol / KGH ₂ O). Les supports sont complétés par l'acide L-ascorbique-2-phosphate (50 pM), l'insuline bovine (10 nM), transferrine humaine (5 mg / ml), l'hydrocortisone (50 nm) et le sélénium (5 ng / ml) immédiatement avant changement quotidien des médias.
2. Aspirer les vieux médias de la vaisselle en utilisant une technique stérile. Ajouter 2 ml de milieu frais chaud, à chaque plat en utilisant une technique stérile. Réinternes des cellules tubulaires proximales (RPTC) atteignent la confluence dans environ 5-6 jours après l'étalement. ^1,2

3. L'infection adénovirale de RPTC

1. Infection adénovirale est effectuée dans les cultures confluentes, de repos après le changement RPTC quotidienne de la presse. Dominant négatif PKC ε-mutant (dnPKC-ε) a été construit en remplaçant: 1) la lysine par l'arginine en position 436 du site de liaison à l'ATP et 2) alanine avec du glutamate à la position 159 du domaine pseudo-substrat. Ces mutations détruit l'activité kinase de la construction, sans modification de la conformation active de la PKC-ε ^3. PKC-ε a été faite constitutivement active de suppression des résidus 154-163 de son domaine pseudosubstrat inhibitrice ^4.
2. Ajouter la solution de stock de l'adénovirus porteur caPKC-ε ADNc ou dnPKC-ε ADNc à chaque plat pour obtenir multiplicité désirée d'infection (MOI) résultant en une augmentation significative de la PKC-et epsilsur, les taux de protéine. Incuber RPTC par l'adénovirus pendant 24 heures. Changer les médias et les cellules de culture pour un autre h 24. Niveaux beaucoup plus élevés de phosphorylées et totale PKC-ε protéines peut être obtenue en utilisant 25-50 MOI de vecteur adénoviral codant caPKC-ε. De meilleurs résultats en MOI hausses encore plus importantes dans les niveaux de PKC-ε actif, mais il n'est pas recommandé chez RPTC en raison de la mort cellulaire rapide et la perte. Niveaux beaucoup plus élevés de la PKC-ε inactive la protéine peut être obtenue en utilisant 50-100 MOI dans RPTC sans produire d'effets indésirables ^5.
3. À 48 h après l'infection, les médias aspirés, se laver les monocouches avec du PBS, et recueillir des cellules pour l'analyse par immunoblot pour déterminer la teneur en protéines de la PKC ^ε-5.

4. Mesure de la respiration RPTC

1. Préparer un tampon d'essai pour la mesure de l'état 3 de respiration (120 mM de KCl, 5 mM KH ₂ PO _4, 10 mM d'HEPES, 1 mM MgSO _4, et 2 mM EGTA, pH 7,4). Pour mesurer complexe I-3 état couplé respiration, de compléter le tampon de dosage avec 5 mM de glutamate, malate 5 mM et 0,1 mg / ml digitonine. II complexe de couplage de 3 état respiration, de compléter le tampon de dosage avec 10 mM de succinate, 0,1 uM roténone, et 0,1 mg / ml digitonine. Pour couplage complexe IV-3 état respiration, de compléter le tampon de dosage avec 1 ascorbate mM, 1 mM de N, N, N ', N'-tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD), et 0,1 mg / ml digitonine. Placez les solutions dans un bain d'eau à 37 ° C.
2. Aspirer les médias à partir d'une boîte de culture contenant monocouche RPTC, ajouter 2 ml d'un tampon respiration à l'état chaud 3, grattez délicatement les cellules de l'antenne à l'aide d'une spatule en caoutchouc, et transférer la suspension dans la chambre de consommation d'oxygène équipé d'une électrode de type Clark.
3. Etat de la mesure 2 respiration (en l'absence d'ADP). Initier état respiration 3 par addition d'ADP à une concentration finale de 0,4 mM. Initier l'état 4 respiration en ajoutant oligomycine à un concentr finaletion de 0,5 pg / ml. Respiration découplée est mesurée par addition de 0,5 FCCP uM pour les cellules respirent à l'état 3. ^6,7
4. Recueillir la suspension de cellules à partir de la chambre, précipiter la protéine avec de l'acide perchlorique, et le précipité centrifuger. Déterminer la concentration de protéines dans le culot cellulaire.

5. Analyse du potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm)

1. Préparer 0,5 mM JC-1 solution dans le milieu de culture stérile.
2. Ajouter lentement 20 ul de JC-1 solution pour chaque plat pour obtenir une concentration finale de 5 uM. Agiter le plat pour mélanger le colorant à fond. Retourner les boîtes dans l'étuve pendant 30 min.
3. Mettez les plats sur la glace, les médias aspirés, et laver deux fois avec des monocouches PBS glacé. Aspirer le PBS, ajouter 1 ml de PBS frais, gratter les cellules du plat et de les transférer dans un tube Eppendorf. Break up monocouches dans des cellules individuelles en les pipetage de haut en bas.
4. Faites tourner la suspension vers le bas à 1000 xg pendant 2 min, aspfurieux le surnageant, ajouter 1 ml de PBS au culot et remettre en suspension il pour obtenir une suspension cellulaire unique. Répétez cette étape si nécessaire.
5. Spin cellules vers le bas à 1000 xg pendant 2 min, aspirer le surnageant, ajouter 0,5 ml de PBS, et remettre en suspension le culot. Analyser la fluorescence par cytométrie en flux en utilisant une excitation par un 488-nm laser argon-ion. Lire l'émission en deux canaux séparés, FL1 à 525 nm et à 590 nm FL2. Potentiel de membrane mitochondriale est exprimée en FL2/FL1 rapport de fluorescence ^6.

6. Isolement des mitochondries

1. Préparation des tampons d'isolation: tampon A (10 mM HEPES, 225 mM de mannitol, 75 mM de saccharose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), tampon B (tampon A contenant des inhibiteurs de protéase, 1 mM de Na ₃ VO _4, 1 mM de NaF), et le tampon C (10 mM HEPES, 395 mM de saccharose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Effectuez toutes les étapes de la glace.
2. Laver deux fois avec des monocouches RPTC glacée tampon PBS. Grattez monocouches dans des tubes Eppendorf et les faire tournerà 500 xg pendant 5 min. Laver le culot dans 1 ml de tampon A.
3. Remettre en suspension le culot dans 1 ml de tampon B, et transférer la suspension dans un homogénéisateur Dounce 2 ml.
4. Homogénéiser les cellules dans l'homogénéisateur Dounce jusqu'à la plupart des cellules dans l'homogénat sont cassés lors de l'inspection au microscope.
5. Centrifuger l'homogénat à 1000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et le tourner vers le bas à 15.000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
6. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot contenant les mitochondries brut dans 1 ml de tampon C. Faites tourner les surnageants bas à 15.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Répéter le nettoyage des deux granulés fois plus de ^5.
7. Pour mesurer les activités des complexes respiratoires, rétablir la suspension mitochondriale granulés de 50-100 ul du tampon d'analyse et congeler dans l'azote liquide. Faire dégeler les échantillons lentement sur la glace.

7. Mesure de l'activité de la NADH-ubiquinone oxydoréductase (complexe I)

1. Préparer le tampon de dosage: 10 mM KH ₂ PO _4, 5 _mM de MgCl2, pH 7,2. Ajouter un acide gras libre BSA et NADH pour obtenir des concentrations finales de 0,25% et 0,25 mm, respectivement. Ajouter 2 ul de antimycine Une solution (1 mg / ml) à une concentration finale de 2 mg / ml.
2. Analyser les échantillons dans une plaque à 48 puits transparent. Inclure un échantillon témoin qui a tous les ajouts, mais pas de mitochondries. Pour chaque puits, ajouter 500 ul de tampon de dosage avec des ajouts et des mitochondries, et incuber la plaque à 30 ° C tout en mélangeant pendant 5 min.
3. Démarrer la réaction en ajoutant 10 pl de 3,25 mM ubiquinone dans chaque puits. Enregistrer l'absorbance (340 nm) pendant 3 min dans des intervalles de 20 secondes. Ajouter 5 ul de solution de roténone (1 mg / ml) dans chaque puits et noter l'absorbance de 2 min. Calculer complexe I activité comme la roténone sensible oxydation du NADH ^7.

8. Mesure de l'activité de la succinate-ubiquinone oxydoréductase (complexe II)

Préparer le tampon de dosage contenant 0,25% d'acide gras libre-BSA, 20 mM de succinate de potassium, 0,25 mM 2,6-dichloroindophénol, 2 pg / ml antimycine A, et 10 pg / ml roténone.

Analyser les échantillons en double dans une plaque à 48 puits transparente, y compris un échantillon témoin qui a tous les ajouts, mais pas de mitochondries. Pour chaque puits, ajouter 500 ul de tampon de dosage avec des ajouts et des mitochondries, et incuber la plaque à 30 ° C tout en mélangeant pendant 2 min.

Démarrer la réaction en ajoutant 10 pl de 3,25 mM ubiquinone dans chaque puits. Enregistrer l'absorbance (595 nm) pendant 3 min dans des intervalles de 20 secondes. Calculer Complexe activité II par suite de la réduction du 2,6-dichloroindophénol. ⁷

9. Mesure de l'activité de l'ubiquinol-cytochrome c oxydoréductase (complexe III)

1. Préparer le tampon d'essai contenant 0,1% d'acide gras libre-BSA, 80 mM de succinate de potassium, 10 mg / ml roténone, et 0,24 mM de potassium cyanure.
2. Analyser les échantillonsen double dans une plaque à 48 puits transparente, y compris un échantillon témoin qui a tous les ajouts, mais pas de mitochondries. Pour chaque puits, ajouter ul 291 du tampon de dosage avec des ajouts et des mitochondries, et incuber la plaque à 30 ° C tout en mélangeant pendant 5 min.
3. Démarrer la réaction en ajoutant 3 pi 6 mM de cytochrome c oxydé dans chaque puits. Enregistrer l'absorbance (550 nm) pendant 3 min dans des intervalles de 20 secondes. Ajouter 5 ul de antimycine Une solution (1 mg / ml) dans chaque puits et noter l'absorbance de 2 min. Calculer l'activité complexe III que la réduction antimycine A-sensible cytochrome c ^7.

10. Mesure de l'activité de la cytochrome oxydase (complexe IV)

1. Préparer cytochrome c réduit par l'ajout d'ascorbate de sodium à 9 mM solution de cytochrome c et la dialyse de la solution pendant une nuit à 4 ° C dans 1 litre de tampon phosphate (10 mM KH ₂ PO _4, pH 7,2) contenant 5 _mM de MgCl2. Préparer le tampon de dosage contenant0,1% d'acides gras libres BSA et antimycine A (2 pg / ml).
2. Analyser les échantillons dans une plaque à 48 puits transparente, y compris un échantillon témoin qui a tous les ajouts, mais pas de mitochondries. Pour chaque puits, ajouter 233 ul de tampon de dosage avec des ajouts et des mitochondries, et incuber la plaque à 30 ° C tout en mélangeant pendant 5 min.
3. Démarrer la réaction par addition de réduction du cytochrome c (90 pM concentration finale). Enregistrer l'absorbance (550 nm) pendant 3 min dans des intervalles de 20 secondes. Ajouter 2 ul de solution de KCN (8 pg / ml) dans chaque puits et noter l'absorbance pour encore 2 min. Calculer l'activité complexe IV que l'oxydation KCN sensible cytochrome c ^7.

11. Mesure de l'activité de F ₀ F _1-ATPase (ATP synthase)

1. Préparer F ₀ F _1-ATPase tampon de dosage (10 mM Tris-HCl, 200 mM de KCl, MgCl2 ₂ mM, pH 8,2). Remettre en suspension le culot dans mitochondriale le tampon de dosage, congeler les échantillons mitochondriaux en liquidationd 'azote et décongeler les échantillons lentement sur la glace.
2. Analyser les échantillons en triple dans une plaque à 48 puits transparent. Pour chaque groupe de traitement, 2 puits sera exécuté pour mesurer l'activité ATPase totale (275 pi du tampon de dosage, 5 ul de suspension mitochondriale, et 5 pi d'éthanol à 95%) et 1 puits pour mesurer oligomycine insensible à la casse activité ATPase (275 pl d' le tampon de dosage, 5 ul de suspension mitochondriale, et 5 pi de 1 mg / ml solution oligomycine dans de l'éthanol à 95%).
3. Incuber les échantillons à 31 ° C pendant 10 min avec une agitation constante. Ajouter 16 ul de 100 mM d'ATP solution (pH 7,0) et incuber à 31 ° C pendant 5 min avec une agitation constante.
4. Transférer 200 ul du mélange d'incubation dans un tube contenant 50 pi de 3 M TCA. Incuber les échantillons sur la glace pendant 10 minutes et de les tourner vers le bas à 10.000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Utilisez les surnageants et les boulettes de déterminer le phosphate et la teneur en protéines, respectivement.
5. Déterminer la teneur en phosphate dans les surnageants en utilisant ledosage du phosphate inorganique. Préparer 100 ml de réactif par addition Sumner 0,88 g FeSO ₄ à 10 ml de 3,75 MH ₂ SO ₄ et ajuster à 90 ml avec H ₂ O. Ajouter 10 ml d'une solution de molybdate d'ammonium (0,66 g/10 ml H ₂ O) à la solution de FeSO ₄ dans H ₂ SO _4. Protéger de la lumière.
6. Charge plaque de 96 puits avec 50 ul de chaque norme phosphate (0 - 1,000 uM KH ₂ PO ₄₎ et 50 pi de chaque surnageant en double. Ajouter 250 ul de réactif Sumner dans chaque puits et incuber la plaque à 30 ° C pendant 15 min avec une agitation constante.
7. Enregistrer l'absorbance à 595 nm à température ambiante. F ₀ F _1-ATPase est déterminée en mesurant l'oligomycine sensible à la libération de l'ATP à partir de P _i comme nous l'avons décrit précédemment. Calculer total et ^7,8 oligomycine insensibles F ₀ F _1-ATPase activités. Pour calculer le oligomycine-ATPase sensible activité, il faut soustraire oligomycine insensible à l'activité de l'ATPase totale ^8,9.

12. Mesure de l'ATP intracellulaire contenu

1. Placer les boîtes de culture contenant des monocouches RPTC sur la glace, moyen, aspiration et laver les monocouches deux fois avec du tampon PBS glacé. Ajouter 1 ml de PBS à chaque monocouche, gratter chaque monocouche dans du PBS, et recueillir la suspension cellulaire dans un tube Eppendorf. Faites tourner les tubes Eppendorf dans la microcentrifugeuse pendant 5 sec.
2. Déterminer la teneur en ATP dans chaque échantillon RPTC par la méthode luciférase en utilisant la bioluminescence ATP Assay Kit HS II (Roche) et le protocole du fabricant. Déterminer la concentration en protéine de chaque échantillon et calculer la concentration d'ATP par mg de protéine ^8.

13. Visualisation de la morphologie mitochondriale

1. Changer les milieux de culture. Ajouter 2 ul d'une solution de 100 uM de Mitotracker Rouge 580 à chaque plat (concentration finale. 100 nM) et retourner les plats à la incubator pour 30 min.
2. Examiner les monocouches direct au microscope à fluorescence en utilisant un objectif à immersion d'eau ^5.

14. Analyse de la viabilité cellulaire

1. À 24 h avant de commencer le dosage de préparer une solution à 50 mM de cisplatine pour traiter les cellules qui serviront de témoin positif pour l'apoptose (annexine V-cellules positives). En outre, préparer 500 mM solution de tert-butyle pour traiter les cellules qui serviront de témoins positifs pour les oncose (iodure de propidium cellules positives).
2. Traiter 2 plats avec 2 pi de 50 mM cisplatine et 2 plats avec 2 pi de 500 mM de tert-butyle. Consacrer 1 plat pour un contrôle sans tache.
3. À 24 h après le traitement avec le cisplatine et le TBHP, préparer le tampon de liaison (HEPES 10 mM, 140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de _MgCl2, 1,8 mM CaCl ₂₎ et de l'iodure de propidium (PI) solution (50 pg / ml) dans le tampon de liaison.
4. Laver une fois avec des monocouches le buff contraignanter. Ajouter 1 ml de tampon glacé et 50 pi d'une solution IP à chaque plat sauf pour les sans-tache et l'annexine V-cellules positives. Couvrir et incuber plats sur la glace pendant 15 min avec agitation orbitale en douceur.
5. Laver monocouches avec le tampon de liaison (10 min), ajouter 1 ml de tampon de liaison et 2 pi de l'annexine V-FITC solution à chaque plat sauf pour les cellules sans tache et PI-positif. Couvrir plats et incuber à température ambiante pendant 10 min avec agitation orbitale en douceur.
6. Aspirer le tampon et laver les monocouches avec 1 ml de tampon glacé contraignant sur la glace pendant 10 min avec agitation orbitale en douceur. Répéter l'étape de lavage.
7. Aspirer le tampon de liaison et ajouter 500 ul de tampon de liaison à chaque plat. Grattez délicatement les cellules en utilisant une spatule en caoutchouc et de transférer les cellules de couler des tubes de cytométrie. Disperser les cellules dans une suspension de cellules individuelles par pipetage des échantillons de haut en bas. Briser les amas de cellules.
8. Quantifier PI et l'annexine V-FITC fluorescence immédiatement par flow cytométrie en utilisant une excitation à 488 nm et une émission à 590 et 530 nm pour PI et FITC, respectivement. Comptez 10.000 manifestations pour chaque échantillon.
9. Mettre la fluorescence FITC sur l'axe X et la fluorescence PI sur l'axe des ordonnées des figures de cytométrie de flux de tracé de points. Cellules positives pour l'annexine V et négatif pour les PI sont considérés comme apoptotique. Cellules positives pour le PI et négatif pour l'annexine V sont considérés oncotique. ^10,11

Representative Results

La figure 1 montre que la livraison adénoviral de l'ADNc codant les constitutivement actives (caPKC-ε) et inactifs (dnPKC-ε) des mutants de la PKC-ε aboutit à des niveaux beaucoup plus élevés de la protéine PKC-ε dans RPTC et dans les mitochondries. Les cellules infectées avec le vecteur portant l'ADNc caPKC-ε surexprimé la phosphorylé (actif) sous forme de PKC-ε alors que les cellules infectées avec l'ADNc codant dnPKC-ε-ε surexprimé PKC qui est inactif (pas phosphorylée) (Figure 1). La présence d'actifs PKC-ε diminue la respiration mitochondriale dans RPTC quel que soit le support utilisé pour exciter les mitochondries tandis que les inactifs PKC-ε n'a eu aucun effet (Figure 2). Afin de déterminer les objectifs de l'actif PKC-ε au sein de la chaîne respiratoire, nous avons déterminé les activités de tous les complexes enzymatiques de la chaîne respiratoire. Comme le montre la figure 3 (figure 4). Ces changements ont été accompagnés par une diminution de l'activité de F ₀ F _1-ATPase (ATP synthase) dans les mitochondries isolées de RPTC surexprimant l'activité PKC-ε (figure 5A). En conséquence, la teneur en ATP des RPTC surexprimant l'activité PKC-ε diminué (figure 5B). Activation soutenue de la PKC-ε eu de profonds effets sur la morphologie mitochondriale en induisant une fragmentation mitochondriale (fission) (figure 6B). L'inhibition de la PKC-ε activation, mais pas aussi entraîné des changements dans la morphologie RPTC provoquant un rétrécissement des cellules e allongement des cellules survivantes. Dysfonction mitochondriale et modifications de la morphologie mitochondriale dans RPTC surexprimant l'activité PKC-ε ont été accompagnées par la mort cellulaire par apoptose et à la fois oncose (figure 7). À 48 h après la délivrance de vecteur adénoviral, environ 50% des RPTC surexprimant l'activité PKC-ε ne sont pas viables. La surexpression de la forme inactive de la PKC-ε n'a eu aucun effet sur la fonction mitochondriale et la morphologie, et sur la viabilité du programme ordinaire.

Ainsi, la livraison adénoviral des ADNc codant différentes isozymes de la PKC est un outil efficace permettant la surexpression sélective des isozymes de PKC et de leurs mutants actifs ou inactifs dans des cultures primaires de cellules rénales. Il permet une transfection efficace des cellules en culture primaire et pour l'étude de la régulation de différentes fonctions cellulaires et pour l'évaluation de la morphologie et la viabilité cellulaire par des protéines kinases.

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Figure 1. Les teneurs en protéines de phosphorylée (active) PKC-ε (p-PKC-ε) et le total des PKC ε dans homogénats cellulaires (panneau de gauche) et les mitochondries (panneau de droite) isolé à partir de cultures primaires de RPTC infectées par le vecteur adénoviral porteur du mutants constitutivement actifs (caPKC-ε) ou inactif (dnPKC-ε) de la PKC-ε à différents moments après l'accouchement vecteur adénoviral. Les niveaux de β-actine et F ₀ F _1-ATPase sont utilisés comme témoins de chargement de gel pour homogénats cellulaires et les mitochondries, respectivement. Figure modifiée à partir de Nowak et al. ⁵

Figure 2. Etat3 et découplé respirations dans RPTC exprimant les mutants actifs et inactifs de la PKC-ε à 48 heures après l'accouchement adénoviral. Pour l'état 3 la respiration, dans les mitochondries des cellules perméabilisées-digitonine ont été mis sous tension en utilisant 5 mM de glutamate + 5 mM malate (substrats oxydés par complexe I), 10 mM de succinate de roténone + uM 0,1 (substrat oxydé par le complexe II), ou l'ascorbate de 1 mM + 1 mM de N, N, N ', N'-tétraméthyl-p-phénylènediamine (TMPD) (substrats oxydés par complexe IV). Les résultats sont la moyenne ± SE. * - P <0,05.

Figure 3. Activités du complexe I et IV complexe dans les mitochondries isolées de RPTC exprimant les mutants actifs et inactifs de la PKC-ε à 48 heures après l'accouchement vecteur adénoviral. Les résultats sont la moyenne ± SE. * - P <0,05.

Figure 4. Dépendant du temps les changements du potentiel membranaire mitochondrial (ΔΨm) dans l'infection suivante RPTC avec vecteur adénoviral portant les mutants constitutivement actifs (caPKC-ε) et inactifs (dnPKC-ε) de la PKC-ε. Les résultats sont exprimés comme le rapport de l'agrégat de formes monomères de JC-1. Les résultats sont la moyenne ± SE. * - P <0,05.

Figure 5. Activité de F ₀ F _1-ATPase dans les mitochondries isolées (A) et la teneur en ATP (B)dans RPTC exprimant les mutants actifs et inactifs de la PKC-ε à 48 heures après l'accouchement vecteur adénoviral. Les résultats sont la moyenne ± SE. * - P <0,05.

Figure 6. Morphologie mitochondriale dans RPTC direct exprimant les mutants actifs et inactifs de la PKC-ε à 48 heures après l'accouchement vecteur adénoviral. A. Contrôles non infectés. B. RPTC exprimer caPKC-ε. C. RPTC exprimer dnPKC-ε. Des images représentatives de cellules vivantes examiné sous un microscope à fluorescence. Grossissement original, X630.

Figure 7. Dépendant du temps des changements dans RPTC oncose (A) et de l'apoptose (B) ci-après infection avec le vecteur adénoviral portant les mutants constitutivement actives (caPKC-ε) ou inactive (dnPKC-ε) de la PKC-ε. L'infection par des particules adénovirales codant pour un vecteur vide pShuttle (MOI = 50) conduit à 5,2 ± 2,3% oncose et 5,5 ± 1,0% à l'apoptose 48 h après l'infection. Les résultats sont la moyenne ± SE. * - P <0,05. C. Représentant dot plots démontrant l'annexine V et de la fluorescence iodure de propidium dans RPTC surexprimant caPKC-ε et ε-dnPKC à 48 heures après l'accouchement vecteur adénoviral.

Discussion

L'approche présentée ici permet la surexpression des isozymes de la PKC individuelles dans la culture primaire de cellules tubulaires proximales rénales. Il ya plusieurs points forts de cette approche: 1. Il permet d'enquêter sur les mécanismes de régulation dans une population homogène de cellules (cellules tubulaires proximales rénales) qui sont la principale cible des insultes diverses (ischémie, l'hypoxie, stress oxydatif), les médicaments et nephrotoxicants dans le rein. 2. Fonctions mitochondriales dans ce modèle in vitro de RPTC mises en culture primaire dans les meilleures conditions ressemblent à des fonctions mitochondriales de tubules proximaux in vivo. ^1,2 3. Réponse des mitochondries à des substances toxiques différents dans ce modèle in vitro est similaire à la réponse de tubules proximaux in vivo. 4. Cette approche permet une transfection efficace et la livraison de gènes codant pour des protéines spécifiques, y compris les protéines impliquées dans la transduction du signal mécaniquesms qui régulent les fonctions mitochondriales. Ainsi, ce modèle permet l'expression sélective des isozymes constitutivement actives et inactives des kinases et phosphatases et remplace la nécessité d'inhibiteurs et d'activateurs pharmacologiques qui ne sont pas aussi sélectifs et ont souvent des effets secondaires toxiques. Les limites de ce modèle sont les suivants: 1. en utilisant RPTC cultivées dans un environnement in vitro ne permet pas d'étudier les signaux paracrines et endocrines qui contribuent à la régulation de la fonction mitochondriale dans les tubules proximaux in vivo, et 2. ce modèle ne permet pas d'étudier les maladies chroniques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laminar flow hood	Thermo Electron Corporation	FORMA 1104
2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder	WHEATON	989-24607, 357544
85 and 235 micron nylon mesh	Small Parts	CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
50 ml sterile centrifuge tube	BIOLOGIX	BCT-P 50BS
1.5 ml micro tube	Sarstedt	72.690.001
35 x 10 mm sterile culture dishes	Corning	430165
Jouan Centrifuge	Jouan	Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
Adjustable micro-centrifuge	SIGMA	Model 1 - 15
Biological Oxygen Monitor	YSI Incorporated	YSI Model 5300A
Single Chamber Micro Oxygen System	YSI Incorporated	5356S
Oxygen Probe	YSI Incorporated	5331A
Circulating Bath	YSI Incorporated	5310
KCl and Standard Membrane Kit	YSI Incorporated	5775
Magnetic Stirrer	YSI Incorporated	5222
Flatbed Recorder	Kipp Zonen	BD 11E
48-well and 96-well transparent plates	Costar	3548, 3679
Thermomixer R	Eppendorf	5355 21919
Orbital shaker MAXQ 2000	Thermo Scientific	SHKA 2000
Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader)	Tecan	F129005
Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator	NUAIRE	NU 4850
12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry	Fisher Brand	14-961-20
Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W	Carl Zeiss	114846 ACHROPLAN 44 00 67
DMEM / F12	Cellgro	99 - 830 - PB
DMEM / F12 Ham	Sigma	D 2906 - 1L
Deferoxamine Mesylate	Hospira	D110
Collagenase Type I	Worthington	4196
Trypsin inhibitor	Sigma	T 6522 - 500mg
5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1)	Invitrogen	T3168
Mitotracker Red	Invitrogen	M22425
ATP Bioluminescence Assay Kit HS II	Roche	11 699 709 001
Annexin V - FITC solution	BioVision	1001 - 200
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACSCalibur