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Biology

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

doi: 10.3791/4301 Published: January 7, 2013

Summary

Die Wirkungen der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) Isozyme auf die mitochondriale Atmung und Funktionen mit oxidativen Phosphorylierung und auf Lebensfähigkeit der Zellen assoziiert werden beschrieben. Der Ansatz paßt adenoviralen Technik, um selektiv überexprimieren PKC-Isozyme in primären Zellkultur und einer Vielzahl von Assays, um mitochondriale Funktionen und Energiezustand der Zelle zu bestimmen.

Abstract

Die Proteinkinase C (PKC)-Familie von Isozymen sind in zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Unsere jüngsten Daten zeigen, dass PKC Funktion der Mitochondrien und zellulärer Energie-Status regelt. Zahlreiche Berichte zeigten, dass die Aktivierung von PKC-a und PKC-ε mitochondrialen Funktion im ischämischen Herz und vermittelt Kardioprotektion verbessert. Im Gegensatz dazu haben wir gezeigt, dass PKC-α und PKC-ε in nephrotoxicant-induzierte mitochondriale Dysfunktion und Zelltod in Nierenzellen beteiligt sind. Daher war das Ziel dieser Studie, um eine In-vitro-Modell der Nierenzellen erhalten aktive mitochondriale Funktionen, in denen PKC Isoenzyme selektiv aktiviert werden könnten oder gehemmt, um ihre Rolle in der Regulation der oxidativen Phosphorylierung und das Überleben der Zelle zu bestimmen entwickeln. Primäre Kulturen der renalen proximalen Tubuluszellen (RPTC) in verbesserten Bedingungen, die die mitochondriale Atmung und die Aktivität der mito kultiviertmitochondrialen Enzyme ähnlich denen in RPTC in vivo. Da herkömmliche Transfektionstechniken (Lipofectamin, Elektroporation) ineffizient primären Kulturen und haben negative Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien, wurden PKC-ε mutierten cDNAs RPTC durch adenovirale Vektoren geliefert. Dieser Ansatz führt zu Transfektion von über 90% kultivierten RPTC.

Hier präsentieren wir Methoden für die Beurteilung der Rolle von PKC-ε in: 1. Regulation der mitochondrialen Morphologie und Funktionen mit ATP-Synthese und 2 zugeordnet. Überleben RPTC in Primärkultur. PKC-ε wird durch Überexpression der konstitutiv aktiven PKC-ε-Mutante aktiviert. PKC-ε wird durch Überexpression inhibiert die inaktive Mutante von PKC-ε. Mitochondriale Funktion wird durch die Untersuchung der Atmung, Integrität der Atmungskette, Aktivitäten der Atemwege Komplexe und beurteilt F 0 F 1-ATPase, ATP Produktionsrate und ATP-Gehalt. Atmung ist einssessed in Digitonin-permeabilisierten RPTC als Zustand 3 (maximal Atmung in Gegenwart eines Überschusses an Substraten und ADP) und entkoppelt Atmung. Integrität der Atmungskette wird durch Messen Aktivitäten aller vier Komplexe der Atmungskette in isolierten Mitochondrien beurteilt. Kapazität der oxidativen Phosphorylierung wird durch Messen des mitochondrialen Membranpotentials ausgewertet, ATP Produktionsrate und Aktivität von F 0 F 1-ATPase. Energiezustand RPTC wird durch Bestimmung der intrazellulären ATP-Gehalt untersucht. Mitochondrienmorphologie in lebenden Zellen visualisiert MitoTracker Red 580, ein fluoreszierender Farbstoff, der spezifisch akkumuliert in Mitochondrien und Live-Monoschichten sind unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. RPTC Lebensfähigkeit wird anhand Annexin V / Propidiumiodid-Färbung durchflusszytometrisch gefolgt, um Apoptose und oncosis bestimmen.

Diese Methoden ermöglichen eine selektive Aktivierung / Hemmung der einzelnen PKC-Isozymeum ihre Rolle in der zellulären Funktionen in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Zuständen, die in in vitro reproduzieren lässt beurteilen.

Protocol

Ein. Isolation der proximalen Nierentubuli für primäre Kultur

  1. Anesthetize das Kaninchen, Verbrauchssteuern beide Nieren und legen Sie sie in einer Petrischale mit sterilem prep Puffer (DMEM/F12-Medium) in einer Laminarströmungshaube gefüllt.
  2. Perfundieren jeder Niere mit 50 ml Puffer durch prep 50 ml sterilem gefolgt phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) und PBS-Eisenoxid-Lösung (45 ml + 5 ml). De-kapseln Nieren und übergeben sie an die prep Puffer mit Deferoxamin.
  3. Ernten die Rinde jeder Niere.
  4. Homogenisieren des Gewebes mit einer 15 ml Dounce Homogenisator. Gießen des Homogenats auf 2 sterile Mesh Siebe (85 um auf der Unterseite und auf der Oberseite 235 um) über einen 1 L sterilen Becherglas gegeben. Spülen Sie die Siebe mit Deferoxamin-haltigem Puffer.
  5. Sammeln Sie alle Gewebe auf der 85 um-Sieb in einen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen mit 35-40 ml der Deferoxamin-haltigen Puffer gefüllt gelassen. Vorsichtig mischen die Zellsuspension.
  6. Legen Sie einen starken magnet außerhalb der Röhre zu entfernen Eisen gefüllt Glomeruli und damit sich das Fahrwerk zu begleichen. Absaugen Eisen vom Magneten mit einer Pasteurpipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang.
  7. Planen 1 ml Medium, enthaltend Verdauung 2,400-2,500 Einheiten Collagenase I und 0,6 mg Sojabohnentrypsininhibitor in der Deferoxamin-haltigen Puffer gelöst. Filtern sterilisieren die Verdauung Medium.
  8. Stellen Sie die Lautstärke der Zellsuspension zu 40 ml und 1 ml der Verdauung Medium. Inkubation bei Raumtemperatur für 17 min sanft Mischen der Suspension, Zentrifuge bei 50 xg für 2 min bei 4 ° C, saugen das Medium, und fügen Sie frische Deferoxamin Puffer.
  9. Wiederhole die Eisen-entfernenden Prozedur mit dem Magneten mehrfach, drehen die Suspension wieder absaugen Mediums, und geben 46 ml Medium ohne Glucose.
  10. Vorsichtig mischen und messen Sie 500 ul der Suspension in zwei vorgewogenen Eppendorf-Röhrchen. Spin Zellen nach unten bei 10.000 xg für 1 min, saugen die Medien, und wiegen das Pellet. Berechnen der Gesamtausbeute an feuchten Masse und Protein.
  11. Platte die Zellen in steriler 35 mm Kulturschalen bei der Dichte von 1 mg Protein / Schale mit Glucose-freie DMEM/F12 Medium. Kultur-Zellen in 2 ml Glucose-frei DMEM/F12-Medium immer auf einem Schüttler im Brutschrank bei 37 ° C (95% Luft / 5% CO 2). 1,2

2. Renal proximalen Tubulus Cell Culture

  1. Das Kulturmedium ist eine 50:50-Mischung aus DMEM und Hams F-12 Nährstoffmix ohne Phenolrot, Pyruvat und Glucose, mit 15 mM NaHCO3, 15 mM HEPES, 6 mM und Lactat (pH 7,4, 295 mosmol / kg H ergänzt 2 O). Die Medien werden mit L-Ascorbinsäure-2-phosphat (50 uM), Rinderinsulin (10 nM), humanes Transferrin (5 mg / ml), Hydrocortison (50 nM) und Selen (5 ng / ml) unmittelbar vor ergänzt täglichen Medien-Wechsel.
  2. Absaugen alten Medien von Speisen mit einer sterilen Technik. 2 ml warmes, frisches Medium zu jedem Gericht mit einer sterilen Technik. Renal proximalen Tubuluszellen (RPTC) erreichen Konfluenz in ca. 5-6 Tage nach dem Ausplattieren. 1,2

3. Adenoviralen Infektion RPTC

  1. Adenoviralen Infektion erfolgt in konfluenten, ruhenden Kulturen RPTC nach dem täglichen Medienwechsel durchgeführt. Dominant negative PKC-ε-Mutante (dnPKC-ε) wurde durch den Ersatz aufgebaut: 1) Lysin mit Arginin an Position 436 des ATP-Bindungsstelle und 2) Alanin mit Glutamat an Position 159 des Pseudosubstrat Domäne. Diese Mutationen zerstört das Konstrukt der Kinase-Aktivität, ohne die aktive Konformation von PKC-ε. 3 PKC-ε gemacht wurde konstitutiv aktiv durch Deletion der Reste 154-163 der hemmenden Pseudosubstrat Domäne. 4
  2. Hinzufügen Stammlösung des Adenovirus trägt caPKC-ε-cDNA oder dnPKC ε cDNA zu jeder Schale zu wünschen Multiplizität der Infektion (MOI), was zu deutlichen PKC-& Epsil erhaltenauf; Proteinspiegel. Inkubieren RPTC mit Adenovirus für 24 Stunden. Ändern Medien und Kultur Zellen für weitere 24 Stunden. Signifikant erhöhte phosphorylierten und insgesamt PKC-ε Proteine ​​können unter Verwendung 25-50 MOI von adenoviralen Vektor Kodierung caPKC-ε werden. Größere MOI Ergebnisse in noch größeren Anstieg in der Höhe der aktiven PKC-ε, aber es ist nicht in RPTC empfohlen aufgrund der raschen Zelltod und Verlust. Deutlich erhöhte Mengen des inaktiven PKC-ε Protein kann unter Verwendung 50-100 MOI in RPTC werden, ohne negative Auswirkungen. 5
  3. Bei 48 Stunden nach der Infektion, Aspirat Medien, wäscht die Monoschichten mit PBS, und sammeln Zellen für Immunoblot-Analyse, um Proteinspiegel von PKC-ε zu bestimmen. 5

4. Messung des RPTC Respiration

  1. Bereiten Sie ein Assay-Puffer zur Messung Zustand 3 Atmung (120 mM KCl, 5 mM KH 2 PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO 4, und 2 mM EGTA, pH 7,4). Zum Messen Komplex I-gekoppelten Zustand 3 Atmung, ergänzen das Assay-Puffer mit 5 mM Glutamat, 5 mM Malat und 0,1 mg / ml Digitonin. Für komplexe II-gekoppelten Zustand 3 Atmung, ergänzen das Assay-Puffer mit 10 mM Succinat, Rotenon 0,1 uM und 0,1 mg / ml Digitonin. Für komplexe IV-gekoppelten Zustand 3 Atmung, ergänzen das Assay-Puffer mit 1 mM Ascorbat, 1 mM N, N, N ', N'-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) und 0,1 mg / ml Digitonin. Legen Sie die Lösungen in einem 37 ° C Wasserbad.
  2. Saugen Sie Medien aus einer Kulturschale mit RPTC Monoschicht, 2 ml warmem Zustand 3 Atmung Puffer, vorsichtig abkratzen Zellen aus der Schale mit einem Gummihammer Polizist, und übertragen Sie die Suspension auf den Sauerstoffverbrauch Kammer mit einer Clark-Elektrode ausgestattet.
  3. Measure Zustand 2 Atmung (in Abwesenheit von ADP). Initiieren Zustand 3 Atmung durch Zugabe ADP zu einer Endkonzentration von 0,4 mM. Initiieren Zustand 4 Atmung indem Oligomycin zu einer endgültigen konzentration von 0,5 ug / ml. Entkoppelt die Atmung wird durch Zugabe von 0,5 uM FCCP die Zellen atmenden an staatlichen 3 gemessen. 6,7
  4. Sammeln Sie die Zellsuspension aus der Kammer, fallen Proteins mit Perchlorsäure und Spin-down des Niederschlags. Bestimmen Proteinkonzentration im Zellpellet.

5. Analyse des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm)

  1. Bereiten 0,5 mM JC-1-Lösung in der sterilen Kulturmedium.
  2. Fügen Sie langsam 20 ul JC-1-Lösung zu jedem Gericht bis zur endgültigen Konzentration von 5 uM erhalten. Swirl das Gericht, um den Farbstoff gründlich mischen. Bringen Sie die Speisen in den Inkubator für 30 min.
  3. Setzen Gerichte auf Eis, absaugen Medien, und waschen Monoschichten zweimal mit eiskaltem PBS. Aspirate PBS, 1 ml frischem PBS, kratzen Zellen aus der Schüssel und übertragen Sie sie auf einem Eppendorf-Röhrchen. Break up Monoschichten in einzelne Zellen durch Pipettieren sie rauf und runter.
  4. Spin die Aussetzung hinunter auf 1.000 xg für 2 min, aspwütend den Überstand, 1 ml PBS zu dem Pellet und wieder aussetzen, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Schritt bei Bedarf erneut.
  5. Spin Zellen nach unten bei 1.000 xg für 2 min, den Überstand aspirieren, 0,5 ml PBS und Resuspendieren des Pellets. Analysieren Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der Anregung durch einen 488-nm Argon-Ionen-Laser ist. Lesen der Emission in zwei separaten Kanälen, FL1 bei 525 nm und bei 590 nm FL2. Mitochondrienmembranpotentials als FL2/FL1 Fluoreszenz-Ratio ausgedrückt. 6

6. Isolierung von Mitochondrien

  1. Planen Isolationspuffern: Puffer A (10 mM HEPES, 225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), Puffer B (Puffer A, enthaltend Protease-Inhibitoren, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF), und Puffer C (10 mM HEPES, 395 mM Sucrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Führen Sie alle Schritte auf dem Eis.
  2. Waschen RPTC Monoschichten zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer. Kratzen Monoschichten in Eppendorf-Röhrchen und drehen siebei 500 × g für 5 min. Waschen des Pellets in 1 ml Puffer A
  3. Resuspendieren des Pellets in 1 ml Puffer B, und übertragen Sie die Suspension auf eine 2 ml Dounce Homogenisator.
  4. Homogenisieren Zellen im Dounce-Homogenisator, bis die meisten der Zellen im Homogenat gebrochen werden, wenn es unter einem Mikroskop untersucht.
  5. Zentrifuge das Homogenat bei 1.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand nach unten und Spin bei 15.000 × g für 10 min bei 4 ° C.
  6. Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren das Pellet enthaltende rohe Mitochondrien in 1 ml Puffer C Drehen Sie die Überstände unten bei 15.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie das Waschen der Pellets zwei weitere Male. 5
  7. Um die Aktivitäten von Atemwegs-Komplexe zu messen, resuspendieren mitochondrialen Pellet in 50-100 ul Assaypuffer und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Auftauen Proben langsam auf Eis.

7. Messung der Aktivität der NADH-Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I)

  1. Bereiten Sie die Assay-Puffer: 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. Hinzufügen Fettsäure-freies BSA und NADH zu Endkonzentrationen von 0,25% und 0,25 mM zu erhalten sind. Add 2 ul Antimycin A-Lösung (1 mg / ml) auf eine Endkonzentration von 2 ug / ml.
  2. Führen Sie die Proben in einem 48-Well-transparente Platte. Fügen Sie eine Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem Well, 500 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 5 min.
  3. Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 3,25 mM Ubichinon in jede Vertiefung. Notieren Sie sich die Absorption (340 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Fügen Sie 5 ul Rotenon-Lösung (1 mg / ml) in jede Vertiefung und Absorption für weitere 2 min. Berechnen Komplex I Aktivität wie das Rotenon-sensitive NADH Oxidation. 7

8. Messung der Aktivität der Succinat-Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex II)

Bereiten Sie die Assay-Puffer, der 0,25% Fettsäure-freies BSA, 20 mM Kaliumsuccinat, 0,25 mM 2,6-Dichlorindophenol, 2 pg / ml Antimycin A und 10 ug / ml Rotenon.
  • Führen Sie die Proben in Duplikate in einer 48-Well-transparente Platte, einschließlich einer Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem Well, 500 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 2 min.
  • Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 3,25 mM Ubichinon in jede Vertiefung. Notieren Sie sich die Absorption (595 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Berechnen Complex II-Aktivität, indem Sie die Reduktion von 2,6-Dichlorindophenol. 7
  • 9. Messung der Aktivität von Ubiquinol-Cytochrom c Oxidoreduktase (Komplex III)

    1. Bereiten Sie die Assay-Puffer mit 0,1% Fettsäure-freies BSA, 80 mM Kaliumsuccinat, 10 ug / ml Rotenon und 0,24 mM Kaliumcyanid.
    2. Führen Sie die Probenin Duplikate in einer 48-Well-transparente Platte einschließlich einer Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem gut, fügen 291 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 5 min.
    3. Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 3 ul 6 mM oxidiertes Cytochrom c in jede Vertiefung. Notieren Sie sich die Absorption (550 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Fügen Sie 5 ul Antimycin A-Lösung (1 mg / ml) in jede Vertiefung und Absorption für weitere 2 min. Berechnen komplexer III Tätigkeit als Antimycin A-sensitive Cytochrom c Reduktion. 7

    10. Messung der Aktivität von Cytochrom-Oxidase (Komplex IV)

    1. Reduziert Cytochrom c durch Zugabe Natriumascorbat bis 9 mM Lösung von Cytochrom c und Dialysieren der Lösung über Nacht bei 4 ° C in 1 L Phosphatpuffer (10 mM KH 2 PO 4, pH 7,2), enthaltend 5 mM MgCl 2 vorzubereiten. Bereiten Sie die Assay-Puffer mit0,1% Fettsäure-freies BSA und Antimycin A (2 ug / ml).
    2. Führen Sie die Proben in einem 48-Well-transparente Platte, einschließlich einer Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem gut, fügen 233 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 5 min.
    3. Startet die Reaktion durch Zugabe von reduziertem Cytochrom c (90 uM Endkonzentration). Notieren Sie sich die Absorption (550 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Fügen Sie 2 ul KCN-Lösung (8 pg / ml) in jede Vertiefung und Absorption für weitere 2 min. Berechnen komplexer IV Tätigkeit als KCN-sensitive Cytochrom c Oxidation. 7

    11. Messung der Aktivität von F 0 F 1-ATPase (ATP-Synthase)

    1. Planen F 0 F 1-ATPase-Assay-Puffer (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl 2, pH 8,2). Resuspendieren mitochondrialen Pellet im Assaypuffer, eingefroren mitochondrialen Proben in liquid Stickstoff und Auftauen der Proben langsam auf Eis.
    2. Führen Sie die Proben in dreifacher Ausführung in einer 48-Well-transparente Platte. Für jede Behandlungsgruppe werden 2 Brunnen laufen, um insgesamt ATPase-Aktivität (275 ul der Assay-Puffer, 5 ul mitochondriale Suspension und 5 ul 95% Ethanol) und 1 messen gut Oligomycin-und Kleinschreibung ATPase-Aktivität zu messen (275 ul werden der Assay-Puffer, 5 ul mitochondrialen Suspension und 5 ul 1 mg / ml Oligomycin Lösung in 95% Ethanol).
    3. Inkubieren Proben bei 31 ° C für 10 min unter ständigem Schütteln. Hinzufügen 16 ul 100 mM ATP-Lösung (pH 7,0) und Inkubation bei 31 ° C für 5 min unter ständigem Schütteln.
    4. Übertragen 200 ul des Inkubationsgemisches mit einem Rohr mit 50 ul 3 M TCA. Inkubieren auf Eis für 10 min und Spin sie unten bei 10.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Verwenden Überstände und Pellets zu Phosphat und Protein-Gehalt zu bestimmen sind.
    5. Bestimmen Phosphatgehalt in den Überständen mit demanorganisches Phosphat-Assay. Bereiten 100 ml Sumner Reagenz, indem 0,88 g FeSO 4 bis 10 ml von 3,75 MH 2 SO 4 und die Anpassung an 90 ml mit H 2 O. Man gibt 10 ml Ammoniummolybdat-Lösung (0,66 g/10 ml H 2 O) zu der Lösung von FeSO 4 in H 2 SO 4. Vor Licht schützen.
    6. Last 96-Well-Platte mit 50 ul jeder Phosphat-Standard (0 - 1.000 uM KH 2 PO 4) und 50 ul von jedem Überstand in Duplikate. Fügen Sie 250 ul der Sumner Reagenz in jedes Well pipettieren und die Platte bei 30 ° C für 15 min unter ständigem Schütteln.
    7. Notieren Sie sich die Absorption bei 595 nm bei Raumtemperatur. F 0 F 1-ATPase-Aktivität durch Messen der Oligomycin-sensitive Freisetzung von P i von ATP, wie wir vorher beschrieben, bestimmt. 7,8 berechnen und Oligomycin-insensitive F 0 F 1-ATPase-Aktivitäten. Um die Oligomycin-ATPase aktiviert berechnenvität, subtrahieren Oligomycin-und Kleinschreibung Aktivität aus dem gesamten ATPase-Aktivität. 8,9

    12. Messung der intrazellulären ATP Inhalt

    1. Ort Kulturschalen mit RPTC Monoschichten auf Eis, absaugen Medium, und waschen Sie die Monoschichten zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer. 1 ml PBS in jeder Monoschicht, kratzen jede Monoschicht in PBS, und sammelt die Zellsuspension in ein Eppendorf-Röhrchen. Drehen Sie die Eppendorf-Röhrchen in der Mikrozentrifuge für 5 sek.
    2. Bestimmen ATP-Gehalt in jeder Probe durch die RPTC Luziferase unter Verwendung des ATP-Biolumineszenz-Assay-Kit II HS (Roche) und dem Protokoll des Herstellers. Bestimmen Proteinkonzentration in jeder Probe zu berechnen und ATP-Konzentration pro mg Protein. 8

    13. Visualisierung der mitochondrialen Morphologie

    1. Ändern Kulturmedien. Add 2 ul 100 uM Lösung von MitoTracker Red 580 zu jedem Gericht (Endkonzentration. 100 nM) und geben die Gerichte auf den incubator für 30 min.
    2. Untersuchen Sie die Live-Monoschichten unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Eintauchen in Wasser Ziel. 5

    14. Analyse der Lebensfähigkeit der Zellen

    1. Bei 24 Stunden vor Beginn der Testdurchführung vorzubereiten 50 mM Lösung von Cisplatin an Zellen, die als positive Kontrolle für Apoptose (Annexin V-positive Zellen) dienen werden, zu behandeln. Auch bereiten 500 mM Lösung von tert.-Butylhydroperoxid zu Zellen, die als positive Kontrollen für oncosis (Propidiumiodid-positive Zellen) dienen werden, zu behandeln.
    2. Gönnen 2 Gerichte mit 2 ul 50 mM Cisplatin und 2 Gerichte mit 2 ul 500 mM tert-Butylhydroperoxid. Widmen 1 Gericht für eine no-Fleck Kontrolle.
    3. Bei 24 Stunden nach der Behandlung mit Cisplatin und TBHP, bereiten den Bindungspuffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2) und Propidiumiodid (PI)-Lösung (50 g / ml) im Bindungspuffer.
    4. Waschen Monoschichten einmal mit der Bindung Buffer. 1 ml der eiskaltem Puffer und 50 ul PI-Lösung zu jedem Gericht mit Ausnahme der no-Fleck und Annexin V-positiven Zellen. Titelbild Gerichte und auf Eis inkubieren für 15 min mit sanften kreisförmigen Schütteln inkubiert.
    5. Waschen Monoschichten mit dem Bindungspuffer (10 min) und 1 ml Bindungspuffer und 2 ul Annexin V-FITC-Lösung zu jedem Gericht außer no-Fleck und PI-positiven Zellen. Titelbild Gerichte und Inkubation bei RT für 10 min mit sanften kreisförmigen Schütteln inkubiert.
    6. Saugen Sie die Puffer und waschen Sie die Monoschichten mit 1 ml der eiskalten Bindungspuffer auf Eis für 10 min mit sanften kreisförmigen Schütteln inkubiert. Wiederholen Sie den Waschschritt.
    7. Saugen Sie die Bindungspuffer und 500 ul Bindungspuffer zu jedem Gericht. Vorsichtig kratzen die Zellen unter Verwendung eines Gummi-Polizist und übertragen die Zellen Durchflusszytometrie Rohre fließen. Disperse die Zellen zu einer einzigen Zelle Suspension durch Pipettieren Proben nach oben und unten. Break up keine Zellhaufen.
    8. PI und quantifizieren Annexin V-FITC-Fluoreszenz sofort durch flow Zytometrie mit Anregung bei 488 nm und Emission bei 590 und 530 nm für PI und FITC sind. Count 10.000 Ereignisse pro Probe.
    9. Legen Sie die FITC Fluoreszenz auf der X-Achse und der PI-Fluoreszenz auf der Y-Achse der Durchflusszytometrie Punktgraph Zahlen. Zellen positiv für Annexin V und negativ für PI werden als apoptotisch. Zellen positiv für PI und negativ für Annexin V gelten onkotischen. 10,11

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    Representative Results

    Abbildung 1 zeigt, dass adenoviralen Lieferung von cDNA, welche die konstitutiv aktiv (caPKC-ε) und inaktiv (dnPKC-ε) Mutanten von PKC-ε zu einer signifikant erhöhten Proteingehalt von PKC-ε in RPTC und in Mitochondrien. Zellen mit cDNA tragenden caPKC-ε Vektor infiziert überexprimiert das phosphorylierte (aktiver) Form von PKC-ε während Zellen mit cDNA kodierenden dnPKC-ε überexprimierte PKC-ε die inaktiv war (nicht phosphoryliert) (Abbildung 1) infiziert. Die Anwesenheit von aktiven PKC-ε verringert mitochondrialen Atmung im RPTC unabhängig von dem Substrat verwendet werden, um Energie Mitochondrien während der inaktiven PKC-ε hatte keinen Effekt (Abbildung 2). Um die Ziele der aktiven PKC-ε innerhalb der Atmungskette zu bestimmen, haben wir festgestellt, die Aktivitäten aller enzymatische Komplexe der Atmungskette. Wie in 3 gezeigt (Abbildung 4) zugeordnet ist. Diese Änderungen wurden durch eine Abnahme in der Aktivität der F 0 F 1-begleitet ATPase (ATP-Synthase) in Mitochondrien aus RPTC Überexprimieren der aktive PKC-ε (5A) isoliert. Als Ergebnis der ATP-Gehalt RPTC Überexprimieren der aktive PKC-ε verringert (5B). Anhaltende Aktivierung von PKC-ε hatte tiefgreifende Auswirkungen auf die mitochondriale Morphologie durch Induktion mitochondrialer Fragmentierung (Spaltung) (6B). PKC-ε-Aktivierung, aber nicht Hemmung, führte auch zu Veränderungen im RPTC Morphologie verursacht Zellschrumpfung ein nd Verlängerung der überlebenden Zellen. Mitochondriale Dysfunktion und Veränderungen im mitochondrialen Morphologie in RPTC Überexprimieren der aktive PKC-ε wurden von Zelltod sowohl oncosis und Apoptose (Abbildung 7) begleitet. Bei 48 Stunden nach der adenovirale Vektor-Zufuhrstruktur, waren ungefähr 50% der aktiven RPTC überexprimierende PKC-ε nicht lebensfähig. Überexpression des inaktiven Form der PKC-ε hatte keine Wirkung auf die mitochondriale Funktion und Morphologie, und auf RPTC Lebensfähigkeit.

    Somit ist adenoviralen Lieferung von cDNA, welche verschiedene Isozyme von PKC ein wirksames Instrument zur selektiven Überexpression von einzelnen PKC-Isozyme und deren aktive oder inaktive Mutanten in Primärkulturen von Nierenzellen. Es ermöglicht eine effiziente Transfektion von Zellen in primären Kultur gezüchtet und zur Untersuchung der Regulation verschiedener Zellfunktionen und für die Beurteilung der Zellmorphologie und Lebensfähigkeit von Proteinkinasen.

    ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Abbildung 1
    Abbildung 1. Protein Ebenen der phosphorylierten (aktiv) PKC-ε (p-PKC-ε) und insgesamt PKC-ε in Zellhomogenaten (links) und Mitochondrien (rechts) aus Primärkulturen von RPTC mit adenoviralen Vektor, der die infizierte isoliert konstitutiv aktiven (caPKC-ε) oder inaktiven Mutanten (dnPKC-ε) der PKC-ε zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Adenovirusvektor Lieferung. Die Niveaus der β-Actin und F 0 F 1-ATPase werden als Kontrollen für Gelbeladung Zellhomogenaten und Mitochondrien, jeweils verwendet. Von Nowak et al modifizierten Abbildung. 5

    Abbildung 2
    Abbildung 2. Staat3 und entkoppelt Atmungen in RPTC Exprimieren der aktiven und inaktiven Mutanten von PKC-ε bei 48 Stunden nach Adenovirus-Lieferung. Für den Zustand 3 Atmung, wurden Mitochondrien in Digitonin-permeabilisierten Zellen erregt mit 5 mM Glutamat + 5 mM Malat (Substrate durch Komplex I oxidiert), 10 mM Succinat + 0,1 uM Rotenon (Substrat durch komplexe II oxidiert), oder 1 mM Ascorbat + 1 mM N, N, N ', N'-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) (Substrate durch Komplex IV oxidiert). Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte ± SE. * - P <0,05.

    Abbildung 3
    Abbildung 3. Aktivitäten von Komplex I und komplexe IV in Mitochondrien aus RPTC Exprimieren der aktiven und inaktiven Mutanten von PKC-ε bei 48 Stunden nach Adenovirus-Vektor-Zufuhrstruktur isoliert. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte ± SE. * - P <0,05.

    Abbildung 4
    Abbildung 4. Zeitabhängige Veränderungen in der mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) in RPTC folgende Infektion mit Adenovirus-Vektor, welcher die konstitutiv aktiv (caPKC-ε) und inaktive Mutanten (dnPKC-ε) der PKC-ε. Die Ergebnisse sind als das Verhältnis von Aggregat zu monomeren Formen von JC-1 exprimiert. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte ± SE. * - P <0,05.

    Abbildung 5
    Abbildung 5. Aktivität von F 0 F 1-ATPase in isolierter Mitochondrien (A) und ATP-Gehalt (B)in RPTC Exprimieren der aktiven und inaktiven Mutanten von PKC-ε bei 48 Stunden nach Adenovirus-Vektor-Zufuhrstruktur. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte ± SE. * - P <0,05.

    Abbildung 6
    Abbildung 6. Mitochondrienmorphologie in lebenden RPTC Exprimieren der aktiven und inaktiven Mutanten von PKC-ε bei 48 Stunden nach Adenovirus-Vektor-Zufuhrstruktur. Ein. Nicht-infizierten Kontrollen. B. RPTC Ausdruck caPKC-ε. C. RPTC Ausdruck dnPKC-ε. Repräsentative Bilder von lebenden Zellen untersucht unter einem Fluoreszenzmikroskop. Original Vergrößerung x630.

    Abbildung 7
    Abbildung 7. Zeitabhängige Veränderungen in RPTC oncosis (A) und Apoptose (B) folgende Infektion mit Adenovirus-Vektor, welcher die konstitutiv aktiv (caPKC-ε) oder inaktiven Mutanten (dnPKC-ε) der PKC-ε. Eine Infektion mit Adenovirus-Partikeln kodieren eine leere pShuttle Vektor (MOI = 50) ergab sich 5,2 ± 2,3% oncosis und 5,5 ± 1,0% Apoptose bei 48 h nach der Infektion. Die Ergebnisse sind Durchschnittswerte ± SE. * - P <0,05. C. Repräsentative Dot-Plots zeigen Annexin V und Propidiumiodid-Fluoreszenz in RPTC überexprimierenden caPKC-ε und dnPKC-ε bei 48 h nach adenoviraler Vektor Lieferung.

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    Discussion

    Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht Überexpression einzelner Isoenzyme der PKC in der primären Kultur der renalen proximalen Tubuluszellen. Es gibt mehrere Stärken dieses Ansatzes: 1. Es erlaubt zum Untersuchen Regulationsmechanismen in einer homogenen Population von Zellen (renalen proximalen röhrenförmigen Zellen), die das primäre Ziel für verschiedene Beleidigungen (Ischämie, Hypoxie, oxidativem Stress), Drogen und nephrotoxicants innerhalb der Niere befinden. 2. Mitochondrialen Funktionen in diesem in vitro Modell der RPTC in Primärkultur in den verbesserten Bedingungen angebaut ähneln mitochondrialen Funktionen proximalen Nierentubuli in vivo. 1,2 3. Reaktion von Mitochondrien zu verschiedenen Schadstoffen in diesem in vitro-Modell ist ähnlich zu der Reaktion der proximalen Nierentubuli in vivo. 4. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Transfektion und Lieferung der spezifischen Proteine ​​kodierende Gene einschließlich Proteine ​​in der Signaltransduktion involviert mechasms, die mitochondrialen Funktionen regulieren. Somit ermöglicht dieses Modell zur selektiven Expression konstitutiv aktiven und inaktiven Isozyme von Kinasen und Phosphatasen und ersetzt die Notwendigkeit für pharmakologische Inhibitoren und Aktivatoren, die nicht so selektiv und haben oft toxische Nebenwirkungen. Die Grenzen dieses Modells sind die folgenden: 1. Verwendung von kultivierten RPTC in einem in vitro-Umgebung nicht zur Untersuchung von endokrinen und parakrine Signale, die an der Regulation der mitochondrialen Funktion in den proximalen Nierentubuli in vivo, und 2 wirken kann. dieses Modell nicht für das Studium chronischen Erkrankungen ermöglichen.

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    Disclosures

    Keine Interessenskonflikte erklärt.

    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2R01DK59558 (GN) unterstützt. UAMS Translational Research Institute der National Institutes of Health National Center for Research Resources Gewährung UL1 RR029884 abstützt Teilfinanzierung für die Durchflusszytometrie Core bei UAMS. Wir danken Dr. Peipei Ping (University of California in Los Angeles, Los Angeles, CA) zur Bereitstellung eines aliquoten von Adenovirus trägt codierende cDNA der dominant negative (inaktiv) Mutante von PKC-ε und Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) zum Bereitstellen eines Aliquots Adenovirusvektor Codieren des konstitutiv aktiven Mutanten von PKC-ε. Wir danken auch Drs. Peter Parker und Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) für die Bereitstellung von cDNA konstitutiv aktive PKC-ε.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Laminar flow hood Thermo Electron Corporation FORMA 1104
    2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder WHEATON 989-24607, 357544
    85 and 235 micron nylon mesh Small Parts CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD
    50 ml sterile centrifuge tube BIOLOGIX BCT-P 50BS
    1.5 ml micro tube Sarstedt 72.690.001
    35 x 10 mm sterile culture dishes Corning 430165
    Jouan Centrifuge Jouan Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40
    Adjustable micro-centrifuge SIGMA Model 1 - 15
    Biological Oxygen Monitor YSI Incorporated YSI Model 5300A
    Single Chamber Micro Oxygen System YSI Incorporated 5356S
    Oxygen Probe YSI Incorporated 5331A
    Circulating Bath YSI Incorporated 5310
    KCl and Standard Membrane Kit YSI Incorporated 5775
    Magnetic Stirrer YSI Incorporated 5222
    Flatbed Recorder Kipp Zonen BD 11E
    48-well and 96-well transparent plates Costar 3548, 3679
    Thermomixer R Eppendorf 5355 21919
    Orbital shaker MAXQ 2000 Thermo Scientific SHKA 2000
    Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) Tecan F129005
    Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator NUAIRE NU 4850
    12x75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry Fisher Brand 14-961-20
    Axioskop
    Water immersion objective 63x / 0,90W
    Carl Zeiss 114846
    ACHROPLAN 44 00 67
    DMEM / F12 Cellgro 99 - 830 - PB
    DMEM / F12 Ham Sigma D 2906 - 1L
    Deferoxamine Mesylate Hospira D110
    Collagenase Type I Worthington 4196
    Trypsin inhibitor Sigma T 6522 - 500mg
    5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) Invitrogen T3168
    Mitotracker Red Invitrogen M22425
    ATP Bioluminescence Assay Kit HS II Roche 11 699 709 001
    Annexin V - FITC solution BioVision 1001 - 200
    Flow cytometer BD Biosciences BD FACSCalibur

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    References

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    Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme
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    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).More

    Nowak, G., Bakajsova, D. Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes. J. Vis. Exp. (71), e4301, doi:10.3791/4301 (2013).

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