Summary
Phase-shift nanoemulsions (PSNE) kan fordampes ved hjælp af høj intensitet fokuseret ultralyd til at forbedre lokal opvarmning og forbedre termisk ablation i tumorer. I denne rapport, er fremstillingen af stabile PSNE med en snæver størrelsesfordeling beskrevet. Endvidere er effekten af fordampet PSNE på ultralyd-medieret ablation påvist i væv der efterligner fantomer.
Abstract
Høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU) anvendes klinisk til termisk ablatere tumorer. At øge lokal opvarmning og forbedre termisk ablation i tumorer, er lipid-overtrukne perfluorcarbongasser smådråber blevet udviklet, som kan fordampes ved HIFU. Vaskulaturen i mange tumorer er unormalt utæt på grund af deres hurtige vækst og nanopartikler kan trænge ind i fenestrationer og passivt akkumuleres i tumorer. Således kan styring af størrelsen af smådråberne resultere i bedre akkumulering i tumorer. I denne rapport er fremstillingen af stabile dråber i en faseforskydning nanoemulsion (PSNE) med en snæver størrelsesfordeling beskrevet. PSNE blev syntetiseret ved sonikering af en lipidopløsning i nærværelse af flydende carbonperfluorid. En snæver størrelsesfordeling blev fremstillet ved at ekstrudere de PSNE flere gange under anvendelse af filtre med porestørrelser på 100 eller 200 nm. Størrelsesfordelingen blev målt over en periode på 7 dage ved hjælp af dynamisk lysspredning. Polyacrylamide hydrogeler indeholdende PSNE blev fremstillet til in vitro forsøg. PSNE smådråber i hydrogelerne blev fordampet med ultralyd og de resulterende bobler forbedret lokal opvarmning. Fordampet PSNE muliggør hurtigere opvarmning og reducerer også ultralyd intensitet nødvendig for termisk ablation. Således er PSNE forventes at forbedre termisk ablation i tumorer, potentielt forbedre terapeutiske resultater af HIFU-medierede termisk ablation behandlinger.
Protocol
1. Fremstilling af Phase-shift nanoemulsion (PSNE)
- Opløs 11 mg DPPC og 1,68 mg DSPE-PEG2000 i chloroform
- Afdamp det organiske opløsningsmiddel til dannelse af en tør lipidfilm i et glas rundbundet kolbe
- Dessicate lipidfilmen overnight
- Rehydrere lipidfilmen med 5,5 ml phosphatpufret saltvand (PBS)
- Varme opløsning i et 45 ° C vandbad, indtil lipidfilm opløses, vortexbehandling periodisk
- Overfør lipidopløsning i 7 ml hætteglas
- Sonikeres lipidopløsning i 2 minutter ved 20% amplitude
- Opdel løsning i to hætteglas med 2,5 ml hver (kassere resterende 0,5 ml)
- Tilsæt 2,5 ml PBS til hvert hætteglas
- Placer hvert hætteglas i en 0 ° C isvandbad
- Tilsættes 50 pi DDFP til hvert hætteglas
- Sonikeres hvert hætteglas i isvandbad under anvendelse af følgende indstillinger: 25% amplitude, pulserende tilstand (10 sek om, 50 sek off), 60 sek alt til tiden
- Transfer PSNE løsninger til 20 ml scintillationsglas
- Der tilsættes 5 ml PBS til hvert hætteglas, hvilket resulterer i 10 ml slutvolumen
- Saml ekstruder følgende retninger leveret af producenten
- Skyl hver del med deioniseret vand
- Placer rustfrit stål støtteskive i midten af filteret opbakning
- Placer rustfrit stålnet oven på den rustfrie støtteskive
- Ved hjælp af en pincet, en ekstruder afløb disc membran (blanke side op) placere på rustfrit stålnet
- Brug pincet, ekstruderen filter (blanke side op) placere på afløbet disc membran
- Placer forsigtigt den lille O-ring på filteret og læg thermobarrel og ekstruder top over bagland
- Delvist strammes hver vinge-møtrik først, derefter helt stram vinge-nødder i hånden i en skiftende mode
- Tilslut ekstruderen tilen nitrogengas-linje
- At prime ekstruderen, pipette 10 ml deioniseret vand i toppen prøveporten, CAP åbningen, og spænd udluftningsventilen
- Åbn langsomt nitrogengas linien for at forøge trykket, tvinger prøven gennem membranerne, og indsamle prøven fra udløbsslangen
- Efter brug, adskille i omvendt rækkefølge, skylles ekstruderen dele med deioniseret vand, og kassér membranfilter og membran drain disc
- For 100 nm dråber kun, forudsætning PSNE ved at ekstrudere 10 gange gennem 200 nm filter
- Extrude PSNE 16 gange gennem 100 nm eller 200 nm filter for at opnå snæver størrelsesfordeling
2. Fremstilling af polyacrylamid-hydrogel indeholdende PSNE
- Forbered 24% BSA-opløsning ved at fortynde 1,2 g BSA pulver i 5 ml deioniseret vand
- Forbered 10% APS opløsning af fortyndet 0,1 g APS pulver i 1 ml deioniseret water
- I følgende rækkefølge, blandes 2,1 ml acrylamid-opløsning, 1,2 ml Tris-puffer, 0,1 ml 10% APS, 4,5 ml 24% BSA-opløsning, og 3,6 ml deioniseret vand i plastkammer
- Der opvarmes til 40 ° C og anbringes under vakuum i 1 time
- Tilsættes 480 pi PSNE og blandes grundigt ved forsigtigt at skvulpe plastkammer.
- Der tilsættes 12 gl TEMED og anbringe kammeret i et 12 ° C vandbad i 2 timer
3. Repræsentative resultater
En skematisering af opsætningen for ultralyd forsøg med væv der efterligner hydrogel fantomer er vist i figur 1.. Denne protokol resulterer i lipid-overtrukne perfluorcarbongasser smådråber med en snæver størrelsesfordeling, som er stabile i opløsning i mindst en uge. Størrelsesfordelingen måles med dynamisk lysspredning (90Plus Particle Size Analyzer, Brookhaven Instruments, Holtsville, NY) er vist i figur 2 for PSNE ekstruderes under anvendelse af 100 og 200nm filtre. Den PSNE effektive diameter over tid, målt under anvendelse af dynamisk lysspredning, er angivet i tabel 1, viser, at PSNE er stabile i mindst en uge. B-mode billeder af PSNE før og efter fordampning i en polyacrylamid-hydrogel, er vist i figur 3.. Også, en læsion dannet af 15 sekunder i HIFU-medieret opvarmning i en polyacrylamid-hydrogel indeholdende albumin og PSNE er vist i fig. 4. Den asymmetriske form af læsionen er et resultat af prefocal varme, der opstår på grund af tilstedeværelsen af boblen skyen i ultralyd sti. Det er vigtigt at bemærke, at prefocal opvarmning og læsionsdannelse på grund af spredning fra bobler kan minimeres ved at reducere den transmitterede akustiske effekt.
Figur 1. Skematisk diagram af forsøgsopstillingen for ultralyd forsøg med væv-MIMIcking hydrogeler.
Figur 2. Størrelsesfordelingen af PSNE ekstruderet gennem 100 nm eller 200 nm filtre, målt under anvendelse af dynamisk lysspredning. Enhederne i ordinaten akser er baseret på intensiteten af spredt lys fra partikler af en vis størrelse i forhold til det samlede spredte lysintensitet fra prøven.
Fig. 3. B-mode billeder (a) før og (b) efter PSNE fordampning i en polyacrylamidhydrogel. Pilen angiver fokusregionen, hvor en boble sky blev dannet ved PSNE fordampning.
Figur 4. Billeder af polyacrylamid hydrogel indeholdende albumin og PSNE (a) før og (b) efter fordampning og lydbehandling med HIFU, hvilket viser læsionsdannelse som følge af ultralyd-induceret opvarmning. Den ultralyd center frekvens var 3,3 MHz. Ultralydsignalet bestod af en indledende 30-cyklus, 6,4 W impuls til at fordampe PSNE, umiddelbart efterfulgt af 15 sekunder for kontinuerlig ultralyd på 0,77 W.
| Dage efter ekstrudering | Ekstruderet med 200 nm filter | Ekstruderet med 100 nm filter | ||
| Mean Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | Mean Dia. (Nm) | Std. Dev. (Nm) | |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | <td> 177,72,5 | 124,8 | 3,1 | |
Tabel 1. Middeldiameter og standardafvigelse af PSNE på en og syv dage efter ekstrudering med 100 nm og 200 nm filtre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Høj intensitet fokuseret ultralyd (HIFU) anvendes klinisk til termisk ablatere tumorer. 1 For at forbedre lokal opvarmning og forbedre termisk ablation i tumorer, har lipid-belagt perfluorcarbongasser dråber blevet udviklet, som kan fordampes ved HIFU. Vaskulaturen i mange tumorer er unormalt utæt på grund af deres hurtige vækst. 2 således nanopartikler er i stand til at trænge ind i fenestrationer og passivt akkumuleres i tumorer, en proces kendt som den forøgede permeabilitet og retention (EPR) virkning. 3. Det er vist, at nanopartikler mellem 70 og 200 nm akkumulerer mest effektivt i tumorer. 4 Proceduren beskrevet i denne rapport frembringer en stabil faseforskydning nanoemulsion (PSNE) af lipid-overtrukne perfluorcarbongasser dråber med en snæver størrelsesfordeling. I fortiden, har de fleste undersøgelser, de anvendte polydisperse størrelse distributioner af PSNE, men nylige undersøgelser fokuseret på at producere PSNE med smalle størrelse distributioner.5, 6 ekstruderingsfremgangsmåde er beskrevet i denne protokol gør det muligt at regulere størrelsen for at øge andelen af dråber givet systemisk der vil akkumuleres i tumorer.
Den dodecafluorpentan kerne af nanodroplets har en kogetemperatur på 29 ° C. 7. Det er således vigtigt at opretholde en lav temperatur under hvert trin af PSNE præparat. Lydbehandling forøger opløsningens temperatur, men under anvendelse af en pulseret sonication sekvens og anbringe prøven i et is-vandbad under lydbehandling kan reducere fordampning. Når de lipid-overtrukne smådråber har dannet, at kogetemperaturen stiger over 60 ° C på grund af overfladespænding. 8 PSNE fordampning er temperatur-og trykafhængig, og også afhænger af størrelsen og sammensætningen af de flydende perfluorcarbon-dråber. 9 F.eks det konstateredes, at peak rarefactional tryk over 3,8 MPa var nødvendig for at fordampe 200nm DDFP dråber ved 37 ° C. 10 Coating dråberne med lipider konjugeret med poly (ethylenglycol) (PEG) inhiberer fusion, hvilket øger størrelsen stabilitet PSNE over flere dage. Desuden er det blevet dokumenteret, at PEG kan forøge cirkulationstiden af lipidbaserede vesikler, 11-13, hvilket kan øge fraktionen af systemisk indgivet PSNE, der akkumuleres i lokaliserede ondartetheder. 14, 15
Carbonperfluoriden dråber kan suspenderes i en vævs-efterlignende polyacrylamidhydrogel fantom indeholdende albumin for in vitro termisk ablation undersøgelser. 16. De PSNE-loaded hydrogeler er nyttige ved vurdering fordampningen lofter og studere læsionsdannelse fra boble-forstærket HIFU-medieret opvarmning . Hydrogelerne absorbere og konvertere akustiske energi til varme, og når temperaturen i hydrogelen over 58 ° C, albumin i hydrogelen denaturerer og bliver uigennemsigtig. 17, da hydrogeler er optisk transparente, er det muligt at observere proteindenaturering i realtid. Fordampning af PSNE i hydrogelerne skaber bobler, som anvendes til at forøge effektiviteten af ultralyd-medieret opvarmning. Ved hjælp af en fokuseret transducer, PSNE fordampning og boble-forstærket opvarmning kan lokaliseres, så man undgår uønsket opvarmning i at intervenere biologiske medier (dvs. væv). I de fantomer kan den fordampede boble cloud påvirker ultralydsstrålen formering og forårsage prefocal opvarmning, forudsat den akustiske effekt overstiger en tærskel. Under denne tærskel er den spredte effekt er for lav til at ablatere væv i prefocal region, og følgelig er det ablaterede volumen begrænset til placeringen af boblen sky. Brugen af PSNE at styrke lokal opvarmning in vivo muligvis kan forbedre resultaterne af HIFU tumor ablation behandlinger. Som et første skridt har en ekstrudering-baseret protokol er udviklet til at styrestørrelsen af snævert fordelt PSNE. Ved hjælp PSNE dispergeret i optisk transparente væv der efterligner hydrogeler, er det muligt at undersøge virkningen af fordampet PSNE på ultralyd-medieret opvarmning og termisk ablation. Levering af terapeutiske midler og nanopartikler til tumor kerne in vivo fortsat en udfordring på grund af øgede interstitielle pres, der findes der. Det er sandsynligt, PSNE fortrinsvis ville akkumulere i tumoren periferi og kan ikke let gennemtrænge tumoren kerne. Undersøgelser hos hydrogeler har vist, at bobler kan omdirigere akustisk energi mod transduceren resulterer i ablaterede mængder i prefocal region. Dette fænomen opstår, når den transmitterede akustiske effekt overstiger en bestemt tærskelværdi. Således er det muligt at lokalisere boble-forstærket tumor ablation til tumoren periferi ved hjælp af en effektindstilling samt ablate den indre kerne ved at reflektere akustiske energi fra bobler skabt i distal margin ved en højere power indstilling. Desuden ville præcis ablation af tumor periferi, der undgår at beskadige det omkringliggende raske væv stadig udgøre en betydelig gennembrud og kan potentielt give tidligere ikke-resektable tumorer skal fjernes kirurgisk. Selv om der er forskelle mellem in vivo betingelser og væv der efterligner hydrogeler, at fantomer kan anvendes til at forstå de fysiske mekanismer af ultralyd-øget opvarmning med PSNE for at optimere de ultralyd parametre for termisk ablation. Disse er vigtige skridt for oversættelse brugen af PSNE til forbedring af ultralyd-medieret ablation fra laboratoriet til klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en BU / CIMIT Applied Healthcare Engineering Predoctoral Fellowship, en National Science Foundation udvide deltagelsen Research Initiation Grant i Engineering (Brige), og National Institutes of Health (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
- Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F.
- Baban, D. F., Seymour, L. W.
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).
- Schadlich, A. Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).
- Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. 2010 IEEE Ultrasonics Symposium. , (2010).
- Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics. Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).
- Giesecke, T., Hynynen, K. Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro. Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound. Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).
- Zhang, P. The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]. , (2011).
- Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).
- Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target. Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).
- Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).
- Gabizon, A. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits. Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).
- Zhang, P., Porter, T. An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation. Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).
- Lafon, C. Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry. Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).
