Summary
Фазовый наноэмульсий (PSNE) может быть испаряется использованием высокой интенсивности сфокусированного ультразвука для повышения локализованных отопление и улучшить тепловой абляции опухолей. В этом докладе, подготовка стабильного PSNE с узким распределением по размерам описывается. Кроме того, влияние PSNE испаренного на УЗИ-опосредованной абляции показано в ткани имитирующие фантомы.
Abstract
Высокая интенсивность сфокусированного ультразвука (HIFU) используется в клинике для термической абляции опухолей. Для повышения локализованных отопление и улучшить тепловой абляции при опухолях, липидного покрытые капель перфторуглеродов были разработаны, которые могут быть испаряется HIFU. Сосудистой во многих опухолях аномально вытекающей из-за их быстрого роста, и наночастицы способны проникать fenestrations и пассивно накапливаться в опухолях. Таким образом, контролируя размер капель может привести к лучшему накопления в опухоли. В этом докладе, подготовка стабильного капель в фазовом наноэмульсии (PSNE) с узким распределением по размерам описывается. PSNE были синтезированы ультразвуком липидной раствора в присутствии жидких перфторуглеродов. Узким распределением по размерам был получен путем экструзии PSNE несколько раз, используя фильтры с порами размером 100 или 200 нм. Распределение по размерам была измерена в 7-дневный срок с использованием динамического рассеяния света. Polyacrylamide гидрогелей, содержащих PSNE были подготовлены в пробирке эксперименты. PSNE капель в гидрогели были испарения с ультразвуком и в результате пузырей усиливается локальному нагреву. Испаряясь PSNE обеспечивает более быстрый нагрев, а также снижает интенсивность ультразвука необходимых для тепловой абляции. Таким образом, PSNE как ожидается, повысит тепловой абляции при опухолях, потенциально улучшения терапевтических результатов HIFU-опосредованной тепловые процедуры абляции.
Protocol
1. Подготовка этапа смены наноэмульсии (PSNE)
- Растворите 11 мг ДПФХ и 1,68 мг DSPE-PEG2000 в хлороформе
- Выпаривают органическом растворителе с образованием сухой пленки липидов в стеклянную круглодонную колбу
- Осушать липидной пленки ночь
- Увлажняет липидной пленки с 5,5 мл фосфатно-солевом буфере (PBS)
- Тепло решение в 45 ° С водяной бане до растворения липидной пленки, периодически встряхиванием
- Передача липидного раствора в 7 мл флаконе
- Разрушать ультразвуком липидной решение в течение 2 мин при 20% амплитуды
- Разделить решение в двух флаконов по 2,5 мл каждый (отбросить оставшиеся 0,5 мл)
- Добавить 2,5 мл PBS в каждом флаконе
- Место каждого флакона в 0 ° C ледяной бане
- Добавить 50 мкл DDFP в каждом флаконе
- Разрушать ультразвуком каждого флакона в ледяной бане, используя следующие параметры: 25% амплитуды, импульсный режим (10 сек на, 50 сек пауза), 60 сек Всего на время
- Transfer PSNE решения по 20 мл ампулы сцинтилляционных
- Добавьте 5 мл PBS в каждую пробирку, в результате чего в 10 мл конечного объема
- Соберите экструдеров следующих направлениях предоставленной производителем
- Промыть каждую часть деионизированной водой
- Положите диск из нержавеющей стали поддержку в центре фильтра базу поддержки
- Поместите сетку из нержавеющей стали на вершине диск из нержавеющей стали
- С помощью пинцета, поместить диск экструдер сливной мембраны (блестящей стороной вверх) на сетку из нержавеющей стали
- С помощью пинцета, поместить в экструдер фильтр (блестящей стороной вверх) на мембране диска сливной
- Аккуратно положите небольшое кольцо на фильтр и поместите thermobarrel и экструдер верх над базу поддержки
- Частично завинтите каждом крыле гайки, а затем полностью затяните крыла гайки от руки в переменном моды
- Подключите экструдералинии газообразного азота
- Премьер-экструдер, пипетки 10 мл деионизированной воды в верхнем порту образца, ограничить открытие и затяните вентиляционный клапан
- Медленно откройте линии газообразного азота, чтобы увеличить давление, заставляя образца через мембраны, а также сбор образцов от розетки трубы
- После использования, разбирать в обратном порядке, промыть экструдер частей деионизированной водой, и отказаться от мембранный фильтр и диск мембраны сливной
- За 100 нм капли только предварительное условие PSNE путем выдавливания в 10 раз до 200 нм фильтра
- Extrude PSNE 16 раз до 100 нм и 200 нм фильтра для получения узким распределением по размерам
2. Подготовка Полиакриламид гидрогель, содержащий PSNE
- Подготовить 24% BSA решение путем разбавления 1,2 г порошка BSA в 5 мл деионизированной воды
- Подготовить 10% APS решение разбавленной 0,1 г порошка APS в 1 мл деионизированной водоснаг
- В следующем порядке, смешать 2,1 мл раствора акриламида, 1,2 мл трис-буфера, 0,1 мл 10% APS, 4,5 мл 24% BSA решение, и 3,6 мл воды в пластиковой камере
- Нагреть до 40 ° C и место под вакуумом в течение 1 часа
- Добавить 480 мкл PSNE и тщательно перемешать, осторожно вращая пластиковой камере.
- Добавить 12 мкл TEMED и поместить камеру в 12 ° С водяной бане в течение 2 часов
3. Представитель Результаты
Схема установки для ультразвуковых экспериментов с тканями имитирующие фантомы гидрогель показано на рисунке 1. Этот протокол приводит к липидной покрытием перфторуглеродов капель с узким распределением по размерам, которые являются стабильными в растворе, по крайней мере неделю. Размер дистрибутива измеряется динамического рассеяния света (90Plus анализатор размера частиц, Brookhaven Instruments, Holtsville, Нью-Йорк) показана на рисунке 2 для PSNE экструдированного использовании 100 и 200нм фильтра. PSNE эффективного диаметра с течением времени, измеряется с помощью динамического рассеяния света, приведены в таблице 1, демонстрируют, что PSNE стабильны в течение по крайней мере недели. B-режим изображения PSNE до и после испарения в полиакриламидном гидрогеле показано на рисунке 3. Кроме того, поражение образуется на 15 секунд HIFU-опосредованной отопления в полиакриламидном гидрогель, содержащий альбумин и PSNE показано на рисунке 4. Асимметричная форма поражения является результатом prefocal отопление, которое происходит из-за наличия пузырей облако в ультразвуковом пути. Важно отметить, что prefocal отопления и поражения формирование в связи с разбросом от пузыри могут быть сведены к минимуму за счет сокращения передаются акустической мощности.
Рисунок 1. Принципиальная схема экспериментальной установки для ультразвуковых экспериментов с тканями МИМIcking гидрогелей.
Рисунок 2. Распределение по размерам PSNE выдавливается через 100 нм и 200 нм фильтра, измеряется с помощью динамического рассеяния света. Единиц по оси ординат оси в зависимости от интенсивности рассеянного света от частиц определенного размера по отношению к общей интенсивности рассеянного света от образца.
Рисунок 3. B-режим изображения (а) до и (б) после PSNE испарения в полиакриламидном гидрогеля. Стрелка указывает фокальной области, где пузырь облако было сформировано PSNE испарения.
Рисунок 4. Изображения polyacrиламида гидрогель, содержащий альбумин и PSNE (а) до и (б) после испарения и ультразвуком с HIFU, демонстрируя поражение формирование в результате ультразвукового вызванных отопления. Частота ультразвуковых центра составила 3,3 МГц. Ультразвуковой сигнал состоял из начальных 30-цикле, 6,4 Вт импульс для испарения PSNE, сразу после 15 секунд непрерывной ультразвуковой на 0,77 В.
| Через несколько дней после экструзии | Экструдированный с фильтром 200 нм | Экструдированный с фильтром 100 нм | ||
| Среднее Dia. (Нм) | Std. Dev. (Нм) | Среднее Dia. (Нм) | Std. Dev. (Нм) | |
| 1 | 182,9 | 4,9 | 118,0 | 0,9 |
| 7 | <TD> 177,72,5 | 124,8 | 3,1 | |
Таблица 1. Средний диаметр и стандартное отклонение PSNE на один и семь дней после экструзии при 100 нм и 200 нм фильтра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Высокая интенсивность сфокусированного ультразвука (HIFU) используется в клинике для термической абляции опухолей. 1 Для повышения локализованных отопление и улучшить тепловой абляции при опухолях, липидного покрытые капель перфторуглеродов были разработаны, которые могут быть испаряется HIFU. Сосудистой во многих опухолях аномально вытекающей из-за их быстрого роста. 2 Таким образом, наночастицы способны проникать fenestrations и пассивно накапливаются в опухоли, процесс, известный как повышенной проницаемости и удержания (EPR) эффект. 3 было показано, что Наночастицы между 70 и 200 нм накапливаются наиболее эффективно в опухолях. 4 процедуры, описанной в настоящем докладе производит стабильный фазовый наноэмульсии (PSNE) липидного покрытые капель перфторуглеродов с узким распределением по размерам. В прошлом, большинство исследований использовали полидисперсного распределения по размерам PSNE, но последние исследования были сосредоточены на производстве PSNE с узким распределением по размерам.5, 6 экструзионного метода, описанного в этом протоколе позволяет контролировать размер для того, чтобы увеличить процент капель вводят системно, что будет накапливаться в опухолях.
Додекафторпентан ядро нанокапелек имеет температуру кипения 29 ° C. 7 Таким образом, он является важным для поддержания низкой температуры на каждом этапе PSNE подготовки. Озвучивание повышается температура раствора, но с использованием импульсной последовательности обработки ультразвуком и размещении образца в ледяной бане в течение ультразвуком может уменьшить испарение. После липидного покрытые капель формируются, температура кипения повышается выше 60 ° C за счет поверхностного натяжения. 8 PSNE испарения от температуры и давления-зависимых и также зависит от размера и состава жидких капель перфторуглеродов. 9 Например, было установлено, что пик разрежения давления выше 3,8 МПа были необходимы, чтобы испарить 200нм DDFP капель при 37 ° C. 10 Покрытия капель с липидами сопряженных с поли (этиленгликоль) (ПЭГ) ингибирует синтез, увеличивая таким образом размер стабильности PSNE в течение нескольких дней. Кроме того, было документально подтверждено, что PEG может увеличить время циркуляции на основе липидов везикул, 11-13, которые могут увеличить долю системно вводили PSNE, которые накапливаются в локализованных злокачественных новообразований. 14, 15
Перфторуглеродов капель может быть приостановлено в ткани имитирующие полиакриламидного гидрогеля фантомные содержащего альбумин в пробирке термических исследований абляция 16. PSNE загруженных гидрогелей полезны для оценки испарения пороги, а также изучение поражения от формирования пузырей повышенной HIFU-опосредованной отопления . Гидрогелей поглощать и преобразовывать акустической энергии в тепло, и когда температура в гидрогель превышает 58 ° C, альбумина в гидрогель денатурирует и становится непрозрачным17. Потому что гидрогели оптически прозрачный, то можно заметить, денатурации белков в реальном времени. Испарение PSNE в гидрогели создает пузыри, которые используются для повышения эффективности ультразвуковых-опосредованной отопления. Использование сосредоточены преобразователя, PSNE испарения и пузырей повышенной отопления может быть локализована, что позволяет избежать нежелательного нагрева при вмешательстве биологических средах (например, ткани). В фантомы, испаренный Облако пузырь может повлиять на распространение ультразвукового луча и привести prefocal отопления, при условии, акустическая мощность превышает пороговое значение. Ниже этого порога, разбросанные мощности слишком низкая, чтобы удалять ткани в области prefocal, следовательно, удаленной объем ограничен расположения пузыря облака. Использование PSNE для повышения локальный нагрев в естественных условиях потенциально может улучшить результаты лечения опухолей HIFU аблации. В качестве первого шага, экструзии на основе протокола была разработана для управленияРазмер узко распределенных PSNE. Использование PSNE диспергированные в оптически прозрачной ткани имитирующие гидрогели, можно исследовать влияние PSNE испаренного на УЗИ-опосредованной отопления и тепловой абляции. Доставка терапевтических агентов и наночастиц в опухоли ядро в естественных условиях остается проблемой из-за увеличения интерстициального давления, которые находятся там. Вполне вероятно, что PSNE бы преимущественно накапливаются в опухоли периферии и, возможно, не легко проникают в опухоль ядра. Исследования, проведенные в гидрогели показали, что пузыри могут перенаправить звуковой энергии к датчик в результате абляции объемы в prefocal региона. Это явление происходит, когда передается акустическая мощность превышает определенный порог. Таким образом, можно локализовать пузырь повышенной абляции опухоли к периферии опухоли с использованием одного параметра питания, а также удалять внутреннее ядро, отражая акустической энергии от пузырьков создан в дистальном крае на более высоком ПауГ настройки. Кроме того, точное удаление опухоли периферии, что позволяет избежать повреждения окружающих здоровых тканей будет по-прежнему представляют собой значительный прорыв и потенциально могли позволить ранее не резектабельными опухоли должны быть удалены хирургическим путем. Хотя существуют различия между в естественных условиях и ткани имитирующие гидрогели, фантомы полезны для понимания физических механизмов ультразвукового повышенной отопления с PSNE с целью оптимизации параметров ультразвукового для тепловой абляции. Эти важные шаги для перевода использовании PSNE для повышения ультразвуковой абляции-опосредованного из лаборатории в клинику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана BU / CIMIT прикладных инженерных Здоровье Predoctoral стипендий, Национальный научный фонд расширения участия исследований Посвящение Грант Engineering (мостом) и Национального института здоровья (R21EB0094930).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 850355P | 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
| DSPE-PEG2000 | Avanti Lipids, Alabaster, AL, USA | 880120P | 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosph–thanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| DDFP | Fluoromed, Round Rock, TX, USA | CAS: 138495-42-8 | Dodecafluoropentane (C5F12) |
| PBS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P2194 | Phosphate-buffered saline |
| Chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 372978 | Chloroform |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9926 | 40% 19:1 acrylamide/bis-acrylamide |
| Tris buffer | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T2694 | 1M, pH 8, trizma hydrochloride and trizma base |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3059 | Bovine serum albumin |
| APS | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A3678 | Ammonium persulfate solution |
| TEMED | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 87689 | N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine |
| Equipment | |||
| Sonicator (3 mm tip) | Sonics Materials, Inc., Newtown, CT, USA | Vibra-Cell | |
| Water bath | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Neslab EX-7 | |
| Extruder | Northern Lipids, Burnaby, BC, Canada | LIPEX | |
| Extruder Filters | Whatman, Piscataway, NJ, USA | Nuclepore #110605 and #110606 | |
| Extruder Drain Disc | Sterlitech Corporation, Kent, WA, USA | #PETEDD25100 | |
| Plastic chamber | U.S. Plastic Corporation, Lima, OH, USA | #55288, 1 3/16"x1 3/16"x2 7/16" | |
References
- Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F. MRI-guided noninvasive ultrasound surgery. Med. Phys. 20, 107-115 (1993).
- Baban, D. F., Seymour, L. W. Control of tumour vascular permeability. Adv. Drug Deliv. Rev. 34, 109-119 (1998).
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).
- Schadlich, A. Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).
- Williams, R. Convertible perfluorocarbon droplets for cancer detection and therapy. 2010 IEEE Ultrasonics Symposium. , (2010).
- Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics. Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).
- Giesecke, T., Hynynen, K. Ultrasound-mediated cavitation thresholds of liquid perfluorocarbon droplets in vitro. Ultrasound Med. Biol. 29, 1359-1365 (2003).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and Acoustic Studies of a New Phase-Shift Agent for Diagnostic and Therapeutic Ultrasound. Langmuir. 27, 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound Med. Biol. 37, 1518-1530 (2011).
- Zhang, P. The Application of Phase-Shift Nanoemulsion in High Intensity Focused Ultrasound: An In Vitro Study [Doctoral Dissertation]. , (2011).
- Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).
- Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target. Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).
- Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).
- Gabizon, A. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54, 987-992 (1994).
- Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits. Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).
- Zhang, P., Porter, T. An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation. Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).
- Lafon, C. Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry. Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).
