Summary
אנו מתארים טכניקת extracellularly להקליט ולעורר מעצבים, שרירים, ונוירונים בודדים מזוהים
Abstract
Multifunctionality, היכולת של מבנה היקפי אחד ליצירת התנהגויות מרובות, ברורות 1, מאפשר לבעלי חיים במהירות להתאים את התנהגותם לשינוי הסביבה. הרכיכה הימית Aplysia californica מספק מערכת צייתנית לחקר multifunctionality. במהלך האכלה, Aplysia מייצר סוגים שונים של כמה התנהגויות באמצעות אותו מנגנון ההאכלה, מסת buccal. הגרעינים ששולטות התנהגויות אלו מכילים מספר גדולים, נוירונים שזוהו שיהיו נגישים למחקר אלקטרו. הפעילות של נוירונים אלה שתוארה בתוכניות מוטוריות שניתן לחלק לשני סוגים, תוכניות ingestive וegestive, בהתבסס על העיתוי של פעילות עצבית שסוגר יחסי גספר מזון לפעילות העצבית שמתמשך וחזר בו או גספר 2. עם זאת, בגרעינים מבודדים, את תנועות השרירים כי תפקנה התנהגויות אלו נעדרות, מה שהופכים אותוקשה יותר להיות בטוח אם את התוכניות המוטוריות נצפו הן הקורלציה של התנהגויות אמיתיות. בהקלטות vivo, עצבים ושרירים הושגו מקביל להאכלת תוכניות 2,3,4, אבל זה מאוד קשה ישירות להקליט מנוירונים בודדים 5. בנוסף, in vivo, תוכניות ingestive ניתן חולקו לעקיצות ו1,2 סנוניות, הבחנה שהיא קשה לעשות בעבר תאר ביותר בהכנות מבחנה.
ההכנה ההמונית buccal המושעה (איור 1) מגשרת על הפער בין גרעינים מבודדים וחיות שלמות. בהכנה זו, התנהגויות ingestive - כולל הוא נושך ובליעה - והתנהגויות egestive (דחייה) יכולים להיות שהושרו, באותו הזמן, כפי שניתן נרשמו נוירונים בודדים ומהמגורה באמצעות אלקטרודות תאיות 6. תנועות ההאכלה קשורים בהתנהגויות שונות אלה יכולים להיות recorטוליפ, לכימות, וקשור ישירות לתוכניות המוטוריות. את התוכניות המוטוריות בהכנת מסת buccal המושעה להיראות יותר דומה לאלו שנצפו בחי מאשר הם תוכניות מוטוריות שהושרו בגרעינים מבודדים. לפיכך, התוכניות המוטוריות בהכנה זו יכולות להיות קשורה באופן ישיר יותר להתנהגות בvivo; באותו הזמן, נוירונים בודדים הם נגישים יותר להקלטה וגירוי מאשר בבעלי חיים שלמים. בנוסף, כשלב ביניים בין גרעינים מבודדים וחיות שלמות, ממצאים ממסת buccal המושעה יכול לסייע בפרשנות של נתונים המתקבלים בהגדרות מופחתות גם יותר ושלמות יותר. ההכנה ההמונית buccal המושעה היא כלי שימושי לאפיון הבקרה העצבית של multifunctionality בAplysia.
Protocol
1. הכנה של פתרונות
- כדי להכין תמיסת מגנזיום כלוריד שהוא איזוטוני למי הים שבם מחזיקים בעלי החיים (~ 1000 millosmolar), לסמן את כד גדול ברמת עוצמת הקול הרצוי. ממלא את הכד במים מזוקקים לכ 80% מרמה זו, ולשקול את הכמות המתאימה של hexahydrate מגנזיום כלוריד כדי ליצור פתרון 333 מ"מ בנפח הסופי. הוסף מגנזיום כלוריד לקנקן, לסגור את המכסה ולנער במרץ עד מגנזיום כלוריד מומס באופן מלא, ולאחר מכן להוסיף מים מזוקקים עד הנפח הסופי הוא הגיע.
- כדי להכין תמיסת מלח Aplysia, שוב לסמן כד גדול ברמה של הנפח הרצוי, ולמלא במים מזוקקים לכ 80% מרמה זו. הנח את הקנקן על צלחת ומערבבים, להציב שורה ומערבבים בקנקן, ולהפוך על הצלחת והמערבבים.
- אחד אחד, לשקול החוצה ולהוסיף לקנקן את הכמויות המתאימות של החומרים הבאים כדי ליצור קון אלהcentrations בנפח הסופי: 460 מ"מ כלוריד הנתרן, אשלגן כלורי 10 מ"מימ, hexahydrate מגנזיום כלוריד mM 22, heptahydrate מגנזיום סולפט mM 33, dihydrate סידן כלוריד 10 מ"מימ, גלוקוז 10 מ"מימ, 10 מ"מ. מגבים
- ברגע המומסים מתמוססים לגמרי, השתמש במד למדידת רמת חומציות-pH של התמיסה. לאט להוסיף הידרוקסיד 1 ז נתרן כדי להעלות את החומציות לערך סופי של 7.5. אם אתה מוסיף נתרן הידרוקסידי יותר מדי בטעות, ניתן להוסיף חומצה הידרוכלורית ז 1 להורדת החומציות.
- הוסף מים מזוקקים עד הנפח הסופי הוא הגיע.
- כדי להאט את התפתחות חיידקים, פתרוני חנות במקרר עד לצורך ניסוי. שימו לב שהטמפרטורה יכולה להשפיע על תוכניות מוטוריות Aplysia. אנחנו לא לפקח בקפידה טמפרטורה, אך לאחר השלמת ההתקנה, הכנות הן בדרך כלל טמפרטורת חדר סמוכה.
2. הכנת תבשיל הקלטה
- במהלך הניסוי, מסת buccal תושעה בפתרון בסיבוב 100 מ"מ (קוטר) x 50 מ"מ (גובה) כלי פיירקס. מנה זו צריכה להיות חדר קדמי למסת buccal, אמצע משטח צר, גבוה שבו גרעיני הלחי מוצמדים Sylgard, ותא נפרד, מוגבה לאחור בי גנגליון המוח מבודד. חריץ בSylgard צריך לחבר את פלטפורמת גרעיני buccal לתא גנגליון המוחין. ראה איור 1, המתייחס לממדים המרכזיים שצוינו בעת בניית המנה.
- כדי ליצור את המאכל הזה, יתחיל בסיבוב מנה 100 x 50 מ"מ פיירקס. הכן Sylgard ביצוע ההוראות שסופקו עם המוצר. בניית המנה תדרוש כמה שופכת של Sylgard, בין שSylgard יש לאפשר להגדרה.
- המזיגה הראשונה היא ליצור רמה הגבוהה ביותר של Sylgard בצלחת, בקיר שבין תאי buccal והמוחין (ראה איור 1). לחסום את חלק זה של המנה מהמקטעים האחרים. פלסטלינה יכולה לשמש לבנייהקירות לחסימת חלקים. לקיר שטוח, חתיכת הקרטון יכול לשמש, עם גיבוי פלסטלינה. לקיר מעוגל (שמקטין את הגודל של התא המכיל את מרכז העצבים במוח), השתמש בפלסטלינה בלבד כבסיס לקיר. מעייל כל הקירות בניילון נצמד שבו הם יתקשרו Sylgard להסרה בקלות.
- ברגע שהמקום לקיר שבין תאי buccal והמוחיים כבר נחסם כמתואר ב2.3, הבטחת חותמות הדוקות בקצוות כדי למזער את הדליפה, לשפוך Sylgard לתוך החלל הזה כמעט עד לקצה העליון של המנה. בואו סט Sylgard בן לילה, ולוודא כי הוא מוגדר באופן מלא לפני שימשיך. מניח את הצלחת במקום חם שיכול להביא את ההגדרה מהירה יותר.
- בשלב בא, פלטפורמת גרעיני buccal ותא גנגליון מוח צריכה להיות שפך (שוב, ראה איור 1, המציג את מיקומי הגרעינים אלה בצלחת הושלמה). הסר את קירות חסימה הקודמים, וליצור קיר חדש דיעמדה 0.5 סנטימטרים מקיר Sylgard השטוח של החלק האמצעי כדי לחסום את פלטפורמת גרעיני buccal. אין חומות הן הכרחיות כדי ליצור את החדר האחורי שיחזיק את מרכז העצבים במוח. יוצק Sylgard בשני החלקים עד לגובה של כ 3 מ"מ מתחת לרמה העליונה. תא המוח צריך להיות רק מעט נמוך יותר מאשר פלטפורמת גרעיני buccal. שוב, בואו Sylgard להגדיר בן לילה.
- לבסוף, יוצק את החדר הקדמי (כלומר, החדר שבו יושעה המוני buccal). אין חומות הן הכרחיות. יוצק לגובה המתאים כמפורט באיור 1.
- השלב האחרון הוא סימן חריץ חיבור פלטפורמת הגרעינים buccal והתא במוח. עומק החריץ צריך להיות זהה לרמה של פלטפורמת גרעיני buccal. להב סכין מנתחים יכול לשמש כדי לחתוך את החריץ. איור 1 מדגים את הצלחת הושלמה.
3. הכנת האלקטרודה
- משוך דואר תאיlectrodes מזכוכית נימים חד קנים באמצעות Flaming-בראון micropipette חולץ. קטרים הפנימיים של אלקטרודות צריכים להיות בערך 40 מיקרומטר והתנגדויותיהם צריכות להיות כ -0.1 MΩ. עם נימת FT345B בחולץ, חולץ הגדרות התכנית הטיפוסית שלנו הן חום 480, משוך 50, 13 Vel, ושעה 20, אך שימו לב שההגדרות תהיינה שונות לחוטים שונים. תכנית זו יוצרת את האלקטרודות במשיכה אחת עם שום שלב אש ליטוש. לפני תחילת ניסוי, מילוי האלקטרודות התאית עם Aplysia מלוח.
- צור אלקטרודות וו לעצבים ושרירי הקלטת 2 בעקבות פרוטוקול דומה לזה שתואר על ידי Cullins וChiel 4, פרט לכך שאלקטרודות בודדות לא צריכות להיות כרוכות זה בזה. את הצעדים ליצירת אלקטרודות אלה פעלו ב3.3-3.13.
- לחתוך חתיכת חוט מצופה אמייל, קוטר 0.001 אינץ' נירוסטה באורך של כ 60 סנטימטרים. צרף כדור הפלסטלינהלכל קצה של החוט, להחזיק את החוט באוויר בנקודת האמצע שלה, ולסובב את שני כדורים של חימר חבוק לעטוף את החוטים זה סביב זה (זה מפחית ארעי capacitative).
- החזק את שני קצותיו של הכבל יחד על ידי הצטרפות שני הכדורים של חימר לכדור אחד, וקלטת הקצה השני של החוט להשעות את החוט.
- מעייל כל אורכו של חוט בדבק סיליקון משק בית על ידי נחת גוש של דבק על האגודל שלך, נוגע באגודל ואצבע המורה על החוט, ומפעיל אותם על החוט. בואו הדבק יתייבש בין הלילה.
- לאחר שמתייבש הדבק, הנח את החוט על משטח שטוח תחת מיקרוסקופ לנתח משקף. חותך את קצה החוט שהיה בעבר באמצע, וכתוצאה מכך שני חוטים נפרדים מעווים יחד. זה האלקטרודה הפרש.
- השתמש קלטת להחזיק אחד הקצוות של האלקטרודה במקום. שימוש במלקחיים לפשוט את הדבק ואמייל, להכין שני החוטים בקצה אחד יש כ 2 סנטימטר oו חוט חופשי עם כ 1 סנטימטר של החוט הופשט מאמייל. הלחמת סיכת זהב מחבר לכל אחד מהחוטים, וקלטת מעבדת מקום סביב הסיכות ללהפריד ביניהם.
- בקצה השני של האלקטרודה, להכין את החוטים שיש על 3 מ"מ של חוט חופשי. הסרת האמייל מכ 1 את המ"מ האחרון של חוט אחד, וכופף את החוט הזה חזרה ואת הדרך. זה חוט ההפניה. זה קריטי, כי שני החוטים אין לי תיל חשוף נוגע זה בזה.
- הסרת האמייל מהחוט השני את כל הדרך לדבק סיליקון. טוויסט החוט הזה לקרס וחותך אותו לאורך של כ 1 מ"מ. וו זה ייצרף לעצב או השריר. באמצעות וו קצר מספק יציבות גדולה יותר כאשר העצב הוא להיות מחובר לאלקטרודה.
- השתמש מודד כדי לוודא שהאלקטרודה בנויה כהלכה ושלמה. מחבר זהב אחד צריך קריאת התנגדות של בערך 200-500 אוהם ביחס לקצה חוט אחד, וזהב האחר להתחבר או צריך להיות קריאה ביחס לחוט האחר דומה.
- אם אין חיבור שלם על חוט אחד, זה עשוי להיות אפשרי לסוף מחדש להתפשט מחוט ולאחד מחדש הלחמה או שני המחברים המוזהבים ליצירת קשרים אלה. אם שני מחברי הזהב יש לו קשרים עם שני החוטים, האלקטרודה יכולה להיות שני חוטים חשופים ביצירת קשר. ייתכן שניתן יהיה לתקן את הקצה השני כדי לפתור את הבעיה, אחרת, את האלקטרודה אמורה להיות מושלכת.
- חזור על התהליך עבור כאלקטרודות רבות כנחוצות לצורך הניסוי. אלקטרודות Hook ניתן שימוש חוזר מניסוי לניסוי על ידי חיתוך הקצה שמחובר לעצבים ויצירת ווים חדשים, עד החוט הופך קצר מדי אחרי שימושים רבים. בכל פעם שזה נעשה, להשתמש במודד כדי לוודא שהאלקטרודה היא ללא פגע.
- כדי לעקוב אחר האלקטרודות השונה במהלך ניסויים, אלקטרודות מדבקות והכבלים שלהם. שימוש בצבעים שונים של קלטת מעבדה הוא מועיל.
s = "jove_title"> 4. Dissection בעלי החיים והכנה המונית buccal
- בחר בעל חיים בריא של כ 200-300 משקל גרם. כאשר הציג עם אצות, בעלי החיים צריכים לייצר נושכים עם protractions החזק במרווחים קבועים של 3-5 שניות.
- הנח את החיה במגש לנתח ולהרדים על ידי הזרקת תמיסת 50% משקל הגוף מגנזיום כלוריד איזוטוני. הפוך הזריקה הראשונה עם המזרק בכ 15-30 מעלות זווית, קרובה לאמצע ולכיוון הזנב של החיה. לאחר הזרקה, לעסות בעדינות את פני השטח של בעלי החיים להתפשט מגנזיום כלוריד. הפוך זריקות נוספות לפי צורך עם המזרק מצביע לעבר ראשו של בעל החיים.
- לאחר החיה מפסיקה להגיב לגירויי מישוש עדינים, להצמיד את בעל חיים לצד המגש, הגבה למעלה, עם סיכה אחת בזנב וסיכה אחת בכל זרוע קדמית.
- השתמש במלקחיים כדי לצבוט ולהרים את עורו של בעל החיים באמצע הראש, מאחורי rhinophores. MAKE חתך עטרה על ראשו של בעל החיים, ממש מאחורי מוחזקת הנקודה. ואז עושה חתך midsagittal הולך קדימה בבין rhinophores כלפי הפה, חשיפה המונית buccal.
- השתמש במלקחיים כדי למשוך את קפל העור קרוב אליך ממסת buccal, ולחתוך את העצבים ורקמות חיבור שנצמד לדופן הגוף כדי להפריד דש זו של עור באופן מלא ממסת buccal. הקפד שלא סגר שום עצבים או רקמות פנימיות למסת buccal.
- השתמש במלקחיים כדי לתפוס ולהחזיק את הוושט. חתך דרך הוושט האחורי לנקודה המוחזקת. משוך על הוושט להרים את מסת buccal כקיצוצים הבאים עשויים.
- מאחורי מסת buccal, מוח, ריאות, וצורת גרעיני דוושת טבעת, עם גנגליון המוחין המחוברים לגרעיני buccal ידי קישורי ההמוחין-buccal (CBCs). אלה ישאירו גרעיני טבעת המחוברים למסת buccal, ולחתוך את כל העצבים מקרינים מגרעינים אלה לחלקים אחרים שלהגוף.
- לחתוך את רקמות חיבור בכל רחבי ההמוניים buccal, ממשיך להרים את מסת buccal עד שזה הופך להיות פחות מחובר לגוף. ברגע שמסת buccal מצורפת רק בפה, הוושט ומסת buccal צריך להיות מוחזקים ישר למעלה.
- לעשות חתך רק קדמי ללסתות כדי לשחרר את מסת buccal מהגוף סופי. מניח את מסת buccal בתמיסה של 50% פתרון איזוטוני מגנזיום כלוריד ו50% מלוחים Aplysia על מנת לשמור על הרדמה חלקית בזמן אלקטרודות מחוברות.
- מניח את מסת buccal, עם פתרון, בצלחת פטרי עם תחתית Sylgard. הסר את גרעיני פלאורלי ודוושה על ידי חיתוך קשריהם לגנגליון המוחין. השאר את גנגליון המוחין המחוברים לגרעיני buccal ומסת buccal דרך קישורי ההמוחין-buccal (CBCs); לנתק את הקשרים אחרים בין גנגליון המוחין ומסת buccal. חתוך את הוושט ובלוטות רוק לאורכים קצרים כדי שלא גרםאח בדרך.
5. קובץ מצורף אלקטרודה הוק
- להקלטה ולגירוי, אלקטרודות וו יכולות להיות מחוברות למספר עצבים ושרירים שונים, בהתאם לניסוי (איור 2).
- כדי לאפיין את הדפוסים כפי שמודגם בvivo על ידי Cullins וChiel 4, לצרף אלקטרודות לעצבי radular, I2 שרירים, ועצבי buccal 2 ו 3. יחד, קלטות אלה מראות את הפעילות של תאי עצב מוטורי לשריר הפנימי למסת buccal 3,7,8 העיקרי, ולאפשר זיהוי של שלב הארכה מI2 ההקלטה 3, שלב הנסיגה מן עצבי buccal 2 ו 3 קלטות 2 , 5,8, ועיתוי של סגירת גספר המזון מ2 הקלטת עצב radular. צרף האלקטרודה קרס נוספת לסניף של 2 עצב buccal לגירוי דפוס. חיבור של אלקטרודות כדלקמן הליך דומה לזה demonstratאד על ידי Cullins וChiel 4, והוא מתואר בשלבים הבאים.
- עבור כל קובץ מצורף אלקטרודה, למקם את האלקטרודה במניפולטור גס. למניפולטור, קלטת מקל עץ עם קליפ תנין על הקצה ולהשתמש בקליפ להחזיק את הקצה של האלקטרודה. קליפ צריך לצרף לסעיף סיליקון המצופה של האלקטרודה, כ 1 סנטימטר לפני סוף ציפוי סיליקון. השתמש מניפולטור כדי למקם את האלקטרודה הוו ליד המוני buccal.
- עם מסת buccal על צידו והניח על הצד של הצלחת ליציבות, תתחיל עם עצבי radular, המציג את הקובץ המצורף האלקטרודה הקשה ביותר. ישנן שתי אפשרויות לגישה לעצב הזה.
- פרויקטי radular העצב מתחת לגנגליון buccal ועובר מתחת לשריר I2 בשני ענפים. ראשית, לראות אם עצב radular ניתן לגשת ללא חיתוך השרירים. להזיז קלות את הנדן הלבן מצרף גרעיני buccal לשריר I2; דo לא לחתוך את הנדן הזה. אם העצב הוא נגיש, להשתמש במלקחיים עם הנטייה לקצה קרס להרים סניף אחד של העצב.
- אם עצב radular אינו נגיש באופן זה, אפשרות שנייה היא לאתר את העצב מתחת I2 השריר הרזה, ולעשות חתך קטן בI2 לחשוף את העצב. חתך זה צריך לעבור שתי שכבות של שרירים. השתמש במלקחיים המעוקלים לשלוף סניף של עצב radular מתחת לשריר.
- השתמש מניפולטור למקם הקרס הסמוך לעצבים של האלקטרודה. כדי למקם את העצב אל הקרס, כדאי להחזיק את העצבים במלקחיים המעוקלים תוך שימוש בזוג נוסף של מלקחיים כדי ליצור הפרדה בין שני החצאים של העצב המוחזק.
- לאחר העצב הוא מאובטח בוו, השתמש מניפולטור להרים את העצבים ממסת buccal עד שהוא מתוח, אבל לא להתמתח יתר על מידה.
- קח Kimwipe ולסובב בחוזקה פינה אחת כדי ליצור פתיל קטן. השתמש פתיל זה להתייבשסוף האלקטרודה והקטע של עצבים שהוא מכור.
- השתמש קבוצה נוספת של מלקחיים-קצה מעוגל ליישם טיפה של דבק סופר ג'ל המהיר לעצב המעוקל. בגין היישום בנקודת המגע בין חוט ועצב. ודא שהקרס מכוסה כולו בדבק, ושהקצה של חוט ההתייחסות אינו מכוסה בדבק (איור 3).
- השתמש במזרק מצורף צינורות פוליאתילן ליישם פתרון מכלי ההגשה על הדבק, שיניעו את פני השטח של הדבק כדי להגדיר. הקפד לרחוץ ביסודיות את הדבק עם פתרון על מנת להבטיח כי הדבק מגדיר כראוי.
- השתמש מניפולטור כדי לשחרר את המתח על העצב, ולאחר מכן שחרר את האלקטרודה מהסרטון. זה משלים את ההליך של הצמדת האלקטרודה קרס אחד.
- האלקטרודה השריר I2 צריכה להיות מחוברת הבאה. אנו רושמים את פעילות EMG מI2 השריר ולא פעילות ENG מעצבי innervating משום שעצב I2 הוא מאוד SMAll וקשה לגישה במסת buccal ללא פגע. ליד עצב buccal 2, להשתמש במלקחיים המעוקלים להרים להקות אחד או שתיים של שריר I2, ולהשתמש בזוג נוסף של מלקחיים כדי לעזור להפריד ביניהם משאר השרירים. החלק מI2 נפרד צריך להיות דומה בעובי לעצב buccal 2 או 3. היזהר שלא מעל נפרד (שעשוי denervate שריר). צרף האלקטרודה וו עם אותו ההליך המשמש לעצב radular.
- האלקטרודה הבאה לצרף היא שלסניף של עצב buccal 2. ענף זה יכול להיות מגורה חשמלי כדי לגרום מוטוריות תוכניות 9. לפני עצב buccal 2 הולך מתחת I1 השריר בחריץ הרוחבי, עצב trifurcates; סניף הוא הסניף הראשון להתפצל. הסניפים הם די קטנים, ולכן הקובץ המצורף האלקטרודה צריך להיעשות בזהירות. בצע את אותו תהליך כדי לצרף את האלקטרודה.
- עצבי buccal 2 ו 3 ניתן לגשת בקלות. בצע את אותו תהליך, מצרף elecבערך בחץ הדרך בין trodes גנגליון buccal והחריץ לרוחב.
- כדי לסייע בהבחנת נוירונים עם תחזיות חד צדדיות לעומת דו צדדיות, זה גם שימושי לצרף אלקטרודות לעצבי buccal 2 ו 3 בצד השני של מסת buccal, כמו גם 2 סניף עצב buccal, כי נוירונים מסוימים מגיבים באופן שונה לעומת ipsilateral . נגדי BN2-גירוי.
6. מיצוב גנגליון ודליל הנדן
- מסת buccal תועבר לסיבוב צלחת 100 x 50 מ"מ פיירקס תוארה בסעיף 2. ראה איור 1.
- למרוח שכבה דקה של שומן ואקום לחריץ שבין תאי המוח וbuccal, תוך שימוש בטיפ pipet להרים גוש של שומן ואקום ופזר אותו על הרמה הגבוהה. אנחנו גילינו שגריז הוואקום ממזער זליגה טוב יותר וזלין. למלא את התא הקדמי עם מלח Aplysia. בזהירות להעביר את מסת buccal מצלחת פטרי לchamb הקדמיאה של הצלחת הגדולה הזה, כדי לוודא שאף אחד מהאלקטרודות משכו בחוזקה, שיכול לשבור את העצבים.
- אם יש להעביר את התבשיל למשנה מיקרוסקופ לנתח המשקף לדילול הנדן, להיות מאוד זהיר עם אלקטרודות הקרס. קבוצת האלקטרודות בצד אחד של מסת buccal יחד, וגם הקבוצה את האלקטרודות בצד השני של מסת buccal יחד. זהירות להחזיק את האלקטרודות על ידי אחיזת קלטת המעבדה שמכסה את הפינים, שוב כדי לוודא שאף אחד מהאלקטרודות משכו בחוזקה.
- כאשר המנה היא מיקומו תחת מיקרוסקופ, את האלקטרודות צריכה להיות עטופה בעדינות על צידי הצלחת והמנוחה על הרציף ליד הצלחת.
- במהלך הפסקות ובין השלבים של הניסוי, לאוורר המלוח בתא ההמוני buccal באמצעות airstone אקווריום.
- הצמד גנגליון המוחין בגב עם קישורי ההמוחין-buccal (CBCs), שעובר בחריץ. החל גרם ואקום יותרrease על CBCs, לאחר מכן להוסיף מלח Aplysia יותר לשני החלקים של הצלחת, כך הגרעינים הם שקועים לחלוטין. ודא כי הכמות של שומן ואקום הנוסף היא גבוהה יותר מהרמה של מי מלח בשני תאי המוח או buccal כך אין זליגה מתרחשת בין התאים. בשלב זה, מסת buccal צריכה לנוח בתחתית התא הקדמי כדי לא למשוך יותר מדי כוח על העצבים וגרעינים.
- הצמד גרעיני buccal על פלטפורמת האמצע. כדי להימנע מניזק לעצבים שעדיין מחוברים למסת buccal, הנח פינים רק על הנדן בין שני עצבים. הוסף עוד שני פינים בצד של CBCs כדי למתוח ולעגן אותם.
- להחזיק בדירת buccal הגרעינים או לסובב מבוססת על מיקומו של הנוירונים של עניין. כדי לסובב את גנגליון buccal, להשתמש במלקחיים עדינים לנדן לתפוס קצת עודף של CBC ולהצמיד אותו בין עצבי buccal 2 ו 3. אז רוב הגופות הסלולריות, כי הם בסמוך לחדר האחורי ולא יכול להיות easily לגשת מהחלק העליון של הגנגליון buccal ניתן לראות. לבסוף, להוסיף שני פינים בנדן של גנגליון הסמוך לצד ההמוני buccal כדי למזער את התנועה של גנגליון buccal buccal. ראה איור 4.
- השתמש במלקחיים עדינים לתפוס את הנדן של גנגליון הסמוך לחדר האחורי buccal, ולאחר מכן לחתוך את הנדן העודף עם מספריים מצוינים בלי לחשוף את גופי התא. כדי למזער את הניזק, הוצא את כמות נדן הצורך לראות את גופי תאים בלבד.
7. גירוי והקלטה
- לאחר הדילול של הנדן הושלם, לצרף את כל סיכות אלקטרודה לחוריהן בכבלים המחברים את המגברים. שוב, לוודא שהאלקטרודות לא משכה בחוזקה בעת עושה את זה. ודא שהאלקטרודות מחוברות נכונה לכבלים המתאימים להן וכי הקוטביות נכונה.
- כדי לשטוף את כל מגנזיום כלוריד שנותר, החלף Aplysiמלח בתא ההמוני buccal עם מלח Aplysia טרי.
- השחל תפר משי דרך הרקמות הרכות בחלק הקדמי של מסת buccal, anterodorsal לסחוס בלסת, ולהשתמש בשתי חתיכות של פלסטלינה לצרף תפר לקצה הצלחת, ובכך השעיית המונית buccal מהקצה הקדמי שלה. שים לב כי בסופו האחורי מושעה על ידי עצבי buccal המצורפים לגרעיני buccal.
- מקם מניפולטור מחזיק האלקטרודה תאית זכוכית כך שקצה האלקטרודה קרובה גנגליון buccal.
- כדי לאתר ולזהות נוירון, השתמש מניפולטור עדינות ללחוץ כלפי מטה את הקצה של האלקטרודה התאית על העורלה מעל נוירון סומה (איור 5). החל נוכחי מעורר, ולאחר מכן לעבור לערוץ שנמצא בשימוש כדי להלהיב את סומה למצב הקלטה כדי להקליט את הפעילות על האלקטרודה התאית ופעילות מקבילה על העצבים (איור 6). להתייחסלמפות שפורסמו גנגליון ותיאורי נוירון, כוללים תחזיות עצביות ועצבוב שרירים, (למשל 7,8) לעזרה בזיהוי של תאי עצב.
- להקלטת וידאו של תוכניות האכלה, עמדת מראה בצד של הצלחת, כך שהתצוגות הקדמיות והצדדיות של מסת buccal ניתן לראות בו זמנית (מיקום של המראה מוצג סכמטי באיור 1). מקם מצלמת וידאו קדמי ועם נוף צדדי בתחומו של נוף.
- הקלטות וידאו ואלקטרו ניתן לסנכרן באמצעות שליחת TTL דופק לשניהם שעון אלקטרוני בתצוגה של המצלמה ולערוץ בAxoGraph, תכנית המחשב המשמשת להקלטה וניתוח נתוני אלקטרו. דופק זה מספק נקודת זמן שהיא בדיוק אותו הדבר בהקלטות AxoGraph ווידאו, אשר מבוססים על הקבצים שניתן לסנכרן.
- לאחר נוירון ממוקם, פעילותו ניתן להקליט בהתנהגויות האכלה דמוית שונות, CA אשרn שהושר כמתואר להלן.
- כדי לגרום לדחייה כמו תוכניות מוטוריות, לגרות BN2-עם שובל ארוך של 2 הרץ, 1 msec 9 קטניות (הניסיון שלנו הוא שהגירוי הזה אמין מייצר דפוסי egestive בהגדרה זו). דפוסים להמשיך לתקופת הגירוי ויכולים להימשך עד זמן קצר לאחר הגירוי מסתיים.
- כדי לגרום לתוכנות מוטוריות נושך כמו 12, מקום כמה גבישים של carbachol המוצק ישירות על גנגליון המוחין. לחלופין, אם ברמה מבוקרת של חשיפת carbachol היא צורך, להשתמש בפתרון של בין 1 ל 10 carbachol המ"מ Aplysia מלוח. ריכוזים גבוהים יותר עשויים להניב תגובות. דפוסים חוזרים בדרך כלל מתחילים בתוך 5 דקות, ועבר לבערך 10 עד 15 דקות לפני התחילה לרוץ למטה.
- כדי לגרום לבליעה כמו תוכניות מוטוריות 13, תחול carbachol, ולחכות עד שמסת buccal מייצרת נשיכות חזקות. ואז, במהלך נשיכה, הנח רצועהשל אצות (כיור מיובש) בפיו של בעל החיים כדי שradula תופס אצות הים (איור 7). רצועות הן בדרך כלל רחבות 0.5 סנטימטרים על 5 סנטימטר באורך.
- לאחר הסדרה הראשונה של דפוסים carbachol מושרים, הוא לעתים קרובות ניתן לקבל תשובות carbachol נוספות. לשטוף ביסודיות את מלוח Aplysia בתא גנגליון המוחין, הסרה והחלפה המלוחה לפחות שלוש פעמים. חכה לפחות 20 דקות לפני מריחת carbachol שוב. מחכה עד 40 דקות עשויות להניב תוצאות אמינות יותר.
בשלב זה בארצות הברית, בעלי חיים חסרי חוליות אינם דורשים אישור רשמי על ידי שימוש בבעלי חיים מוסדיים ועדה וטיפול. עם זאת, אנו מבטיחים שכל הטיפולים של Aplysia למזער את הניזק וסבלו לבעלי החיים, וכי כל הניתוחים נעשים בעוד החיה היא מורדמת באופן מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה קודמת אפיינה תוכניות Aplysia מוטוריות בבעלי החיים השלמים ובהכנות מוקטנות, כגון גרעינים מבודדים. בחיה השלמה, למרות שהקלטות של נוירונים בודדים הושגו 5, ניסויים כאלה הם קשים מאוד, ואלקטרודות לא ניתן להעביר מתא העצב לתא עצב במהלך האכלה. בגרעינים מבודדים, תנועות ההאכלה הנגרמות על ידי פעילות עצבית לא ניתן לצפות. ההכנה ההמונית buccal המושעה מגשרת על הפער בין שני הקטבים האלה.
תכשירים אחרים למחצה שלמים היו בשימוש במחקרים קודמים, אך ההכנה ההמונית buccal המושעה יש יתרונות משמעותיים. בהכנה 1 חצי שלמות, השפות ומסת buccal היו עדיין מחוברות, אבל ההכנה הופחתה מדי לתנועות האכלה מלאות שנצפתה 14. 15,16 תצפית הכנת ראש ההאכלה מוותרת של האכלת תנועות במבחנה. עם זאת, המאכיל הכנת הראש היה יותר מסובך להקים ממסת buccal המושעה מתוארת כאן, וספק רק גישה לנוירונים בודדים בגנגליון המוחין, לא בגנגליון buccal. יש יתרון להכנת ראש ההאכלה, שבנוכחות של השפות ומחושים קדמיים אפשרה לדור של דפוסים עוקצים באמצעות גירוי טבעי, יישום של אצות. למרות שזה היה עושה את הניסוי קשה יותר, זה עשוי להיות אפשרי לשלב ההכנות, ומשאירים את השפות המחוברות למסת buccal עת גם מצמידים גרעיני buccal עבור גישה לנוירונים בודדים.
תבניות אכילה בAplysia יכולות להיות מסווגות או ingestive egestive מבוסס על העיתוי של פעילות על עצב radular, שסוגר גספר המזון, ביחס לארכה ושלבי נסיגה של תוכניות מוטוריות. אם הפעילות העצבית radular מתרחשת באותו הזמן כשלב ההכחשה, דפוסים הם ingestiיש, כי גספר הוא סגירה וחוזר בי כפי שהיא מנסה למשוך את האוכל לתוך חלל buccal. אם הפעילות העצבית radular מתרחשת בשלב הארכה, דפוסים הם egestive, כי גספר הוא סגירה וprotracting לדחוף חומר מתוך 2 החלל buccal.
דפוסי Ingestive ניתן לחלק לפחות שניים ברורי סוגי משנה: עוקצניים, מנסה לתפוס אוכל, ובליעה, הובלה של 1,2 מזון כבר הבין. עם זאת, רוב העבודה במבחנה (למשל 14,17,18) התמקד רק בבליעה / egestion הדיכוטומיה, ולא מנסה להבחין נשיכה מהבליעה. שני מחקרים 16,19 סיווגו בדפוסי ingestive מבחנה בקבוצות כמו נשיכה ובליעה, כמו. בחלק הראשון של מחקרים אלה, הדפוסים נצפו בגרעינים בודדים; אם תנועות ההאכלה הקשורות של מסת buccal יכולות להיבחן, זה יחזק את הטענה כידפוסי se מייצגים נושכים ובליעה ראתה בגוף חי. במחקר השני, את הדפוסים נצפו בהכנת ראש האכלה, ולכן דפוסים סווגו מבוססים על תנועות שנצפו, אך לא הוקלט נוירונים גנגליון buccal התקבלו.
ההכנה ההמונית buccal המושעה מספקת דרך לבחון את כל שלושת הסוגים של התנהגויות - נשיכה, בליעה, ודחייה - ובמקביל להקליט את הפעילות מעצבים מרכזיים buccal ושרירים, והן מעורר והקלטה מתא עצב בודד. טכניקת נוירון התאית 6 היא עוד התקדמות מפתח בהכנה הזאת, כי תנועות האכלה הדמויות החזקות שהושרו באופן כמעט ודאי לעקור אלקטרודה תאיים. עם הקלטות תאיות של נוירונים בודדים, התזמון של פעילות תאי העצב האלה בתוכניות מוטוריות יכול להיות הוברר מתי זה יהיה קשה עם הקלטות עצב לבד, כי רבות הן יחידות שונות וiring בו זמנית.
אנו צפינו שבתנועות האכלה במסת buccal השעתה תופענה איכותי דומות לאלו שראו בגוף חי. חשוב מכך, גירויים המשמשים ליצירת דפוסים עוקצים ודחייה (carbachol ו2 סניף buccal עצבי גירוי, בהתאמה) היה בשימוש בתכשירים יותר המופחת ומוצאים כי הגירויים לייצר תנועות פיסיולוגיות מקנה אמינה לשימוש בם במסגרות אחרות. לעומת זאת, כדי ליצור דפוסי בליעה, אנו משלבים גירוי מלאכותי (carbachol) עם גירוי מזון טבעי (פס אצות) שלא יכול להיות מיושם על גרעינים מבודדים. יש לנו גם הבחינו כי הדפוסים העצביים במסת buccal המושעה להיראות דומה יותר לדפוסי vivo מהדפוסים שהושגו בהכנות יותר מופחתות, מה שמרמז משוב תחושתי עשוי להיות חשוב בעיצוב הדפוסים מCPG. לדוגמה, מנוע תוכניות בכנופיה מבודדתליה היא בדרך כלל מספר פעמים כבר בתקופה מתוכניות מוטוריות בבעלי חיים ללא פגע, ואילו תוכניות מוטוריות במסת buccal המושעה הן בדרך כלל הרבה יותר קרובות במשך לתוכניות מוטוריות בבעלי חיים שלמים (נתונים שלא פורסמו). יתרון נוסף של מסת buccal המושעה הוא שהצד בו זמנית ותצוגות קדמיות של מכשיר ההאכלה ניתן להשיג. מול הנוף מספק תצוגה דומה של הפה למה שהייתי ניתן לראות בחי, ובמקביל לאפשר תצפית טובה יותר של התכווצות שרירי לסת. מבט מהצד מאפשר תצפית של התכווצויות שרירי buccal ותנועה קדימה ואחורה של גספר מתחת לשרירים, מה שהופך אותו קלה יותר להבנת שינויים ביומכניים בהתנהגויות השונות.
בהכנה הזאת, יש לנו נרשם עד חמישה מעצבים (עצב ועצבי radular buccal הבילטרליים 2 ו 3) וI2 השרירים בו זמנית, והנחתי את שתי אלקטרודות תאיות מעל מזוההתאי עצב בגנגליון. זה יהיה אפשרי להקליט מעצבים נוספים ו / או בשרירים, אם הנסיין רצוי. זה גם יהיה אפשר לגרות ולהקליט מהנוירונים בגנגליון המוח, מה שיכול לתת תובנה אם גירוי של interneurons buccal המוחיה, טכניקה נפוצה 17,19, גורם לתוכניות מוטוריות דומות להתנהגות בגוף חייה. אמנם כך מגביר את הקושי הטכני של ההכנה, טפטוף של עורק buccal 15 עלול לאפשר ההכנה לייצר התנהגויות חזקות וארוך טווח (תצפיות שלא פורסמו).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH NS047073 ומענק NSF DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
