Summary
Nós descrevemos uma técnica para gravar extracelularmente e estimular a partir de nervos, músculos e neurônios individuais identificados
Abstract
Multifuncionalidade, a capacidade de uma estrutura periférica de gerar múltiplos comportamentos distintos 1, permite animais para se adaptar rapidamente seus comportamentos a ambientes em mudança. O molusco marinho Aplysia californica fornece um sistema tratável para o estudo da multifuncionalidade. Durante a alimentação, Aplysia gera vários tipos distintos de comportamento utilizando o mesmo aparelho de alimentação, a massa bucal. Os gânglios que controlam esses comportamentos conter um número de grandes neurônios identificados que são acessíveis para estudo eletrofisiológico. A actividade destes neurónios tem sido descrita em programas motores que podem ser divididos em dois tipos, os programas e ingestivo egestive, com base no tempo de actividade neural que fecha o parente grasper alimento para a actividade neural que prolonga-se ou retrai a grasper 2. Contudo, nos gânglios isolado, os movimentos musculares que produzem esses comportamentos são ausentes, tornando-mais difícil de ser determinado se os programas motores observados são correlatos de comportamentos reais. Em gravações nervosas in vivo, e os músculos foram obtidos correspondente a programas de alimentação 2,3,4, mas é muito difícil de gravar directamente a partir de neurónios individuais 5. Além disso, in vivo, programas ingestivo pode ainda ser dividido em mordidas e 1,2 engole, uma distinção que é difícil de fazer na maioria descrito anteriormente em preparações in vitro.
A preparação de massa suspensa bucal (Figura 1) faz a ponte entre núcleos isolados e animais intactos. Nesta preparação, comportamentos ingestivo - incluindo tanto a morder e engolir - e comportamentos egestive (rejeição) pode ser provocada, ao mesmo tempo, como neurónios individuais podem ser registados a partir de e estimulada utilizando eléctrodos extracelulares 6. Os movimentos de alimentação associados com estes comportamentos diferentes podem ser recorded, quantificado e relacionado diretamente para os programas motores. Os programas de motor na preparação de massa suspensa bucal parecem ser mais semelhantes aos observados in vivo do que os programas motores em gânglios provocou isolado. Assim, os programas de motor desta preparação pode estar mais directamente relacionada com comportamento in vivo e, ao mesmo tempo, os neurónios individuais são mais acessíveis para a gravação e a estimulação do que nos animais intactos. Além disso, como um passo intermediário entre gânglios isolado e animais intactos, os achados da massa suspensa bucal pode auxiliar na interpretação de dados obtidos em ambas as configurações mais reduzidas e mais intacta. A preparação da massa suspensa bucal é uma ferramenta útil para caracterizar o controle neural da multifuncionalidade na Aplysia.
Protocol
1. Preparação de Soluções
- Para preparar as soluções de cloreto de magnésio, que é isotónica com a água do mar em que os animais são mantidos (~ 1.000 millosmolar), marcar um jarro grande no nível de volume desejado. Encher o jarro com água destilada até cerca de 80% deste nível, e pesar a quantidade apropriada de cloreto de magnésio hexa-hidratado para criar uma solução de 333 mM no volume final. Adicionar o cloreto de magnésio para o jarro, fechar a tampa e agitar vigorosamente até que o cloreto de magnésio é completamente dissolvido e, em seguida, adicionar água destilada até que o volume final seja alcançada.
- Para preparar salina Aplysia, novamente marcar um jarro grande no nível do volume desejado, e encher-se com água destilada até cerca de 80% deste nível. Coloque o jarro em uma placa de agitação, coloque uma barra de agitação no jarro, e ligue a placa de agitação.
- Um por um, pesar e adicionar o jarro as quantidades adequadas das seguintes substâncias para criar estes concentrações no volume final: 460 mM de cloreto de sódio, cloreto de potássio 10 mM, 22 mM de cloreto de magnésio hexa-hidratado, 33 mM de sulfato de magnésio heptahidratado, 10 mM de di-hidrato de cloreto de cálcio, 10 mM de glicose, 10 mM de MOPS.
- Uma vez que os solutos estão completamente dissolvidos, utilizar um medidor de pH para medir o pH da solução. Lentamente, adicionar hidróxido de sódio 1 M para aumentar o pH para um valor final de 7,5. Se você adicionar acidentalmente hidróxido de sódio muito, você pode adicionar 1 M de ácido clorídrico para baixar o pH.
- Adicione água destilada até que o volume final seja alcançada.
- Para retardar o crescimento de bactérias, as soluções de armazenamento na geladeira até ser necessário para um experimento. Note-se que a temperatura pode afectar programas motores Aplysia. Nós não monitorar cuidadosamente a temperatura, mas após a instalação estiver concluída, os preparativos estão normalmente temperatura ambiente próximo.
2. Preparação do prato de gravação
- Durante a experiência, a massa bucal será suspenso em solução emuma de 100 mm redonda (diâmetro) x 50 mm (altura) pirex. Este prato deve ter uma câmara frontal para a massa bucal, um estreito, plataforma do meio elevada onde os gânglios bucal são fixadas em Sylgard, e um separado, câmara traseira elevada onde o gânglio cerebral é isolado. Um entalhe na Sylgard deve ligar a plataforma gânglio vestibular para a câmara de gânglio cerebral. Ver Figura 1, referindo-se as dimensões especificadas chave aquando da construção do prato.
- Para criar este prato, comece com uma rodada de 100 x 50 milímetros pirex. Prepare Sylgard seguindo as instruções fornecidas com o produto. Construção do prato vai exigir várias derrama de Sylgard, entre os quais o Sylgard devem ser autorizados a definir.
- A primeira é de fluidez para criar o nível mais elevado de Sylgard no prato, a parede entre as câmaras de bucais e cerebrais (veja a Figura 1). Bloquear essa porção do prato das outras secções. Massa de modelar pode ser usado para construirparedes para bloquear seções. Por uma parede plana, um pedaço de cartão pode ser utilizado, com um suporte de massa de modelar. Por uma parede curva (o que reduz o tamanho da câmara contendo o gânglio cerebral), utilizar massa de modelar sozinho como base para a parede. Revestir todas as paredes com plástico, onde entrará em contato com o Sylgard para facilitar a remoção.
- Uma vez que o espaço para a parede entre as câmaras de bucais e cerebral foi bloqueado, conforme descrito em 2.3, assegurando selos apertados nas bordas para minimizar as fugas, despeje Sylgard para este espaço quase até ao topo do prato. Deixe o jogo Sylgard durante a noite, e certifique-se de que está totalmente definida antes de continuar. Colocar o prato em um lugar quente vai induzir configuração mais rápida.
- Em seguida, a plataforma gânglio vestibular e câmara de gânglio cerebral deve ser derramado (mais uma vez, ver a Figura 1, que mostra as localizações do gânglio no prato completo). Remover as paredes anteriores de bloqueio, e criar um novo muro de um diposição 0,5 centímetros a partir da parede Sylgard plana da secção do meio para bloquear a plataforma gânglio vestibular. Sem paredes são necessárias para criar a câmara de volta que irá realizar o gânglio cerebral. Despeje Sylgard em ambas as secções, até uma altura de cerca de 3 mm abaixo do nível superior. A câmara cerebral deve ser apenas ligeiramente mais baixa do que a plataforma gânglio vestibular. Mais uma vez, deixe o Sylgard definir durante a noite.
- Por último, verter a câmara dianteira (isto é, a câmara na qual a massa bucal será suspensa). Não são necessárias paredes. Despeje a altura apropriada, tal como especificado na Figura 1.
- A etapa final é cortar um entalhe de ligação da plataforma de gânglios bucal ea câmara cerebral. A profundidade do entalhe deve ser o mesmo que o nível da plataforma gânglio vestibular. Uma lâmina de bisturi pode ser usado para cortar o entalhe. Figura 1 ilustra o prato completo.
3. Preparação do eletrodo
- Puxe e extracelularlectrodes de um único cano capilar de vidro usando um Flaming-Brown micropipeta extrator. Diâmetros dos eléctrodos interiores 'deve ser cerca de 40 um e as suas resistências devem ser cerca de 0,1 MQ. Com o filamento FT345B no extrator, nossas definições do programa extrator são típicas de calor 480, Pull 50, Vel 13, 20 e hora, mas note que as configurações serão diferentes para filamentos diferentes. Este programa cria os eletrodos em um único puxão sem fase de polimento fogo. Antes de iniciar uma experiência, reaterro os eletrodos extracelulares com Aplysia salina.
- Criar eléctrodos de gancho para nervo e músculo de gravação 2, seguindo um protocolo semelhante ao descrito por Cullins Chiel e 4, excepto que os eléctrodos individuais não têm de ser envolvida em torno de si. Os passos para criar esses eletrodos seguir 3,3-3,13.
- Cortar um pedaço de esmalte-revestidos, fios de diâmetro 0,001 cm de aço inoxidável com um comprimento de cerca de 60 cm. Anexar uma bola de massa de modelarpara cada uma das extremidades do fio, segurar o fio para o ar no seu ponto médio, e gira as duas bolas de argila em torno de si para envolver os fios em volta uma da outra (o que reduz os transientes capacitivas).
- Segurar as duas extremidades do fio, juntando-se as duas bolas de argila em que uma bola, e a outra extremidade da fita do fio para suspender o fio.
- Brasão todo o comprimento do fio de cola de silicone casa, colocando uma bola de cola no seu polegar, tocando o polegar eo dedo indicador juntos no fio, e executá-los ao longo do fio. Deixe a cola secar durante a noite.
- Depois de a cola secar, colocar o fio sobre uma superfície plana sob um microscópio binocular de dissecação. Cortar a extremidade do fio que foi previamente no meio, resultando em dois fios separados torcidos juntos. Este é um eléctrodo diferencial.
- Use fita adesiva para segurar uma das extremidades do eletrodo no lugar. Usando pinças para retirar a cola e esmalte, preparar ambos os fios em uma extremidade para ter aproximadamente 2 cm of fio livre, com cerca de 1 cm, o fio removido do esmalte. Soldar um pino de ligação do ouro para cada um dos fios, e fita de laboratório lugar em volta dos pinos para mantê-las separadas.
- Na outra extremidade do eléctrodo, preparar os fios para ter cerca de 3 mm de fio livre. Remova o esmalte dos últimos aproximadamente 1 mm de um fio, e dobrar esse fio trás e para fora do caminho. Este é o fio de referência. É crítico que os dois fios não tem fio nu tocar uns aos outros.
- Remover o esmalte de outro fio por todo o caminho para a cola de silicone. Torcer este fio em um gancho e cortá-la a um comprimento de cerca de 1 mm. Este gancho irá anexar ao nervo ou músculo. Usando um gancho curto proporciona uma maior estabilidade, quando o nervo está a ser ligada ao eléctrodo.
- Utilizar um multímetro para verificar que o eléctrodo é de construção adequada e intacta. Um conector de ouro deve ter uma leitura de resistência de cerca de 200-500 ohms com respeito à ponta de um fio, e o outro ligar ouroou deve ter uma leitura similar em relação ao outro fio.
- Se não houver uma ligação intacta de um fio, que pode ser possível voltar a retirar a extremidade do fio e re-soldar um ou ambos os conectores de ouro para criar estas ligações. Se os dois conectores de ouro têm conexões com ambos os fios, o eletrodo pode ter dois fios desencapados fazer contato. Pode ser possível fixar a outra extremidade a eliminar este problema, caso contrário, o eléctrodo deve ser descartada.
- Repetir este procedimento para os eléctrodos como quantas são necessárias para a experiência. Eléctrodos de gancho pode ser re-utilizado de experiência para experiência, cortando a extremidade que ligada ao nervo e criando novas ganchos, até que o fio se torna muito curto após muitas utilizações. Cada vez que isto é feito, use o multímetro para verificar que o eléctrodo está intacta.
- Para manter o controle dos diferentes tipos de eletrodos durante as experiências, eletrodos de etiqueta e seus cabos. Usando cores diferentes de fita laboratório é útil.
- Escolha um animal saudável de cerca de 200-300 g de peso. Quando apresentado com algas marinhas, o animal deve produzir picadas com protractions fortes em intervalos regulares de 3-5 seg.
- Coloque o animal em uma bandeja de dissecação e anestesiar pela injeção de cerca de 50% do corpo de solução de cloreto de magnésio peso isotônica. Fazer a primeira injecção com a seringa em cerca de um ângulo de 15-30 graus, perto do centro e na direcção da cauda do animal. Após a injecção, massagem suavemente da superfície do animal a espalhar-se o cloreto de magnésio. Faça injeções adicionais, conforme necessário, com a seringa apontada para a cabeça do animal.
- Depois que o animal deixa de responder aos estímulos táteis suaves, prender o animal para a bandeja de lado, dorsal para cima, com um pino na cauda e um pino em cada tentáculo anterior.
- Use uma pinça para apertar e levantar a pele do animal, no meio da cabeça, atrás dos rhinoforos. Make uma incisão coronal através da cabeça do animal, logo atrás do ponto que está sendo realizada. Em seguida, fazer uma incisão sagital médio vai para a frente entre os rhinoforos em direção à boca, expondo a massa bucal.
- Use uma pinça para puxar a retalho de pele mais perto de você longe da massa bucal, e cortou os nervos e tecidos conectivos que ligam à parede do corpo plenamente separar este retalho de pele da massa bucal. Certifique-se de não cortar os nervos ou tecidos intrínseca à massa bucal.
- Use uma pinça para agarrar e segurar o esôfago. Cortar o posterior esôfago ao ponto que está sendo realizada. Puxe o esôfago para levantar a massa bucal como os seguintes cortes são feitos.
- Por trás da massa bucal, a cerebral, pleural, e gânglios pedal forma um anel, com o gânglio cerebral ligada ao gânglio vestibular pelos conectivos cerebral-bucais (CBCs). Deixar gânglio do anel ligado à massa bucal, e corte todos os nervos que se projectam a partir destes núcleos para outras partes doo corpo.
- Cortar através do tecido conjuntivo por todo o bocal de massa, continuando a elevar-se a massa bucal, uma vez que se torna menos ligado ao corpo. Uma vez que a massa bucal é apenas ligado na boca, esôfago e massa bucal deve ser realizada em linha reta.
- Fazer um corte final apenas anterior para as mandíbulas para libertar a massa do corpo do bocal. Coloque a massa bucal em uma solução de 50% de solução isotónica de cloreto de magnésio e 50% de salina Aplysia para manter anestesia parcial, enquanto os eléctrodos são ligados.
- Coloque a massa bucal, com uma solução, em uma placa de Petri com fundo Sylgard. Remova os gânglios pleural e pedal, cortando suas conexões com o gânglio cerebral. Deixe o gânglio cerebral ligado à gânglios bucal e da massa bucal através dos conectivos cerebral-vestibular (CBCS); cortar as outras ligações entre o gânglio cerebral e massa bucal. Apare o esôfago e glândulas salivares de comprimentos curtos para que não get no caminho.
5. Anexo Eletrodo de gancho
- Para gravação e estimulação, os eléctrodos de gancho pode ser ligada a um certo número de diferentes nervos e músculos, como apropriado para a experiência (Figura 2).
- Para caracterizar o padrão como demonstrado in vivo por Cullins Chiel e 4, os eléctrodos anexar ao nervo radular, o músculo I2, e os nervos bucais 2 e 3. Em conjunto, estas gravações mostram a actividade de neurónios motores para os músculos principais intrínsecas à massa bucal 3,7,8, e permite a identificação da fase de prolongamento a partir da gravação I2 3, a fase de retracção dos nervos bucais 2 e 3 gravações dois , 5,8 e tempo de encerramento do grasper comida do 2 radular nervo gravação. Anexar um eletrodo gancho adicional para um ramo de 2 nervo bucal para a estimulação padrão. Fixação dos eléctrodos segue um procedimento semelhante ao demonsed por Cullins Chiel e 4, e é descrito nas etapas seguintes.
- Para cada anexo eletrodo, colocar o eletrodo em um manipulador grosseiro. Para o manipulador, gravam um bastão de madeira com um jacaré em sua extremidade e use o clipe para segurar o fim do eletrodo. O grampo deverá juntar à secção de silicone com revestimento do eléctrodo, cerca de 1 cm antes do final do revestimento de silicone. Use o manipulador para posicionar o eletrodo gancho perto da massa bucal.
- Com a massa bucal de lado e colocada contra o lado do prato para a estabilidade, a começar com o nervo radular, que apresenta a ligação do eléctrodo mais difícil. Há duas opções para aceder a este nervo.
- Os projetos da rádula nervosos debaixo do gânglio vestibular e vai sob o músculo I2 em dois ramos. Primeiro, veja se o nervo radular pode ser acessado sem cortar o músculo. Com cuidado, empurre de lado a bainha branca anexando o gânglio vestibular para o músculo I2; do não corte esse bainha. Se o nervo é acessível, utilize uma pinça com a ponta dobrada em um gancho para levantar um ramo do nervo.
- Se o nervo radular não é acessível, desta forma, a segunda opção é a de localizar o nervo abaixo do músculo I2 fina, e fazer uma pequena incisão na I2 para expor o nervo. Esta incisão deve passar por duas camadas de músculo. Use a pinça em forma de gancho para puxar um ramo do nervo radular por debaixo do músculo.
- Use o manipulador para posicionar o eléctrodo de gancho ao lado do nervo. Para colocar o nervo para o gancho, é útil para manter o nervo a pinça em forma de gancho, enquanto simultaneamente usando outro par de fórceps para criar a separação entre as duas metades do nervo a ser realizada.
- Após o nervo é segura no gancho, use o manipulador de levantar o nervo para longe da massa bucal até que seja firme, mas não exagerado.
- Dê uma Kimwipe e firmemente torcer um canto para formar um pavio pequeno. Utilizar este pavio para secar oextremidade do eléctrodo e da secção do nervo que está viciado.
- Use um outro conjunto de ponta-curvada pinça para aplicar uma bola de cola rápida Gel super para o nervo de gancho. Comece a aplicação no ponto de contato entre o cabo e os nervos. Certifique-se de que o gancho é completamente coberto com cola, e que a ponta do fio de referência que não é coberta com cola (Figura 3).
- Use uma seringa com uma tubagem de polietileno de fixação para aplicar uma solução a partir da placa para a cola, a qual irá induzir a superfície da cola para definir. Certifique-se de que a cola completamente banho com solução de garantir que a cola seque adequadamente.
- Use o manipulador para liberar a tensão sobre o nervo e, em seguida, solte o eletrodo do clipe. Isso conclui o procedimento de anexar um eletrodo de gancho.
- O eletrodo muscular I2 deve ser anexado seguinte. Nós registrar a atividade EMG do músculo I2 em vez de atividade ENG de sua inervação nervosa porque o nervo I2 é muito small e de difícil acesso em uma massa intacta bucal. Perto do nervo vestibular 2, utilize a pinça em forma de gancho para levantar um ou dois grupos do músculo I2, e usar um outro par de pinças para ajudar a separar do resto do músculo. A porção de I2 separado deve ser semelhante em espessura ao nervo bucal 2 ou 3. Tenha cuidado para não sobre-separada (que pode denervar o músculo). Anexar um eletrodo gancho com o mesmo procedimento utilizado para o nervo radular.
- O eletrodo ao lado de anexar é que, para um ramo do nervo vestibular 2. Este ramo pode ser estimulado eletricamente para induzir programas motores 9. Antes nervo bucal 2 vai por baixo do músculo I1 no sulco lateral, o nervo trifurcates; uma filial é o primeiro ramo de separar. Os ramos são bastante pequeno, o apego eletrodo deve ser feito com cuidado. Siga o mesmo procedimento para prender o eletrodo.
- Nervos vestibulares 2 e 3 são de fácil acesso. Siga o mesmo procedimento, anexando o electrodos aproximadamente a meio caminho entre o gânglio vestibular e sulco lateral.
- Para ajudar a distinguir os neurónios com projecções unilateral vs bilateral, é também útil para ligar os eléctrodos ao nervos bucais 2 e 3, do outro lado da massa de bocal, assim como do nervo vestibular ramo 2 um, porque alguns neurónios respondem de forma diferente aos vs ipsilateral . contralateral BN2-a estimulação.
6. Posicionando o gânglio e Emagrecimento Bainha
- A massa bucal será transferido para o 100 x 50 milímetros rodada pirex descrito na seção 2. Veja a Figura 1.
- Aplicar uma camada fina de pasta de vácuo para o entalhe entre as câmaras cerebrais e bucal, utilizando uma ponta de pipeta para pegar uma bola de massa lubrificante de vácuo e espalhá-lo ao longo do entalhe. Descobrimos que a gordura vácuo minimiza fuga melhor do que a vaselina. Encha a câmara de frente com solução salina Aplysia. Cuidadosamente, mover a massa bucal do prato de Petri para a frente Chamber deste prato maior, certificando-se de que nenhum dos eletrodos são puxados com força, o que poderia quebrar os nervos.
- Se o prato deve ser transferida para um outro microscópio binocular dissecar para diluir a bainha, ter muito cuidado com os eletrodos de gancho. Grupo dos eléctrodos de um lado da massa bucal juntos, e também do grupo dos eléctrodos do outro lado da massa de juntas bucal. Cuidadosamente segurar os eletrodos, segurando a fita laboratório que cobre os pinos do conector, novamente certificando-se de que nenhum dos eletrodos são puxados com força.
- Quando o prato está posicionado sob o microscópio, os eléctrodos devem ser cobertas suavemente ao longo dos lados do prato e repousam sobre a plataforma ao lado do prato.
- Durante os intervalos e entre as fases do experimento, arejar a solução salina na câmara de massa bucal utilizando uma pedra porosa aquário.
- Pin o gânglio cerebral na parte de trás com os conectivos cerebral-vestibular (CBCS) que funcionam através do entalhe. Aplicar g mais vácuorease longo dos CBCs, em seguida, adicionar mais solução salina Aplysia para ambas as partes do prato, para que os gânglios são completamente submerso. Certifique-se de que a quantidade de gordura adicionada vácuo é maior do que o nível de solução salina em qualquer das câmaras cerebrais ou bocal de modo não existem fugas entre as câmaras. Nesta fase, a massa bucal deve repousar sobre o fundo da câmara de frente de modo a não puxar com muita força sobre os nervos e gânglios.
- Pin o gânglio vestibular da plataforma do meio. Para evitar danos nos nervos que ainda estão ligados à massa bucal, apenas colocar pinos na bainha entre dois nervos. Adicionar duas mais pinos no lado dos CBCs para esticar e ancorá-las.
- Manter o plano gânglio vestibular ou girados com base na localização dos neurónios de interesse. Para rodar o gânglio bucal, use uma pinça fina para pegar algumas bainha excesso do CBC e fixá-lo entre os nervos vestibulares 2 e 3. Em seguida, a maior parte dos corpos celulares que estão na proximidade da câmara de trás e não pode ser easily acedido a partir do topo do gânglio vestibular pode ser visto. Por fim, adicionar dois pinos na bainha do gânglio vestibular próxima do lado de massa bucal para minimizar o movimento do gânglio vestibular. Veja a Figura 4.
- Use uma pinça fina para agarrar a bainha do gânglio vestibular próximo da câmara posterior, e em seguida cortar a bainha excesso com uma tesoura fina, sem expor os corpos celulares. A fim de minimizar os danos, apenas remover a quantidade de revestimento necessária para ver os corpos celulares.
7. Estimulação e gravação
- Após o desbaste da bainha é concluído, anexar todos os pinos de eletrodos de suas órbitas dos cabos que se conectam aos amplificadores. Mais uma vez, certifique-se de que os eletrodos não são puxados com força ao fazer isto. Certifique-se de que os eletrodos estão corretamente ligados aos seus cabos apropriados e que as polaridades estão corretas.
- Para lavar qualquer cloreto de magnésio restante, substituir o Aplysiuma solução salina na câmara de massa bucal com solução salina Aplysia fresco.
- Um fio de sutura de seda através do tecido mole na parte da frente da massa bucal, ântero à cartilagem, mandíbula e usar dois pedaços de massa de modelar para prender o fio de sutura para a extremidade da cápsula, assim, suspender a massa bucal a partir da sua extremidade anterior. Note-se que a extremidade posterior é suspenso pelos nervos bucais associadas ao gânglio vestibular.
- Posicionar um manipulador que prende um eléctrodo de vidro extracelular de modo que a extremidade do eléctrodo está próximo do gânglio vestibular.
- Para localizar e identificar um neurônio, usar o manipulador para pressionar levemente a ponta do eletrodo extracelular para baixo na bainha sobre a soma neurônio (Figura 5). Aplicar uma corrente estimulante, e em seguida, mudar o canal que está sendo usado para excitar a soma para o modo de gravação, a fim de registrar a atividade no eletrodo extracelular e atividade correspondente sobre os nervos (Figura 6). Referira mapas e descrições publicados ganglionares neurônio, incluindo projeções nervosas e inervações musculares, (por exemplo, 7,8) para ajudar na identificação dos neurônios.
- Para a gravação de vídeo de programas de alimentação, posição de um espelho no lado do prato de modo a que vistas de frente e de lado da massa bucal pode ser visto simultaneamente (localização do espelho é mostrado esquematicamente na Figura 1). Posicione a câmera de vídeo com frente e laterais em seu campo de visão.
- As gravações de vídeo e eletrofisiológicos podem ser sincronizados através do envio de um pulso TTL, tanto para um temporizador eletrônico na visão da câmera e em um canal de AxoGraph, o programa de computador utilizado para gravar e analisar dados eletrofisiológicos. Este pulso fornece um ponto de tempo que é exatamente o mesmo nas gravações AxoGraph e vídeo, com base no qual os arquivos podem ser sincronizados.
- Depois de um neurônio está localizado, sua atividade pode ser gravado em diferentes alimentação comportamentos semelhantes, que can ser atingida, como descrito abaixo.
- Para induzir rejeição como programas motores, estimular BN2-a., Com uma longa série de 2 Hz, 1 ms pulsos 9 (nossa experiência é que esse estímulo de forma confiável gera padrões egestive neste cenário) Padrões de continuar para a duração do estímulo e pode continuar até que logo após a estimulação termina.
- Para induzir programas cortante do tipo do motor 12, colocar alguns cristais de carbacol sólido directamente no gânglio cerebral. Alternativamente, se um nível controlado de exposição carbacol é necessário, utilizar uma solução de entre 1 e 10 mM de carbacol em Aplysia salina. Concentrações mais elevadas são mais susceptíveis de produzir respostas. Padrões repetitivos geralmente começam dentro de 5 min, e duram cerca de 10 a 15 minutos antes de começar a descer.
- Para ingerir-como programas motores 13, aplicar carbacol, e esperar até que a massa bucal gera mordidas fortes. Então, durante uma mordida, coloque uma tirade algas (alga seca) na boca do animal, de modo que a radula agarra a alga (Figura 7). Tiras são geralmente 0,5 cm de largura por 5 cm de comprimento.
- Após a primeira série de carbacol induzidos padrões, é muitas vezes possível a obtenção de respostas adicionais carbacol. Lavar cuidadosamente a solução salina na câmara de Aplysia gânglio cerebral, removendo e substituindo a solução salina, pelo menos, três vezes. Espere pelo menos 20 minutos antes de aplicar carbacol novamente. Espera-se a 40 minutos pode render resultados mais confiáveis.
Neste momento, nos Estados Unidos, os animais invertebrados não exigem aprovação formal por um uso de animais institucional e comitê cuidado. No entanto, temos assegurado que todos os tratamentos de Aplysia minimizar os danos e sofrimento para o animal, e que todas as dissecações são feitas enquanto o animal está totalmente anestesiado.
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Discussion
O trabalho anterior tem caracterizado programas Aplysia a motor em animais intactos e em preparações reduzidas, tais como gânglio isolado. No animal intacto, embora as gravações de neurónios individuais foram obtidos 5, tais experiências são muito difíceis, e os eléctrodos não podem ser movidos entre os neurônios durante a alimentação. Em gânglios isolado, os movimentos de alimentação induzidos pela actividade neural não pode ser observado. A preparação da massa suspensa bucal faz a ponte entre esses dois extremos.
Outras preparações semi-intactas foram utilizadas em estudos anteriores, mas a preparação de massa suspensa bucal tem vantagens significativas. Em uma preparação semi-intactas, os lábios e massa bucal foram ainda ligado, mas a preparação foi muito reduzida para os movimentos de alimentação completos a serem observadas 14. Uma preparação cabeça alimentação 15,16 observação permitido de alimentação movimentos in vitro. No entanto º,está alimentando preparação cabeça era mais complicado de configurar do que a massa suspensa bucal descrito aqui, e só permitiu o acesso a neurônios individuais no gânglio cerebral, e não no gânglio bucal. Há uma vantagem para a preparação da cabeça de alimentação, na medida em que a presença dos bordos anterior e tentáculos permitiu a geração de padrões de morder através de um estímulo natural, aplicação de algas marinhas. Apesar de que seria fazer a experiência mais difícil, pode ser possível combinar as preparações, deixando os bordos ligados à massa, enquanto também bucal fixando o gânglio vestibular para o acesso a neurónios individuais.
Padrões de alimentação em Aplysia pode ser classificada como ingestivo ou egestive com base no tempo de atividade no nervo radular, que fecha a pinça de alimentos, em relação ao prolongamento e fases de retração de programas motores. Se a actividade do nervo radular ocorre ao mesmo tempo que a fase de retracção, os padrões são ingestive, porque a pinça está a fechar e retrair, uma vez que as tentativas para puxar alimento para dentro da cavidade bucal. Se a actividade do nervo radular ocorre durante a fase de prolongamento, os padrões são egestive, porque a pinça está a fechar e prolongando a empurrar o material para fora da cavidade bucal 2.
Padrões ingestivo pode ser dividido em pelo menos dois sub-tipos distintos: mordedores, tenta agarrar alimentos e a deglutição, o transporte de alimentos já agarrado 1,2. No entanto, a maioria in vitro de trabalho (por exemplo, 14,17,18) concentrou-se apenas na dicotomia ingestão / egestion, não tentar distinguir cortante de engolir. Dois estudos 16,19 classificaram em padrões in vitro ingestivo em grupos do tipo cortante e engolindo-like. No primeiro destes estudos, os padrões foram observadas nos gânglios isolado, se os movimentos de alimentação associados da massa bucal pode ser observado, isto fortalece o argumento de que apadrões de si representam a morder e deglutição visto in vivo. No segundo estudo, os padrões foram observados numa preparação cabeça de alimentação, de modo padrões foram classificados com base em movimentos observados, mas não há registos de neurónios ganglionares vestibulares foram obtidos.
A preparação da massa suspensa bucal fornece uma maneira de observar os três tipos de comportamentos - mordendo, deglutição e rejeição - ao mesmo tempo em registrar a atividade dos principais nervos e músculos bucais e, ao mesmo tempo estimulante e gravação de neurônios individuais. A técnica neurónio extracelular 6 é um outro avanço essencial nesta preparação, por causa dos fortes movimentos de alimentação do tipo eliciados quase certamente desalojar um eléctrodo intracelular. Com gravações extracelulares de neurônios individuais, o tempo de atividade desses neurônios durante programas motores pode ser verificada quando isso seria difícil com gravações nervosas só, porque muitas unidades diferentes são fiRING simultaneamente.
Observou-se que os movimentos de alimentação da massa suspensa bucal aparecem qualitativamente semelhantes aos observados in vivo. É importante notar que os estímulos usado para gerar os padrões de cortantes e de rejeição (carbacol e bucal nervo dois ramos de um estímulo, respectivamente) têm sido utilizados em preparações mais reduzidos, e a constatação de que os estímulos gerar movimentos fisiológicos confere credibilidade à sua utilização em outras configurações. Por outro lado, para gerar padrões de deglutição, combinamos um estímulo artificial (carbacol) com um estímulo alimento natural (uma tira de algas), que não podia ser aplicada aos gânglios isolado. Observamos, também, que os padrões neurais na massa suspensa bucal parecem ser mais semelhante a dos padrões in vivo do que os padrões obtidos em preparações mais reduzidas, o que sugere feedback sensorial pode ser importante na formação dos padrões da CPG. Por exemplo, o motor programas em grupo isoladolia normalmente são várias vezes mais do que os programas de duração do motor em animais intactos, enquanto os programas a motor na massa suspensa bucal são tipicamente muito mais perto de duração de programas motores em animais intactos (dados não publicados). Uma outra vantagem da massa suspensa bucal é de que lado simultânea e uma vista de frente do aparelho de alimentação pode ser obtida. A vista frontal fornece uma vista semelhante da boca à que deveria ser observado in vivo, ao mesmo tempo que permite uma melhor observação da contracção dos músculos do maxilar. A vista lateral permite a observação de contrações musculares vestibular e do movimento para frente e para trás da pinça por baixo dos músculos, tornando-o mais fácil de entender alterações biomecânicas durante os diferentes comportamentos.
Nesta preparação, que tenham gravado a partir de até cinco nervos (nervo radular e bilateral dos nervos bucais 2 e 3) e do músculo I2 simultaneamente, e colocou-se a mais de dois eléctrodos extracelulares identificadosas células nervosas do gânglio. Seria possível gravar de nervos adicionais e / ou músculos, se o experimentador desejado. Também seria possível estimular e gravar a partir de neurónios do gânglio cerebral, o que poderia dar-se o conhecimento sobre a estimulação de interneurónios cerebrais bucais, uma técnica comum 17,19, induz programas motores semelhantes ao comportamento in vivo. Embora isso aumenta a dificuldade técnica de preparação, a perfusão da artéria bucal 15 pode permitir a preparação de gerar comportamentos mais fortes e mais duradoura (observações não publicadas).
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo NIH concessão NS047073 e concessão do NSF DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
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