Summary
Descriviamo una tecnica per la registrazione extracellulare e stimolare di nervi, muscoli e singoli neuroni identificati
Abstract
Multifunzionalità, la capacità di una struttura periferica per generare più comportamenti distinti, 1, permette animali di adattarsi rapidamente loro comportamenti ai cambiamenti ambientali. Il mollusco marino Aplysia californica fornisce un sistema trattabili per lo studio della multifunzionalità. Durante l'alimentazione, Aplysia genera diversi tipi distinti di comportamenti con la stessa apparecchiatura di alimentazione, la massa buccale. I gangli che controllano questi comportamenti contengono una serie di grandi neuroni identificati che sono accessibili per lo studio elettrofisiologico. L'attività di questi neuroni è stato descritto in programmi motori che possono essere divisi in due tipi, programmi e ingestive egestive, basato sui tempi delle attività neurale che chiude la relativa grasper cibo all'attività neurale che protrae o indietro la pinza 2. Tuttavia, in gangli isolato, i movimenti muscolari che producono tali comportamenti sono assenti, rendendodifficile essere certi se i programmi motori osservati sono correlati di comportamenti reali. In registrazioni vivo, nervose e muscolari sono stati ottenuti corrispondente a programmi di alimentazione 2,3,4, ma è molto difficile registrare direttamente da singoli neuroni 5. Inoltre, in vivo, programmi ingestive può essere ulteriormente suddiviso in morsi e 1,2 rondini, una distinzione che è difficile fare in precedenza descritto più in preparati in vitro.
La preparazione massa sospesa buccale (Figura 1) colma il divario tra gangli isolati e animali intatti. In questa preparazione, comportamenti ingestive - compresi sia mordere e deglutizione - e comportamenti egestive (rifiuto) possono essere provocati, al tempo stesso neuroni individuali possono essere registrati da e stimolati con elettrodi extracellulari 6. I movimenti di alimentazione associati a questi comportamenti differenti possono essere regiDED, quantificati e direttamente collegati ai programmi motori. I programmi del motore per la preparazione massa sospesa buccale sembrano essere più simili a quelle osservate in vivo che sono programmi motori suscitato nei gangli isolato. Pertanto, i programmi motori di questa preparazione può essere più direttamente collegate al comportamento in vivo, al tempo stesso, i singoli neuroni sono più accessibili a registrazione e stimolazione che in animali intatti. Inoltre, come fase intermedia tra gangli isolati e animali intatti, risultati della massa sospesa buccale può aiutare nella interpretazione dei dati ottenuti in ambienti sia più ridotte e più intatta. La preparazione massa sospesa buccale è uno strumento utile per caratterizzare il controllo neurale della multifunzionalità in Aplysia.
Protocol
1. Preparazione di soluzioni
- Per preparare una soluzione di cloruro di magnesio che è isotonica di acqua di mare in cui sono tenuti gli animali (~ 1000 millosmolar), segnare una grande brocca al livello del volume desiderato. Riempire la caraffa con acqua distillata a circa l'80% di questo livello, e pesare la giusta quantità di cloruro di magnesio esaidrato per creare una soluzione 333 mM nel volume finale. Aggiungere il cloruro di magnesio per la brocca, chiudere il coperchio e agitare vigorosamente fino a che il cloruro di magnesio è completamente sciolto, quindi aggiungere acqua distillata fino al volume finale è raggiunto.
- Per preparare salina Aplysia, nuovamente segnare una grande brocca al livello del volume desiderato, e riempire con acqua distillata a circa il 80% di questo livello. Posizionare la caraffa su un piatto mescolare, mettere un ancoretta nel boccale, e accendere il piatto mescolare.
- Uno dopo l'altro, pesare e aggiungere la brocca per l'importo adeguato delle seguenti sostanze per creare questi concentrazioni nel volume finale: 460 mM cloruro di sodio, cloruro di potassio 10 mM, 22 mM di cloruro di magnesio esaidrato, 33 mM di solfato di magnesio eptaidrato, 10 mM di cloruro di calcio diidrato, 10 mM di glucosio, 10 mM MOPS.
- Una volta che i soluti sono completamente sciolto, utilizzare un misuratore di pH per misurare il pH della soluzione. Lentamente aggiungere 1 M di idrossido di sodio per portare il pH ad un valore finale di 7,5. Se si aggiunge accidentalmente idrossido di sodio troppo, è possibile aggiungere 1 M di acido cloridrico per abbassare il pH.
- Aggiungere acqua distillata fino al volume finale è raggiunta.
- Per rallentare la crescita batterica, soluzioni di conservare in frigorifero fino al momento per un esperimento. Si noti che la temperatura può influire programmi motori Aplysia. Non monitorare con attenzione la temperatura, ma al termine dell'installazione, i preparativi sono in genere la temperatura ambiente vicino.
2. Preparazione del piatto di registrazione
- Durante l'esperimento, la massa buccale saranno sospesi in soluzione inun tondo 100 mm (diametro) x 50 mm (altezza) pirofila. Questo piatto dovrebbe avere una camera anteriore per la massa buccale, una stretta piattaforma centrale sopraelevata in cui sono riposte gangli buccale sulla Sylgard, e un separato, camera posteriore elevata in cui è isolato il ganglio cerebrale. Una tacca nella Sylgard dovrebbe collegare la piattaforma buccale gangli alla camera ganglio cerebrale. Vedi Figura 1, facendo riferimento alle dimensioni specificate chiave nel costruire il piatto.
- Per creare questo piatto, iniziare con un giro 100 x 50 millimetri piatto di pyrex. Preparare Sylgard seguendo le istruzioni fornite con il prodotto. Costruzione del piatto richiederà versa Sylgard diversi, tra cui il Sylgard deve essere permesso impostare.
- La colata prima è creare il massimo livello di Sylgard nel piatto, la parete tra le camere buccali e cerebrale (vedere Figura 1). Bloccare questa porzione del piatto dalle altre sezioni. Plastilina può essere utilizzato per costruirepareti per bloccando le sezioni. Per una parete piana, un pezzo di cartone può essere utilizzato, con un supporto di plastilina. Per una parete curva (che riduce la dimensione della camera contenente il ganglio cerebrale), utilizzare plastilina solo come base per la parete. Rivestire le pareti di involucro di plastica dove potranno contattare la Sylgard per una più facile rimozione.
- Una volta che lo spazio per la parete tra le camere buccali e cerebrale è stata bloccata come descritto in 2.3, assicurando la tenuta stagna ai bordi per minimizzare le perdite, versare Sylgard in questo spazio quasi fino alla parte superiore del piatto. Lasciare indurire Sylgard durante la notte, e assicurarsi che sia completamente impostata prima di continuare. Mettere il piatto in un luogo caldo indurrà più veloce impostazione.
- Successivamente, la piattaforma gangli buccale e camera di ganglio cerebrale deve essere versato (di nuovo, fare riferimento alla figura 1, che mostra le posizioni di questi gangli nel piatto completata). Rimuovere le mura precedenti di blocco, e creare un nuovo muro di unposizione 0,5 cm dalla parete piana Sylgard della sezione centrale per bloccare la piattaforma buccale gangli. Non pareti sono necessarie per creare la camera posteriore che terrà il ganglio cerebrale. Versare Sylgard in entrambe le sezioni fino ad un'altezza di circa 3 mm al di sotto del livello superiore. La camera cerebrale dovrebbe essere leggermente inferiore alla piattaforma gangli buccale. Anche in questo caso, lasciare che il Sylgard set durante la notte.
- Infine, versare la camera anteriore (cioè, la camera in cui la massa buccale sarà sospeso). Non sono necessarie le pareti. Versare all'altezza appropriata come specificato in Figura 1.
- Il passo finale è quello di tagliare una tacca il collegamento della piattaforma buccale gangli e la camera cerebrale. La profondità della tacca deve essere uguale al livello della piattaforma gangli buccale. Una lama di bisturi può essere usato per tagliare la tacca. Figura 1 illustra il piatto completato.
3. Elettrodo Preparazione
- Tirare e extracellularelectrodes da singolo a canna capillare di vetro con un Flaming-Brown micropipetta estrattore. Diametro interno degli elettrodi deve essere di circa 40 pm e le loro resistenze dovrebbe essere di circa 0,1 MW. Con il filamento FT345B nella estrattore, le nostre tipiche impostazioni del programma estrattore di calore sono 480, Pull 50, Vel 13, e ora 20, ma si noti che le impostazioni sarà diverso per i diversi filamenti. Questo programma crea gli elettrodi in una singola estrazione senza fuoco lucidatura stadio. Prima di iniziare un esperimento, recupero gli elettrodi extracellulari con Aplysia salina.
- Creare elettrodi gancio per nervo e muscolo registrazione 2 seguendo un protocollo analogo a quello descritto da Cullins Chiel e 4, tranne che singoli elettrodi non devono essere avvolto intorno all'altro. I passi per la creazione di questi elettrodi seguire 3,3-3,13.
- Tagliare un pezzo di smalto-rivestiti, 0,001 pollici di diametro del filo in acciaio inox per una lunghezza di circa 60 cm. Allegare una palla di plastilinaa ciascuna estremità del filo, tenere il filo in aria al suo punto medio, e girare le due palline di argilla intorno a vicenda per avvolgere i fili intorno all'altra (questo riduce transienti capacitivi).
- Tenere le due estremità del filo insieme unendo le due palline di argilla in una palla, nastro e l'altra estremità del filo di sospendere il filo.
- Rivestire l'intera lunghezza del filo di colla famiglia silicone mettendo un poco di colla sul pollice, toccando il pollice e l'indice insieme sul filo, e nel loro impiego in rete. Lasciate asciugare la colla durante la notte.
- Dopo la colla asciuga, posizionare il filo su una superficie piana sotto un microscopio binoculare dissezione. Tagliare l'estremità del filo che era precedentemente mezzo, con conseguente due distinti fili intrecciati insieme. Questo è un elettrodo differenziale.
- Utilizzare nastro per tenere una delle estremità del elettrodo in posizione. Utilizzando pinze per togliere la colla e smalto, preparare entrambi i fili ad una estremità ad avere circa 2 cm of senza cavi con circa 1 cm di cavo spelato di smalto. Saldare un connettore oro a ciascuno dei fili, e lab nastro posto attorno ai perni tenerli separati.
- All'altra estremità dell'elettrodo, preparare i fili di avere circa 3 mm di filo libero. Rimuovere lo smalto dalle ultime circa 1 mm di un filo, e piegare il filo indietro e fuori del modo. Questo è il filo di riferimento. È fondamentale che i due fili non hanno filo nudo toccano.
- Rimuovere lo smalto da altro filo fino alla colla di silicone. Torcere questo filo in un gancio e tagliarla ad una lunghezza di circa 1 mm. Questo gancio si allega al nervo o muscolo. Utilizzando un gancio corto fornisce maggiore stabilità quando il nervo è collegato all'elettrodo.
- Utilizzare un multimetro per verificare che l'elettrodo sia ben costruito e intatto. Un connettore oro dovrebbe avere una lettura di resistenza di circa 200-500 ohm rispetto alla punta di un filo, e l'altro oro collegareo dovrebbe avere una lettura simile rispetto all'altro filo.
- Se non c'è una connessione intatta su un cavo, può essere possibile ri-striscia la estremità del filo e di ri-saldare uno o entrambi i connettori oro per creare queste connessioni. Se entrambi i connettori oro hanno connessioni con entrambi i fili, l'elettrodo può avere due fili nudi fare contatto. Può essere possibile fissare l'altra estremità per eliminare questo problema, altrimenti, l'elettrodo deve essere scartato.
- Ripetere questa procedura per come elettrodi quanti sono necessari per l'esperimento. Elettrodi gancio può essere riutilizzato da esperimento a esperimento tagliando la fine che attaccato al nervo e creare nuovi ganci, finché il filo diventa troppo breve dopo molti usi. Ogni volta che questo è fatto, utilizzare il multimetro per verificare che l'elettrodo sia intatto.
- Per tenere traccia dei diversi elettrodi durante gli esperimenti, elettrodi etichette e relativi cavi. Utilizzando colori diversi di nastro di laboratorio è utile.
- Scegli un animale sano di circa 200-300 g di peso. Quando viene presentato con alghe, l'animale deve produrre morsi con protractions forti a intervalli regolari di 3-5 sec.
- Posizionare l'animale in un vassoio dissezione e anestetizzare iniettando circa il 50% di soluzione isotonica di cloruro di magnesio peso corporeo. Effettuare la prima iniezione con la siringa a circa 15 a 30 gradi, vicino al centro e verso la coda dell'animale. Dopo l'iniezione, massaggiare delicatamente la superficie dell'animale per diffondere il cloruro di magnesio. Effettuare iniezioni addizionali come necessario con la siringa rivolta verso la testa dell'animale.
- Dopo che l'animale non risponde a stimoli tattili dolci, pin l'animale sul lato vassoio, dorsale fino, con un pin in coda e un pin per ogni tentacolo anteriore.
- Utilizzare pinze per stringere e sollevare la pelle dell'animale al centro della testa, dietro i rinofori. Make una incisione coronale attraverso la testa dell'animale, appena dietro il punto in corso. Poi fare un'incisione sagittale mediano andando avanti tra i rinofori verso la bocca, esponendo la massa buccale.
- Usare pinze per tirare il lembo di pelle più vicino a te lontano dalla massa buccale, e tagliare i nervi e tessuto connettivo che si attaccano alla parete del corpo di separare completamente questo lembo di pelle dalla massa buccale. Fare attenzione a non tagliare i nervi o tessuto intrinseca alla massa buccale.
- Usare pinze per afferrare e tenere l'esofago. Tagliare la parte posteriore esofago, fino al punto che si terrà. Sollevare l'esofago per sollevare la massa buccale come i tagli sono apportate le seguenti.
- Dietro la massa buccale, il cerebrale, pleurico, e gangli forma pedale un anello, con il ganglio cerebrale collegato ai gangli vestibolare dai cerebrale-vestibolari connettivi (CBC). Lasciare questi gangli anello collegato alla massa buccale, e tagliare tutti i nervi sporgenti da questi gangli ad altre partiil corpo.
- Tagliare il tessuto connettivo attorno alla massa buccale, continuando a sollevare la massa fino buccale quanto diventa meno collegato al corpo. Una volta che la massa buccale è solo attaccato alla bocca, l'esofago e la massa buccale dovrebbero tenersi verso l'alto.
- Effettuare un taglio finale appena anteriormente alle ganasce per liberare la massa buccale dal corpo. Posizionare la massa buccale in una soluzione di 50% soluzione isotonica di cloruro di magnesio e 50% soluzione salina Aplysia per mantenere anesthetization parziale mentre elettrodi sono collegati.
- Posizionare la massa buccale, con la soluzione, in una piastra di Petri con fondo Sylgard. Rimuovere i gangli pleurico e pedale, tagliando i loro collegamenti con il ganglio cerebrale. Lasciare il ganglio cerebrale collegato ai gangli vestibolare e la massa buccale tramite i cerebrale-vestibolari connettivi (CBC), tagliare gli altri collegamenti tra il ganglio cerebrale e massa buccale. Tagliare l'esofago e ghiandole salivari di piccoli tronchi in modo che non get in mezzo.
5. Hook elettrodo Allegato
- Per la registrazione e la stimolazione, elettrodi gancio può essere attribuita ad una serie di diversi nervi e muscoli, come appropriato per l'esperimento (Figura 2).
- Per caratterizzare schemi come dimostrato in vivo da Cullins Chiel e 4, collegare elettrodi al nervo radular I2, il muscolo e nervi vestibolari 2 e 3. Insieme, queste registrazioni mostrano l'attività dei motoneuroni per i muscoli principali intrinseci alla massa buccale 3,7,8, ea consentire l'identificazione della fase di protrazione dalla registrazione I2 3, la fase di retrazione dai nervi buccale 2 e 3 registrazioni 2 , 5,8, e la tempistica di chiusura del grasper cibo dal 2 radular registrazione del nervo. Collegare un elettrodo supplementare gancio al ramo una di 2 nervo vestibolare per la stimolazione pattern. Fissaggio di elettrodi segue una procedura analoga a quella dimoEd. by Cullins Chiel e 4, ed è descritto nella seguente procedura.
- Per ciascun allegato elettrodo, posizionare l'elettrodo su un manipolatore grossolana. Per il manipolatore, il nastro di un bastone di legno con un coccodrillo sulla sua estremità e utilizzare la clip per tenere l'estremità dell'elettrodo. La clip deve allegare alla siliconata sezione dell'elettrodo, circa 1 cm prima della fine del rivestimento siliconico. Utilizzare il manipolatore per posizionare l'elettrodo gancio vicino alla massa buccale.
- Con la massa sul lato buccale e disposta contro il lato del piatto per la stabilità, iniziare con il nervo radular, che presenta l'attacco elettrodo più difficile. Ci sono due opzioni per l'accesso a questo nervo.
- I progetti nervose radular da sotto il ganglio vestibolare e va sotto il muscolo I2 in due rami. In primo luogo, verificare se il nervo radular si può accedere senza tagliare il muscolo. Spingere delicatamente da parte la guaina bianca allegando i gangli vestibolare al muscolo I2; do non tagliare questa guaina. Se il nervo è accessibile, utilizzare pinze con la punta piegata in un gancio per sollevare un ramo del nervo.
- Se il nervo radular non è accessibile in questo modo, una seconda opzione è quella di individuare il nervo sotto il muscolo sottile I2, e fare una piccola incisione I2 per esporre il nervo. Questa incisione dovrebbe passare attraverso due strati di muscoli. Utilizzare le pinze a gancio per tirare un ramo del nervo radular da sotto il muscolo.
- Utilizzare il manipolatore per posizionare gancio dell'elettrodo accanto al nervo. Per posizionare il nervo nel gancio, è utile tenere il nervo nelle pinze uncinate mentre simultaneamente utilizzando un altro paio di pinze per creare una separazione tra le due metà del nervo in corso.
- Dopo il nervo è saldamente il gancio, utilizzare il manipolatore per sollevare il nervo dalla massa buccale finché è tesa, ma non sforzatevi.
- Prendete un Kimwipe e strettamente girare un angolo in modo da formare uno stoppino piccolo. Utilizzare questo stoppino per asciugare laestremità dell'elettrodo e la sezione del nervo che è agganciato.
- Utilizzare un altro insieme di curve-punta pinza per applicare un poco di colla rapida Gel super per il nervo agganciato. Iniziare l'applicazione in corrispondenza del punto di contatto tra filo e del nervo. Assicurarsi che il gancio è completamente coperto con colla, e che la punta del filo di riferimento non è coperto con colla (Figura 3).
- Utilizzare una siringa con un allegato tubo di polietilene ad applicare la soluzione dal piatto sulla colla, che indurrà la superficie della colla per impostare. Assicurarsi di bagnare completamente la colla con soluzione per garantire che la colla imposta correttamente.
- Utilizzare il manipolatore per rilasciare la tensione sul nervo, e quindi rilasciare l'elettrodo dalla clip. Questo completa la procedura di collegamento di un elettrodo gancio.
- La I2 elettrodo muscolo deve essere allegata prossimo. Abbiamo registrare l'attività EMG del muscolo I2, piuttosto che dalla sua attività ENG nervi innervano perché il nervo I2 è molto small e di difficile accesso in una massa intatta buccale. Vicino nervo vestibolare 2, utilizzare le pinze uncinate per sollevare una o due fasce del muscolo I2, e utilizzare un altro paio di pinze per separarli dal resto del muscolo. La porzione di I2 separato dovrebbe essere simile in spessore per nervo vestibolare 2 o 3. Fare attenzione a non più di gestione separata (che può denervate il muscolo). Applicare elettrodo gancio con la stessa procedura utilizzata per il nervo radular.
- L'elettrodo accanto a fissare è che per un ramo del nervo vestibolare 2. Questo ramo può essere stimolati elettricamente per indurre programmi motori 9. Prima del nervo vestibolare 2 va sotto il muscolo I1 alla scanalatura laterale, il nervo trifurcates, un ramo è il primo ramo di scindere. I rami sono abbastanza piccole, in modo che il fissaggio dell'elettrodo deve essere fatto con cura. Seguire la stessa procedura per collegare l'elettrodo.
- Nervi vestibolari 2 e 3 sono facilmente accessibili. Seguire la stessa procedura, allegando gli elettrodielettrodi o meno a metà strada tra il ganglio vestibolare e la scanalatura laterale.
- Per distinguere neuroni con proiezioni unilaterali vs bilaterale, è anche utile per collegare gli elettrodi ai nervi vestibolari 2 e 3 sul lato della massa buccale, nonché nervo vestibolare 2 un ramo, perché alcuni neuroni rispondono differentemente alle vs ipsilaterale . controlaterale BN2-una stimolazione.
6. Posizionamento del Ganglion e assottigliamento della guaina
- La massa buccale verrà spostato alla fase 100 x 50 millimetri piatto Pyrex descritto nella sezione 2. Vedere la Figura 1.
- Applicare uno strato sottile di grasso per vuoto alla tacca tra le camere cerebrali e vestibolare, con una punta di pipetta per raccogliere un poco di grasso per vuoto e stenderlo sopra la tacca. Abbiamo trovato che il grasso per vuoto riduce perdite meglio di vaselina. Riempire la camera anteriore con soluzione salina Aplysia. Spostare con attenzione la massa buccale dalla capsula di Petri alla chamb anterioreer di questo piatto più grande, facendo in modo che nessuno degli elettrodi sono tirata, che potrebbe rompere i nervi.
- Se il piatto deve essere trasferito in un altro microscopio binoculare da dissezione per diluire la guaina, essere molto attenti con gli elettrodi gancio. Gruppo elettrodi su un lato della massa buccale insieme, e anche del gruppo di elettrodi sul lato della massa buccale insieme. Afferrare con attenzione gli elettrodi afferrando il nastro laboratorio che copre i pin del connettore, ancora una volta facendo in modo che nessuno degli elettrodi sono tirata.
- Quando il piatto è posizionato sotto il microscopio, gli elettrodi devono essere drappeggiato delicatamente sopra i lati del piatto e di riposo sulla piattaforma accanto al piatto.
- Durante le pause e tra le fasi dell'esperimento, aerare la soluzione salina nella camera di massa buccale con una pietra porosa acquario.
- Pin il ganglio cerebrale nella parte posteriore con le cerebro-vestibolari connettivi (CBC) che attraversano la tacca. Applicare il vuoto più grease sulle CBC, quindi aggiungere salina Aplysia più per entrambe le parti del piatto, in modo gangli sono completamente sommerse. Assicurare che la quantità di grasso per vuoto aggiunto è superiore al livello di soluzione salina in né delle camere cerebrali o buccale quindi non si verificano perdite tra le camere. In questa fase, la massa buccale deve poggiare sul fondo della camera anteriore per non tirare con troppa forza sui nervi e gangli.
- Pin i gangli vestibolare sulla piattaforma centrale. Per evitare di danneggiare i nervi che sono ancora attaccati alla massa buccale, solo posizionare i perni sulla guaina tra due nervi. Aggiungere due perni più sul lato delle CBC per allungare e ancorarle.
- Tenere il piatto buccale gangli o ruotato in base alla posizione dei neuroni di interesse. Per ruotare il ganglio vestibolare, utilizzare una pinza sottile da acchiappare guaina superiore al CBC e il pin verso il basso tra i nervi vestibolari 2 e 3. Poi la maggior parte dei corpi cellulari che sono in prossimità della camera posteriore e non può essere facilly accessibile dalla parte superiore del ganglio vestibolare può essere visto. Infine, aggiungere due perni sulla guaina del ganglio vestibolare prossimità del lato buccale massa per minimizzare il movimento del ganglio vestibolare. Vedere la Figura 4.
- Utilizzare una pinza sottile per afferrare la guaina del ganglio vestibolare in prossimità della camera posteriore, e poi tagliare la guaina in eccesso con le forbici sottili senza esporre i corpi cellulari. Al fine di minimizzare i danni, rimuovere solo la quantità di guaina necessario vedere i corpi cellulari.
7. Stimolazione e registrazione
- Dopo aver sfoltito della guaina è stata completata, allegare tutti gli elettrodi alle loro prese sui cavi che collegano agli amplificatori. Anche in questo caso, assicurarsi che gli elettrodi non sono tirata mentre si fa questo. Assicurarsi che gli elettrodi siano correttamente attaccati ai loro cavi appropriati e che le polarità siano corrette.
- Per lavare ogni residuo di cloruro di magnesio, sostituire il Aplysiuna soluzione salina nella camera massa buccale con soluzione salina Aplysia fresca.
- Infilare una sutura di seta attraverso il tessuto molle nella parte anteriore della massa buccale, anterodorsal alla cartilagine mandibola, e utilizzare due pezzi di plastilina per fissare la sutura al bordo del piatto, così sospendendo la massa buccale dalla sua estremità anteriore. Si noti che l'estremità posteriore è sospesa dai nervi vestibolari collegati ai gangli buccale.
- Posizionare un manipolatore in possesso di un elettrodo extracellulare di vetro in modo che la punta dell'elettrodo è vicino al ganglio vestibolare.
- Per individuare e identificare un neurone, utilizzare il manipolatore per premere delicatamente la punta dell'elettrodo extracellulare giù sulla guaina sul soma neurone (Figura 5). Applicare una corrente stimolante, e quindi passare il canale che viene utilizzato per eccitare la soma di modalità di registrazione per registrare l'attività sull'elettrodo extracellulare e corrispondente attività sui nervi (Figura 6). Fare riferimentoalle mappe e le descrizioni pubblicate gangliari neuroni, comprese le proiezioni nervose e muscolari, innervazioni (ad esempio 7,8) per l'aiuto nella identificazione dei neuroni.
- Per la registrazione video dei programmi di alimentazione, posizione specchio al lato del piatto in modo che le viste frontale e laterale della massa buccale può essere vista contemporaneamente (posizione dello specchio è illustrato schematicamente in figura 1). Posizionare una videocamera con entrambe le viste frontale e laterale nel suo campo visivo.
- Le registrazioni video ed elettrofisiologiche possono essere sincronizzati con l'invio di un impulso TTL sia ad un timer elettronico in vista della fotocamera e di un canale in AxoGraph, il programma informatico utilizzato per registrare e analizzare i dati elettrofisiologici. Questo impulsi fornisce un punto di tempo che è esattamente la stessa nelle registrazioni AxoGraph e video, in base al quale i file possono essere sincronizzati.
- Dopo un neurone si trova, la sua attività può essere registrato in diversi alimenti come i comportamenti, che can essere provocato come descritto di seguito.
- Per indurre il rigetto-come programmi motori, stimolare BN2-a con un lungo strascico di 2 Hz, 1 msec impulsi 9 (la nostra esperienza è che questa stimolazione genera affidabile modelli egestive in questo contesto). Patterns continua per tutta la durata della stimolazione e può continuare fino a poco dopo la stimolazione è finita.
- Per indurre mordere-come programmi motori 12, posizionare alcuni cristalli di carbacolo solido direttamente sul ganglio cerebrale. Alternativamente, se un livello controllato di esposizione carbacolo è necessario utilizzare una soluzione di tra 1 e 10 mM carbacolo in Aplysia salina. Concentrazioni maggiori hanno maggiori probabilità di produrre risposte. Motivi ripetitivi inizia in genere entro 5 minuti, e durano circa 10 a 15 minuti prima di iniziare a correre giù.
- Per ingerire nulla simile a programmi motori 13, si applicano carbacolo, e attendere fino a quando la massa buccale genera morsi forti. Poi, durante un morso, mettere una strisciadi alghe (laver essiccato) in bocca dell'animale in modo che la radula afferra l'alga (Figura 7). Strisce sono di solito 0,5 centimetri di larghezza e di lunghezza di 5 cm.
- Dopo la prima serie di carbacolo indotte modelli, è spesso possibile ottenere ulteriori risposte carbacolo. Lavare accuratamente la salina Aplysia nella camera ganglio cerebrale, rimozione e sostituzione della soluzione salina almeno tre volte. Attendere almeno 20 minuti prima di applicare carbacolo nuovo. In attesa fino a 40 minuti possono dare risultati più affidabili.
In questo momento negli Stati Uniti, animali invertebrati non richiedono l'approvazione formale da parte di un uso animale istituzionale e commissione cura. Tuttavia, ci siamo assicurati che tutti i trattamenti di Aplysia minimizzare i danni e sofferenze agli animali, e che tutte le dissezioni sono fatto mentre l'animale è completamente anestetizzato.
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Discussion
Il lavoro precedente ha caratterizzato Aplysia programmi motori in intatta di un animale e nelle preparazioni ridotto come gangli isolato. Nell'animale intatto, anche se le registrazioni di singoli neuroni sono stati ottenuti 5, tali esperimenti sono molto difficili, e gli elettrodi non può essere spostato da neurone a neurone durante l'alimentazione. In gangli isolato, i movimenti alimentazione indotte da attività neurale non può essere osservato. La preparazione massa sospesa buccale colma il divario tra questi due estremi.
Altre preparazioni semi-intatte sono state utilizzate in studi precedenti, ma la preparazione massa sospesa buccale ha vantaggi significativi. In un semi-intatte preparazione, le labbra e massa buccale erano ancora attaccate, ma la preparazione è troppo ridotta per movimenti alimentazione completi da osservare 14. Una testa di alimentazione preparazione 15,16 osservazione ha permesso di alimentare i movimenti in vitro. Tuttavia, thsta alimentando la preparazione testa era più complicato da impostare rispetto alla massa sospesa boccale descritta qui, e solo a condizione di accesso ai singoli neuroni del ganglio cerebrale non, nel ganglio vestibolare. Vi è un vantaggio per la preparazione testa di alimentazione, in cui la presenza delle labbra e tentacoli anteriore permesso la generazione di pattern mordere mediante uno stimolo naturale, applicazione di alghe. Anche se sarebbe rendere l'esperimento più difficile, può essere possibile combinare i preparativi, lasciando le labbra attaccate alla massa buccale mentre anche pinning gangli buccale di accesso ai singoli neuroni.
Schema alimentare in Aplysia possono essere classificati come ingestive o egestive basato sul calendario di attività sul nervo radular, che chiude la pinza alimentare, rispetto alla protrazione e retrazione dei programmi fasi motore. Se l'attività nervosa radular avviene contemporaneamente alla fase di retrazione, i modelli sono ingestive, perché la pinza si chiude e rientro nel tentativo di tirare il cibo nella cavità orale. Se l'attività nervosa radular si verifica durante la fase di protrazione, modelli sono egestive, perché la pinza si chiude e prolungando per spingere fuori il materiale 2 cavità boccale.
Modelli Ingestive può essere divisa in almeno due distinti sottotipi: mordere, tenta di afferrare il cibo, e deglutizione, trasporto di 1,2 alimenti già afferrato. Tuttavia, la maggior parte del lavoro in vitro (es. 14,17,18) si è concentrata solo sul ingestione / egestion dicotomia, non il tentativo di distinguere mordere per ingestione. Due studi 16,19 hanno classificato in modelli in vitro ingestive in gruppi simili a mordere e la deglutizione-like. Nel primo di questi studi, i modelli sono stati osservati nei gangli isolato; se i movimenti alimentazione associate della massa buccale può essere osservato, questo rafforzerebbe l'argomento che lamodelli di sé rappresentano il morso e deglutizione visto in vivo. Nel secondo studio, i modelli sono stati osservati in una preparazione testa di alimentazione, così schemi sono stati classificati in base a movimenti osservati, ma non registrazioni di neuroni gangliari buccali sono stati ottenuti.
La preparazione massa sospesa buccale fornisce un modo per osservare tutti e tre i tipi di comportamenti - mordere, deglutire e rifiuto - e contemporaneamente la registrazione dell'attività dai principali nervi vestibolari e muscoli, e stimolante e la registrazione di singoli neuroni. La tecnica neurone extracellulare 6 è un altro passo avanti fondamentale in questa preparazione, perché i forti alimenti come i movimenti hanno suscitato quasi certamente rimuovere un elettrodo intracellulare. Con le registrazioni extracellulari di singoli neuroni, i tempi di attività questi neuroni durante i programmi del motore può essere accertata quando questo sarebbe stato difficile con le registrazioni del nervo solo, perché molte diverse unità sono firing simultaneamente.
Abbiamo osservato che i movimenti di alimentazione in massa sospesa buccale sembrano qualitativamente simili a quelle osservate in vivo. È importante sottolineare che gli stimoli utilizzati per generare modelli di mordere e di rifiuto (carbacolo e vestibolare del nervo 2 ramo una stimolazione, rispettivamente) sono stati utilizzati in preparazioni più ridotti, e la nostra ricerca che gli stimoli generano movimenti fisiologici conferisce credibilità al loro utilizzo in altri contesti. Per contro, per generare deglutizione, abbiamo combinato uno stimolo artificiale (carbacolo) con uno stimolo alimento naturale (striscia alghe) che non può essere applicata ai gangli isolato. Abbiamo anche osservato che i modelli neurali nella massa sospesa buccale sembrano essere più simile a modelli in vivo che sono modelli ottenuti in preparazioni più ridotte, suggerendo feedback sensoriale può essere importante nel modellare i modelli dal CPG. Per esempio, i programmi motori in gruppo isolatolia sono in genere diverse volte più a lungo in durata di programmi motori in animali intatti, mentre i programmi a motore nella massa sospesa buccale sono in genere molto più vicino alla durata di programmi motori in animali intatti (dati non pubblicati). Un altro vantaggio della massa sospesa buccale è quel lato simultanea e viste frontali del dispositivo di alimentazione può essere ottenuto. La vista frontale fornisce una vista simile della bocca a quello che sarebbe stato visto in vivo, pur consentendo una migliore osservazione della contrazione muscolare mascella. La vista laterale permette l'osservazione di contrazioni muscolari buccali e il movimento in avanti e all'indietro del prendicapezzolo sotto i muscoli, rendendo più facile capire variazioni biomeccaniche durante i diversi comportamenti.
In questa preparazione, abbiamo registrato da cinque nervi (nervo radular e bilaterali nervi vestibolari 2 e 3) e la I2 muscolari contemporaneamente, e posto fino a due elettrodi extracellulari oltre identificatocellule nervose del ganglio. Sarebbe possibile registrare da nervi aggiuntivi e / o muscoli, se lo sperimentatore desiderato. Sarebbe anche possibile stimolare e registrare da neuroni del ganglio cerebrale quale potrebbe capire se la stimolazione della cerebrali interneuroni buccali, una tecnica comune 17,19, induce programmi motori simili per comportamento in vivo. Sebbene questo modo aumenta la difficoltà tecnica della preparazione, perfusione dell'arteria buccale 15 potrebbe consentire la preparazione di generare comportamenti più forte e più duratura (osservazioni non pubblicate).
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH e NSF NS047073 concessione DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
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