Summary

En<em> In Vitro</em> Forberedelse til å få fram og ta Feeding Motor programmer med Fysiologiske Bevegelser i<em> Aplysia californica</em

Published: December 05, 2012
doi:

Summary

Vi beskriver en teknikk for å ekstracellulært registrere og stimulere fra nerver, muskler og individuelle identifiserte nevroner<em> In vitro</em> Mens fremlokkende og observere forskjellige mate atferd i foringsområdet anordningen<em> Aplysia</em>.

Abstract

Multifunksjonalitet, evne til en perifer struktur til å generere flere, forskjellige atferd 1, lar dyrene raskt tilpasse sin atferd til skiftende miljøer. Den marine mollusk Aplysia californica gir en medgjørlig system for studiet av multifunksjonalitet. Under fôring, genererer Aplysia flere forskjellige typer atferd som bruker samme fôring apparat, bukkale masse. Ganglia som styrer disse atferd inneholder en rekke store, identifiserte nevroner som er tilgjengelige for elektrofysiologisk undersøkelse. Aktiviteten av disse nevronene har blitt beskrevet i motor-programmer som kan deles inn i to typer, ingestive og egestive programmer, basert på tidspunktet for nevral aktivitet som lukker mat grasper forhold til den nevrale aktiviteten som protracts eller trekkes inn i grasper 2. Men i isolerte ganglia, muskel bevegelser som ville produsere disse atferd er fraværende, noe som gjør detvanskeligere å være sikker på om motoren programmene observert er korrelater av virkelige oppførsel. In vivo, nerve-og muskel opptak er oppnådd tilsvarende ernæringsprosjekter 2,3,4, men det er svært vanskelig å direkte opp fra individuelle nevroner 5. I tillegg, in vivo, kan ingestive programmer deles i biter og svelger 1,2, en utmerkelse som er vanskelig å få i de fleste tidligere beskrevet i vitro preparater.

Den suspenderte buccal masse forberedelse (figur 1) bygger bro mellom isolerte ganglia og intakte dyr. I dette preparatet, ingestive atferd – inkludert både biting og svelging – kan og egestive atferd (avslag) fremkalles, samtidig som enkelte nerveceller kan registreres fra og stimulert ved hjelp ekstracellulære elektroder 6. Fôring bevegelser knyttet til disse forskjellige virkemåter kan være registded, kvantifisert, og direkte relatert til de motoriske programmer. Motoren programmer i suspendert buccal masse forberedelser ser ut til å være mer lik det som ble observert in vivo enn det motoriske programmer oppnår isolert ganglier. Således kan motoren programmene i dette preparatet være mer direkte relatert til in vivo atferd, på samme tid, individuelle nevroner er mer tilgjengelig for opptak og stimulering enn i intakte dyr. I tillegg, som et mellomliggende trinn mellom isolerte ganglia og intakte dyr, funn fra suspendert buccal masse kan hjelpe tolkning av data innhentet i både mer reduserte og mer intakt innstillinger. Den suspenderte buccal masse forberedelser er et nyttig verktøy for å karakterisere det nevrale kontroll av multifunksjonalitet i Aplysia.

Protocol

1. Utarbeidelse av løsninger For å forberede magnesiumklorid løsning som er isoton til sjøvannet der dyrene blir holdt (~ 1000 millosmolar), merke en stor gryte på nivået av det ønskede volum. Fylle kannen med destillert vann til omtrent 80% av dette planet, og veie ut riktig mengde magnesiumkloridheksahydrat å opprette en 333 mM løsning i sluttvolumet. Legg magnesiumkloridet til kannen, lukke lokket og rist kraftig inntil magnesiumklorid er fullstendig oppløst, og deretter legge destillert vann inn…

Representative Results

When an extracellular electrode is positioned above a neuron’s soma and used to stimulate the neuron, a one-for-one correspondence between spikes on the soma channel and on the nerve(s) the neuron projects to can be observed (Figure 6, left panel, stimulation of identified neuron B9). The soma channel (top channel) is set to stimulating mode when the current is applied (time 1 in the figure), and is then quickly switched to recording mode (time 2). By maintaining the position of the electrode, the…

Discussion

Tidligere arbeid har preget Aplysia motor programmer i intakt dyr og i redusert preparater som isolert ganglier. I det intakte dyr, selv innspillinger av individuelle nevroner er oppnådd 5, slike eksperimenter er svært vanskelig, og elektroder kan ikke flyttes fra nervecelle til nevron under matingen. I isolerte ganglia kan fôring bevegelser forårsaket av nevral aktivitet ikke følges. Den suspenderte buccal masse forberedelser bro mellom disse to ytterpunktene.

Andre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av NIH stipend NS047073 og NSF stipend DMS1010434.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Fisher Scientific S671 Biological, Certified
Potassium chloride Fisher Scientific P217 Certified ACS
Magnesium chloride hexahydrate Acros Organics 19753 99%
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63 Certified ACS
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientifc C79 Certified ACS
Glucose (dextrose) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS buffer Acros Organics 17263 99%
Carbachol Acros Organics 10824 99%
Sodium hydroxide Fisher Scientific SS255 Certified
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Certified
Single-barreled capillary glass A-M Systems 6150  
Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC Sutter Instruments   Filament used: FT345B
Enamel coated stainless steel wire California Fine Wire   0.001D, coating h
Household Silicone II Glue GE    
Duro Quick-Gel superglue Henkel corp.    
A-M Systems model 1700 amplifier A-M Systems   Filter settings: 300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator World Precision Instruments A300  
Stimulus Isolator World Precision Instruments A360  
AxoGraph X AxoGraph Scientific    
Veeder-Root Totalizing Counter Danaher C342-0562  
Gold Connector Pins Bulgin SA3148/1  
Gold Connector Sockets Bulgin SA3149/1  
Sylgard 184 Silicone Elastomer Dow Corning    
100 x 50 mm Crystalizing Dish Pyrex    
High Vacuum Grease Dow Corning    
Pipet Tips Fisher Scientific 21-375D  
Minutien Pins Fine Science Tools 26002-10  
Modeling Clay Sargent Art 22-4400  
Silk Sutures Ethicon K89OH  
Whisper Air Pump Tetra 77849  
Aquarium Tubing Eheim 7783 12/16 mm
Elite Airstone Hagen A962  
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-08  
Dumont #5 Fine Forceps Fine Science Tools 11254-20  
Yaki Sushi Nori Seaweed Rhee Bros    
Kimwipes Kimberly-Clark 34155  

References

  1. Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
  2. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
  3. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
  4. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
  5. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
  6. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
  8. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
  9. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
  10. Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
  11. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
  12. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
  13. Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
  14. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
  15. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
  16. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
  17. Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
  18. Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
  19. Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).

Play Video

Cite This Article
McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320, doi:10.3791/4320 (2012).

View Video