Summary
Biz ekstraselüler kayıt ve sinirler, kaslar ve bireysel tespit nöronlardan uyarmak için bir teknik tarif
Abstract
Işlevliliği, birden çok, farklı davranışlar 1 oluşturmak için bir periferik yapının özelliği, hayvanlar hızla değişen çevresel davranışlarını uyum sağlar. Deniz yumuşakça Aplysia'nın californica multifunctionality çalışma için uysal sistemi sağlar. Besleme sırasında, Aplysia aynı besleme aygıtı, bukkal kütle kullanılarak davranış birkaç farklı türde oluşturur. Bu davranışları kontrol eden ganglionlar elektrofizyolojik çalışma için erişilebilir büyük, tespit nöronların bir dizi içerir. Bu nöronların aktivitesi sinirsel faaliyet için gıda grasper göreli kapatan sinirsel faaliyet ve zamanlama bağlı olarak iki tip ingestive ve egestive programları, ayrılabilir motorlu programları tarif edilmiştir ki uzattığını ya da geri çekilir grasper 2. Ancak izole ganglionlar, bu davranışlar üretecektir kas hareketleri yapma, bulunmadığınasert vivo, sinir ve kas kayıtlarında programları 2,3,4 beslenme karşılık elde edilmiştir. gözlenen motor programları gerçek davranışları bağıntılarını olup olmadığını emin olmak, ancak bunu doğrudan 5 bireysel nöronların kaydetmek çok zor olduğu. Buna ek olarak, in vivo olarak, ingestive programların daha fazla ısırma ve yutar 1,2, en önceden anlatılan in vitro müstahzarlar olarak yapmak zor olan bir ayrım ayrılabilir.
Askıya bukkal kütle hazırlama (Şekil 1) izole ganglia ve sağlam hayvanlar arasındaki boşluğu kapatıyor. Bu hazırlık, ingestive davranışlar - ısırma ve yutma de dahil olmak üzere - bireysel nöronların kaydedilen ve ekstrasellüler elektrotlar 6 ile stimüle edilebilir olarak ve egestive davranışlar (red), aynı zamanda da gözlemlenebilir. Bu farklı davranışlarla ilişkili beslenme hareketleri recor olabilirded, ölçülebilir, ve motor programları ile doğrudan ilişkilidir. Askıya bukkal kitle hazırlanmasında motoru programları Motor programları izole ganglionlar elicited olandan in vivo gözlenen daha benzer olduğu görülmektedir. Bu nedenle, bu hazırlama, motor programların daha direkt olarak in vivo davranış ile ilgili olabilir, aynı zamanda, bireysel nöronların bozulmamış hayvanlarda daha kayıt ve uyarma için daha erişilebilir. Bunun yanında izole ganglia ve sağlam hayvanlar arasında bir ara adım, askıya bukkal kitle bulguları daha az ve daha sağlam hem ortamlarda elde edilen verileri yorumlamada yardımcı olabilir. Askıya bukkal kütle hazırlama Aplysia'nın içinde multifunctionality nöral kontrolü tanımlamak için yararlı bir araçtır.
Protocol
1. Çözeltilerin Hazırlanması
- Hayvanlar tutulduğu, tuzlu su (~ 1.000 millosmolar) ile izotonik magnezyum klorür çözeltisi hazırlamak için, istenen cilt seviyesinde büyük bir sürahi işaret eder. Bu seviyenin yaklaşık% 80 saf su ile testi doldurun, ve son hacmi 333 mM çözüm oluşturmak için magnezyum klorür hekzahidrat uygun miktarda tarttın. Sürahi magnezyum klorür ilave edin, kapağını kapatın ve magnezyum klorür tamamen eriyene kadar kuvvetlice çalkalanır, sonra son hacim ulaşıncaya kadar distile su ekleyin.
- Aplysia'nın tuzlu hazırlamak için tekrar istenilen ses seviyesinde büyük bir sürahi işaretlemek ve bu düzeyde yaklaşık% 80 saf su ile doldurun. Bir heyecan plaka üzerinde sürahi yerleştirin, sürahi bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve heyecan plaka üzerinde açın.
- Birer birer, bu con oluşturmak için aşağıdaki maddelerin uygun miktarlarda tarttın ve sürahi eklemeknihai hacim içinde konsantrasyonlan: 460 mM sodyum klorid, 10 mM potasyum klorid, 22 mM magnezyum klorür hekzahidrat, 33 mM magnezyum sülfat heptahidrat, 10 mM kalsiyum klorür dihidrat, 10 mM glikoz, 10 mM MOPS.
- Çözünen tamamen çözünene sonra, çözeltinin pH'ı ölçmek için, bir pH metre kullanımı. Yavaş yavaş 7.5 arasında bir nihai pH değerine yükseltmek için 1 M sodyum hidroksit ilave edin. Yanlışlıkla çok fazla sodyum hidroksit eklerseniz, pH düşürmek için 1 M hidroklorik asit ekleyebilirsiniz.
- Son hacim elde edilene kadar saf su ekleyin.
- Bir deney için gerekli olana kadar buzdolabında bakteriyel büyüme, mağaza çözümleri yavaş için. Sıcaklık Aplysia'nın motoru programları etkileyebilir unutmayın. Biz dikkatli sıcaklığını izlemek yok, ama kurulum tamamlandıktan sonra, hazırlıklar genellikle oda sıcaklığına yakın vardır.
2. Kayıt Bulaşık hazırlanması
- Deney sırasında, bukkal kütle içinde çözelti içinde süspansiyona alınacaktıryuvarlak bir 100 mm (çap) x 50 mm (yükseklik) borcami. Bu yemeğin bukkal kitle, bukkal ganglionlar Sylgard tutturulmuş olan dar, yüksek orta platform ve serebral ganglion izole ayrı, yüksek geri odasındaki için bir ön bölme olmalıdır. Sylgard bir çentik serebral ganglion odasına bukkal ganglionlar platformu bağlamak gerekir. Çanak oluştururken belirtilen anahtar boyutları atıfta bulunarak, Şekil 1'e bakınız.
- Bu yemeğin oluşturmak için yuvarlak bir 100 x 50 mm borcami ile başlar. Ürün ile birlikte verilen talimatları izleyerek Sylgard hazırlayın. Çanak yapımı birkaç Sylgard ayarlamak için izin verilmelidir aralarında, Sylgard pours gerektirecektir.
- İlk dökmek çanak Sylgard en üst düzeyde, bukkal ve serebral odaları (Şekil 1'e bakınız) arasında duvar oluşturmaktır. Diğer bölümlerden yemeğin bu kısmı kapalı engelleyin. Hamuru oluşturmak için de kullanılabilirbölümleri kapalı engelleme için duvarlar. Düz duvar için, bir parça karton bir hamuru sırtlı, kullanılabilir. Bir eğimli duvar (ki beyin ganglion içeren odasının büyüklüğü azaltır) için, duvar için esas olarak tek başına hamuru kullanılır. Plastik wrap ile kaplayın tüm duvarları kolay çıkarılması için Sylgard irtibata geçecektir.
- , Kaçak en aza indirmek neredeyse kadar yemeğin üstüne bu alana Sylgard dökmek kenarlarında sıkı mühürler sağlamak, 2.3 bölümünde açıklandığı gibi bir kez bukkal ve serebral odaları arasındaki duvar alanı kapalı bloke edilmiştir. Gecede Sylgard seti edelim ve tam devam etmeden önce ayarlanmış olduğundan emin olun. Ilık bir yerde çanak koymak hızlı ayarı neden olacaktır.
- Daha sonra, bukkal ganglion platform ve serebral ganglion bölmesinin (yine, tamamlanmış çanak içinde bu gangliyonların konumları gösterir, Şekil 1 'e bakınız) dökülür olmalıdır. Önceki engelleme duvarlar çıkarın ve yeni bir duvar bir di oluşturunbukkal ganglion platformu engellemek için orta bölümü düz Sylgard duvardan duruşu 0,5 cm. Hayır duvarlar serebral ganglion yapacak geri odasındaki oluşturmak için gereklidir. Üst seviyesinin altında yaklaşık 3 mm yüksekliğe kadar her iki bölümde Sylgard kadar dökün. Serebral odası bukkal ganglionlar platformu daha sadece biraz daha düşük olmalıdır. Yine, Sylgard gecede belirlemenize olanak sağlar.
- Son olarak, ön kamara (yani, bukkal kitle askıya alınacak hangi odacık) dökün. Hayır duvarlar gereklidir. Şekil 1'de belirtildiği şekilde uygun yüksekliğe dökün.
- Son adım bukkal ganglionlar platformu ve serebral odasına bağlayan bir çentik kesmektir. Çentik derinliği bukkal gangliyon platformun seviyesi ile aynı olması gerekmektedir. Bistüri çentik kesmek için de kullanılabilir. Şekil 1, bu tamamlanmış çanak göstermektedir.
3. Elektrot Hazırlama
- Ekstrasellüler e çekinBir Flaming-Kahverengi mikropipet çektirmesi kullanarak tek namlulu kılcal cam lectrodes. Elektrodlarının iç çapı yaklaşık 40 um olması ve bunların direnç MΩ yaklaşık 0.1 olması gerekir. Çekiciye FT345B filament ile, tipik çektirmenin program ayarları Isı 480, Pull 50, Vel 13 ve Zaman 20, ancak ayarları farklı filamentler için farklı olacağını unutmayın. Bu program hiçbir yangın parlatma kademesi ile, tek bir çekme içinde elektrotlar oluşturur. Bir deneme, dolgu Aplysia'nın salinle ekstraselüler elektrotlar başlamadan önce.
- Ki bireysel elektrotları birbiri etrafına sarılmış olması gerekmez dışında, Cullins ve Chiel 4 tarafından tarif edilene benzer bir protokol izlenerek 2 sinir ve kas kayıt için kanca elektrotlar oluşturun. Bu elektrotların oluşturmak için adımları 3,3-3,13 takip.
- Yaklaşık 60 cm uzunluğunda emaye kaplı, 0.001 inç çapında paslanmaz çelik tel bir parça kesin. Modelleme kil topu takıntelin her iki ucuna da, onun orta noktada havada tel kadar tutun ve birbirleri etrafında tel sarmak için birbirleri etrafında kil iki topları dönmeye (Bu kapasitif geçici azaltır).
- Bir top ve bant tel askıya telin diğer ucunu kil iki top katılarak birlikte telin iki ucu tutun.
- , Parmağındaki bir tutkal glob yerleştirerek tel üzerinde birlikte baş ve işaret parmağınızla dokunarak ve tel üzerinde çalıştırarak Coat ev silikon yapıştırıcı telin tüm uzunluğu. Tutkal gecede kurumasını bekleyin.
- Tutkal kuruduktan sonra, bir binoküler mikroskop altında düz bir yüzeye tel yerleştirin. Birlikte bükülmüş iki ayrı tel ile sonuçlanan, daha önce orta olan tel ucu kesilir. Bu, diferansiyel bir elektrot.
- Yerinde elektrot uçları birini tutmak için bant kullanın. Tutkal ve emaye sökmek için forseps kullanarak, yaklaşık 2 cm o var bir ucunda iki tel hazırlamakemaye elimden teli yaklaşık 1 cm ile f serbest tel. Lehimleyin ayrı tutmak için işaretçilerine etrafında teller her birine altın konektörü pin ve yerde laboratuvar bant.
- Elektrot diğer ucunda, tel tel serbest yaklaşık 3 mm olması için hazırlar. Bir tel son yaklaşık 1 mm emaye çıkarın ve bu tel ve geri yoldan bükün. Bu referans tel. Bu iki tel birbirlerine dokunmadan çıplak tel yok önemlidir.
- Diğer tel silikon tutkal tüm yol emaye çıkarın. Bir kanca içine bu tel bükün ve yaklaşık 1 mm uzunlukta kesin. Bu kanca sinir veya kas eklenecektir. Kısa bir kanca kullanarak sinir elektrot bağlı olan daha fazla istikrar sağlar.
- Elektrot düzgün inşa ve sağlam olduğundan emin olmak için bir multimetre kullanın. Bir altın konnektör bir telin ucu ile ilgili kabaca 200-500 ohm direnç okuma olmalıdır ve diğer altın bağlamakya da diğer tel göre bir okuma benzer olmalıdır.
- Bir tel üzerinde sağlam bir bağlantı yoktur, bu telin yeniden şerit ucu ve yeniden lehim bir ya da bu bağlantılar oluşturmak için hem altın bağlayıcılara mümkün olabilir. Hem altın konektörleri hem teller ile bağlantıları varsa, elektrot temas yaparak iki çıplak teller olabilir. Bu sorunu ortadan kaldırmak için diğer ucu düzeltmek için mümkün olabilir, aksi takdirde, elektrot atılmalıdır.
- Birçok elektrot olarak deney için gerekli olarak için bu yordamı yineleyin. Kanca elektrotlar sinirin bağlı olduğu uç keserek ve tel çok kullanır sonra çok kısa hale gelinceye kadar, yeni kancalar oluşturarak deneme deneyinden yeniden kullanılabilir. Her zaman bu yapılır, elektrot bozulmamış olduğunu doğrulamak için multimetre kullanın.
- Deneyler, etiket elektrotlar ve kabloları sırasında farklı elektrotlarla izlemek için. Laboratuvar bant farklı renkler kullanmak işe yarayabilir.
- 200-300 g ağırlığında sağlıklı bir hayvan seçin. Yosunu ile sunulan, hayvan 3-5 sn aralıklarla kuvvetli protractions ile ısırıkları üretmek gerekir.
- Bir kesme tepsi içinde hayvan yerleştirin ve en az% 50 ağırlık izotonik magnezyum klorid çözeltisi enjekte edilmesiyle yaklaşık anestetize. Ortasına yakın ve hayvanın kuyruk doğru bakacak 15 ila 30 yaklaşık bir derecelik açıyla şırınga ile ilk enjeksiyon, olun. Enjeksiyondan sonra, yavaşça magnezyum klorür yaymak için hayvanın yüzeyi masaj. Hayvanın kafasını bakacak şırınga ile gerektiğinde ek enjeksiyonları olun.
- Hayvan nazik dokunsal uyaranlara yanıt vermiyor sonra, kuyruk bir pin ve her anterior tentacle bir iğne ile, yukarı tepsi, dorsal tarafına hayvan pin.
- Rhinophores arkasında, başının ortasında hayvanın derisine tutun ve kaldırmak için forseps kullanın. MSadece nokta tutuluyor arkasındaki hayvanın kafasına doğru ake bir koronal kesi. Sonra bukkal kütle açığa ağzına doğru rhinophores arasında ileriye bir midsagittal kesi yapmak.
- Bukkal kitle uzak size yakın cilt flep çekin ve sinirler ve tam bukkal kitle deri flebi bu ayırmak için vücut duvarına yapışır bağ doku kesmek için forseps kullanın. Herhangi bir sinir ya da bukkal kitle intrinsik doku kesmek için değil emin olun.
- Özofagus kapmak ve tutmak için forseps kullanın. Tutulduğu noktasına yemek borusu arka kesilmiştir. Aşağıdaki kesim yapılır gibi bukkal kitle kaldırmak için özofagus yukarı çekin.
- Bukkal kitle arkasında, serebral-bukkal bağlaçlar (CBCs) tarafından bukkal ganglionlar bağlı serebral gangliyon ile, halka serebral, plevral ve pedal gangliyon formu. Bukkal kütleye bağlı bu yüzüğü ganglionlar bırakın ve bu gangliyonlarından diğer bölgelerine yansıtarak tüm sinirleri kesmekvücut.
- O gövdeye bağlanır ve bu da daha az olarak bukkal kütle yukarı kaldırmaya devam eden, tüm bukkal kütle etrafında bağ dokusu ile kes. Bukkal kütlesi sadece ağzında yerleştirildikten sonra, yemek borusu ve bukkal kitlesel dik tutulmalıdır.
- Vücuttan bukkal kitle serbest çeneleri sadece ön bir final cut olun. Elektrotlar bağlı bulunmaktadır kısmi anestezisi korumak için en az% 50 izotonik magnezyum klorür çözeltisi ile en az% 50 Aplysia tuzlu bir çözelti içinde bukkal kütle yerleştirin.
- Sylgard dipli bir Petri kabı, solüsyonu ile, yanak kütle yerleştirin. Serebral ganglion onların bağlantılarını keserek plevral ve pedal gangliyon çıkarın. Serebral-bukkal bağlaçlar (CBCs) aracılığıyla bukkal ganglia ve bukkal kitle bağlı serebral ganglion bırakın; serebral ganglion ve bukkal kütle arasındaki diğer bağlantıları sever. Onlar g değil çok kısa uzunluklarda özofagus ve tükürük bezleri Trimark şekilde.
5. Kanca Elektrot Eklenti
- Kayıt ve stimülasyonu için, kanca elektrotlar deneyi (Şekil 2) uygun olarak, başka sinir ve kas çok sayıda takılabilir.
- Cullins ve Chiel 4 ile in vivo olarak desenler karakterize etmek radular sinir elektrotlar, I2 kas ve yanak sinirler 2 ve 3 ekleyin. Hep birlikte, bu kayıtlar bukkal kitle 3,7,8 içsel büyük kaslar için motor nöronların aktivitesini göstermek ve I2 kaydı 3, bukkal sinirlerden retraksiyon faz 2 ve 3 kayıtlar 2 protraksiyon faz tespitine imkan , 5,8, ve radular sinir kayıt 2 yemek grasper kapatılması zamanlaması. Desen uyarılması için bukkal sinir 2. bir şube için ek bir kanca elektrodu takın. Elektrotların eki demonstrat benzer bir prosedür takipCullins ve Chiel 4 tarafından ed, ve şu adımlar da tarif edilmektedir.
- Her elektrot eki için kaba bir manipülatör üzerinde elektrot yerleştirin. Manipülatör için, onun ucunda bir timsah klibi ile bir tahta sopa çektim ve elektrot ucunu tutmak için klibi kullanabilirsiniz. Klip yaklaşık 1 cm silikon kaplamanın sonundan önce, elektrodun silikon kaplı bölüm eklemek gerekir. Bukkal kitle yakın kanca elektrodu konumlandırmak için manipülatör kullanın.
- Yan bukkal kitle ile ve istikrar için çanak yan karşı yerleştirilir, en zor elektrot eki sunulur radular sinir ile başlar. Bu sinir erişmek için iki seçenek vardır.
- Radular sinir bukkal ganglion altından projeler ve iki şubesinde I2 kas altında gider. Birincisi, radular sinir kas kesmeden erişilebilir olup olmadığını görmek. D; yavaşça I2 kas bukkal ganglionlar takılarak beyaz kılıf kenara itmeko Bu kılıf kesilmez. Sinir erişilebilir durumdaysa, sinirin bir dalı kaldırmak için bir kanca içine ucu bükük forseps kullanın.
- Radular sinir bu şekilde erişilebilir değilse, ikinci bir seçenek ince I2 kas altındaki sinir bulun ve sinir maruz I2 küçük bir kesi yapmak. Bu kesi kas iki kat geçmesi gerekir. Kas altından radular sinirin bir dalı dışarı çekmek için kanca forseps kullanın.
- Sinir yanında elektrot kanca konumlandırmak için manipülatör kullanın. Kancaya sinir yerleştirmek için, aynı anda tutuluyor sinirin iki yarısı arasındaki ayrım yaratmak için forseps bir çift kullanırken çengel forsepsteki sinir tutmak için yardımcı olur.
- Sinir kanca güvenli sonra, o gergin kadar bukkal kitle uzak sinir kaldırmak için, ama overstretch yok manipülatör kullanın.
- Bir Kimwipe al ve sıkı küçük bir fitil oluşturmak için bir köşe bükün. Kurutmak için bu fitil kullanınelektrot ve bağladım sinir bölüm sonu.
- Çengel sinir Hızlı Jel süper yapıştırıcı bir topak uygulamak için eğri uçlu forseps başka bir set kullanın. Tel ve sinir arasındaki temas noktasında uygulamaya başlayın. Kanca tamamen yapıştırıcı ile kaplı olduğunu ve referans telin ucu tutkal (Şekil 3) ile kaplı olmadığından emin olun.
- Ayarlamak için tutkal yüzeye neden olacaktır tutkal üzerine çanak, gelen çözümü uygulamak için bir polietilen boru eki ile bir şırınga kullanın. Iyice tutkal düzgün ayarlar sağlamak için çözüm tutkal yıkanmak emin olun.
- Sinir üzerinde gerilim serbest bırakın ve daha sonra klipten elektrot serbest bırakmak için manipülatör kullanın. Bu bir kanca elektrot bağlama prosedürünü tamamlar.
- I2 kas elektrodu sonraki eklenmelidir. I2 sinir çok sma çünkü biz I2 kas ziyade innerve eden sinirin ENG aktivite EMG aktivitesini kaydetmekbozulmamış bir bukkal kitle ulaşmak için ll ve zor. Bukkal sinir 2 civarında, I2 kas bir ya da iki grup kaldırma ve kas geri kalanından ayırmak yardımcı olmak için forseps bir çift kullanmak için çengelli forseps kullanır. Ayrılmış I2 kısmı bukkal sinir 2 ya da 3 ile kalınlık olarak benzer olması gerekir. Değil (kas denervate olabilir) aşırı ayırmak için dikkatli olun. Radular sinir için kullanılan aynı prosedüre bir kanca elektrodu takın.
- Takmak için yanındaki elektrot olduğu şube bukkal sinirin 2 bir için. Bu dal elektrik motoru programları 9 ikna etmek için teşvik edilebilir. Bukkal sinirin 2 yanal oluk de I1 kası altından geçer önce, sinir e ayrılır; dalı ayrılarak ilk dalıdır. Dalları oldukça küçük, bu nedenle elektrot eki dikkatle yapılmalıdır. Elektrot takmak için aynı prosedürü izleyin.
- Bukkal sinirler 2 ve 3 kolayca erişilir. Elec bağlama, aynı prosedürü takip edinkabaca yarıya bukkal ganglion ve yanal oluk arasındaki trodes.
- Bazı nöronlar ipsilateral vs farklı tepki, çünkü tek taraflı göre ikili çıkıntıları olan nöronların ayırt etmek amacıyla, bu, bukkal kütle yanı sıra, bukkal sinir 2 dalı, bir diğer tarafında yanak sinirler için elektrotlar 2 ve 3 eklemek için de yararlıdır . kontralateral BN2-bir uyarım.
6. Ganglion konumlandırılması ve Kılıf İnceltme
- Bukkal kitle Bölüm 2'de anlatılan yuvarlak 100 x 50 mm borcami taşınacaktır. Şekil 1'e bakınız.
- Vakum gres glob pick up ve çentik üzerine yaymak için bir pipet ucu kullanarak, serebral ve bukkal odacıkları arasındaki çentik vakum gres ince bir tabaka uygulayın. Biz vakum gres vazelin daha kaçağı daha aza indirir olduğunu bulduk. Aplysia'nın salin ile ön kamara doldurun. Dikkatlice ön chamb için Petri çanak bukkal kitlesel hareketsinirler kırabilir elektrotların hiçbiri sıkıca çekilir emin bu büyük çanağı er,.
- Çanak kılıf inceltilmesi için başka bir binoküler mikroskop aktarılması gerekiyorsa, kancalı elektrotlar ile çok dikkatli olun. Grup birlikte bukkal kütle bir tarafında elektrodları, ve aynı zamanda bir arada bukkal kütle diğer tarafında grup elektrotlar. Dikkatlice tekrar elektrotların hiçbiri sıkıca çekilir emin, konektör pimleri kapsayan laboratuvar bant tutarak elektrotlar tutun.
- Çanak mikroskop altında konumlandırılmış olduğunda, elektrotlar yemeğin yanındaki platformda çanak ve dinlenme taraf üzerinde hafifçe kaplanması gerektiğine.
- Sonları sırasında ve deney kademeleri arasında, bir akvaryum airstone kullanılarak bukkal boşluk içinde kütle tuzlu havalandırır.
- Çentik ile çalışan beyin-bukkal bağlaçlar (CBCs) ile arka serebral ganglion Pin. Daha fazla vakum g uygulayınCBCs üzerinde rease, sonra çanak iki parça daha Aplysia'nın salin eklemek, ganglion tamamen sular altında böylece. Hiçbir sızıntı odacıkları arasındaki oluşur böylece eklenen vakum yağ miktarı serebral veya bukkal odaları birinde salin düzeyi daha yüksek olduğundan emin olun. Bu aşamada, bukkal kitle sinirler ve ganglionlar üzerinde çok kuvvetli çekmemeye şekilde ön bölme altında durmalıdır.
- Orta platform üzerinde bukkal ganglionlarda Pin. Hala bukkal kütleye bağlı sinirlere zarar vermemek için, sadece iki sinirler arasındaki kılıf üzerinde işaretçilerine yerleştirin. Esnetmeyi ve çapa CBCs tarafında iki tane daha işaretçilerine ekleyin.
- Ilgi nöronların yere göre bukkal ganglionlar düz veya döndürülmüş tutun. Bukkal ganglion döndürmek için, CBC bazı aşırı kılıf kapmak için ince forseps kullanabilir ve 2 ve 3 bukkal sinirler arasındaki aşağı pin. Daha sonra en arka bölme ile yakın olan ve EASI olamaz hücre gövdelerininbukkal ganglion üst erişilen ly görülebilir. Son olarak, bukkal ganglion hareketini en aza indirmek için, bukkal kütle tarafına yakın bukkal ganglion kılıf üzerinde iki pim ekleyin. Şekil 4'e bakın.
- Geri odasına yakın bukkal ganglion kılıf kapmak için ince forseps kullanın ve ardından hücre gövdeleri maruz kalmadan ince makas ile aşırı kılıf kesip. Zararı en aza indirmek için, sadece hücre gövdeleri görmek için gerekli kılıf miktarını kaldırmak.
7. Uyarım ve Kayıt
- Kılıf tamamlandıktan incelme sonra amplifikatörlere bağlayan kabloları üzerindeki yuvalarından tüm elektrot pimleri takın. Yine, bunu yaparken elektrotlar sıkıca çekilmiş değil emin olun. Elektrotların doğru şekilde uygun kabloların bağlı ve kutupları doğru olduğundan emin olun.
- Kalan magnezyum klorür yıkamak için Aplysi değiştirinTaze Aplysia'nın salin ile bukkal kitle odasında bir tuzlu.
- Çene kıkırdak bukkal kitle anterodorsal önündeki yumuşak doku aracılığıyla ipek sütür geçirin ve böylece ön ucundan bukkal kitle askıya, yemeğin kenarına sütür eklemek için modelleme kil iki parça kullanınız. Posterior ucundan bukkal ganglionlar bağlı bukkal sinirler tarafından askıya unutmayın.
- Elektrot ucu bukkal ganglion yakın böylece bir cam ekstraselüler elektrot tutan bir manipülatör yerleştirin.
- Bir nöron bulmak ve tanımlamak için, yavaşça nöron soma (Şekil 5) üzerindeki kılıf üzerine ekstraselüler elektrot ucu aşağı doğru basın manipülatör kullanın. Bir uyarıcı akım uygulayın ve ardından sinir ekstraselüler elektrot ve ilgili aktivite (Şekil 6) etkinliklerini kaydetmek için kayıt modu için soma heyecanlandırmak için kullanılan kanal geçiş. Başvurmaknöronların tanımlanması konusunda yardım için sinir projeksiyonları ve kas innervasyonu, (örneğin 7,8) dahil olmak üzere yayınlanmış ganglion haritalar ve nöron açıklamaları,. kadar
- Besleme programları, pozisyon bukkal kütlesini ön ve yan görünüşleri (ayna yeri Şekil 1 'de şematik olarak gösterilmiştir) eş zamanlı olarak görülebilir, böylece çanak tarafındaki bir ayna. Bir video kayıt için Ön ve görüş alanında yan görünümleri hem de bir video kamera yerleştirin.
- Video ve elektrofizyolojik kayıtlar kamera görünümünde bir elektronik zamanlayıcı ve AxoGraph, elektrofizyolojik veri kaydetmek ve analiz etmek için kullanılan bilgisayar programının bir kanala hem TTL darbe göndererek senkronize edilebilir. Bu darbe dosyaları senkronize edilebileceği dayalı AxoGraph ve video kayıtları tam olarak aynı olan bir zaman noktası sağlar.
- Bir nöron bulunduktan sonra, faaliyet farklı besleme gibi davranışlar, ca kaydedilebilirn, aşağıda tarif ortaya çıkartılmıştır.
- Ikna etmek rejeksiyon gibi motor programları teşvik BN2-2 Hz, 1 ms puls 9 (bizim deneyim bu uyarımı güvenilir bu ortamda egestive kalıpları üretir olduğunu) uzun bir tren ile. Desenler stimülasyon süresi boyunca devam edecek ve stimülasyon süresinin sona ermesinden kısa sonrasına kadar devam edebilir.
- Isırma-gibi motor programları 12 teşvik etmek, doğrudan serebral ganglion katı karbakol birkaç kristalleri yerleştirin. Karbakol maruz kalma kontrollü bir seviyede gerekli olan, alternatif olarak, Aplysia tuz çözeltisi içinde 1 ila 10 mM karbakol bir çözelti kullanılır. Yüksek konsantrasyonlarda tepkiler vermesi olasılığı daha yüksektir. Tekrarlayan desenler genellikle 5 dakika, ve koşmak başlamadan önce yaklaşık 10 ila 15 dakika sürer içinde başlamalıdır.
- Indüklemek için yutma-gibi motor programları 13, karbakol uygulamak ve bukkal kitlesel güçlü ısırıkları oluşturur kadar bekleyin. Sonra, bir lokma sırasında, bir şerit yerleştirinyosunu (kuru laver) radula deniz yosunu (Şekil 7) kavrayan, böylece, hayvanın ağzında. Şeritler 5 cm uzunluğunda, genellikle 0.5 cm genişliğindedir.
- Karbakol indüklenen desen ilk dizi sonra, ek karbakol cevaplar elde etmek genellikle mümkündür. İyice en az üç kez kaldırarak ve tuzlu yerine, serebral ganglion odasında Aplysia'nın salin yıkayın. Tekrar karbakol uygulamadan önce en az 20 dakika bekleyin. 40 dakikaya kadar bekliyorum daha güvenilir sonuçlar doğurabilir.
Amerika Birleşik Devletleri'nde bu zamanda, omurgasız hayvanlar kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından resmi onay gerekmez. Ancak, biz Aplysia'nın tüm tedaviler zarar en aza indirmek ve hayvana acı ve hayvan tamamen uyuşturulduktan sırasında tüm diseksiyonları yapılır o sağlamıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki iş sağlam hayvan ve tür izole ganglionlar azaltılmış hazırlıklarda, Aplysia'nın motorlu programları karakterize etmiştir. Bireysel nöronların kayıtları 5 elde edilmiş olmasına rağmen sağlam hayvan olarak, bu tür deneyler çok zordur, ve elektrotlar beslenme sırasında nörona nörondan taşınamaz. Izole ganglionlar, sinir aktivitesi tarafından indüklenen beslenme hareketleri izlenememektedir. Askıya bukkal kitle hazırlanması bu iki uç arasındaki boşluğu kapatıyor.
Diğer yarı-sağlam hazırlıkları önceki çalışmalarda kullanılan, ancak askıya bukkal kitle hazırlanmasında önemli avantajları vardır oylandı. Bir yarı-sağlam hazırlık olarak, dudaklarda ve yanak kitle hala bağlı olduğunu, ancak hazırlanması çok 14 uyulmalıdır tam besleme hareketleri için düşürülmüştür. In vitro hareketleri besleyen bir besleme kafası hazırlanması 15,16 izin gözlem. Bununla birlikte, incikafası hazırlık besliyor askıya bukkal kitle burada açıklanan daha kurmak için daha karmaşık olduğunu ve sadece bukkal ganglion, serebral ganglion bireysel nöronların erişim değil sağladı. Besleme kafası hazırlanması için bir avantaj var, o da dudak ve anterior Tentacles varlığı ısırma desen nesil yosun uygulaması, doğal bir uyarıcı ile izin verdi. Bu deney daha zor hale getirecek rağmen, aynı zamanda tek tek nöron erişmek için bukkal gangliyon iğneleme sırasında bukkal kütle bağlı bırakarak dudak, preparasyonlar birleştirmek mümkün olabilir.
Aplysia olarak beslenmesi desen motorlu programlarının uzatma ve geri çekme aşamaları göre gıda grasper, kapanır radular sinir üzerinde etkinlik zamanına göre ingestive veya egestive olarak sınıflandırılabilir. Radular sinir etkinlik geri çekme aşamasında olduğu gibi aynı zamanda olursa, desen vardır ingestive, o yanak boşluğuna gıda çekmeye çalışır gibi grasper kapatma ve geri çekilmeden çünkü. Radular sinir aktivitesi protraksiyon aşamasında oluşursa grasper kapatma ve ağız boşluğu 2 materyali dışarı itmek protracting çünkü, desenler, egestive vardır.
, Isırma gıda kavramak için çalışır, ve yutma, zaten kavramış gıda 1,2 nakliyesi: Ingestive desenler en az iki alt-türleri farklı ayrılabilir. Ancak, in vitro çalışmalar (örneğin 14,17,18) en yutma ısırma ayırt çalışırken değil, sadece yenmesi / egestion ikilemi üzerine odaklanmıştır. İki çalışma 16,19 ısırma gibi ve yutma gibi gruplarda vitro ingestive desenler sınıflandırdı. Bu çalışmaların ilkinde, desenler izole ganglionlarda gözlendi; bukkal kitle ilişkili besleme hareketleri gözlenebilir, bu argüman güçlendireceğini söyledise desenleri ısırma ve in vivo olarak görülen Yutulduğunda temsil eder. İkinci çalışmada, desenleri bir besleme kafası hazırlık gözlendi, bu nedenle desen gözlenen hareketlerine göre sınıflandırılır, ancak yanak ganglion nöronlar hiçbir kayıtları elde edildi.
, Isırma, yutma ve ret - - askıya bukkal kütle hazırlama davranışları her üç tip gözlemlemek için bir yol sağlar aynı anda basılı bukkal sinir ve kasların aktivite kayıt, ve bireysel nöronların uyarıcı ve kayıt ikisi ise. Elicited güçlü besleme şeklinde hareketler neredeyse kesinlikle bir intrasellüler elektrot yerinden çünkü ekstrasellüler nöron tekniği 6, bu hazırlık başka önemli gelişmedir. Bu yalnız sinir kayıtları ile zor olurdu zaman birçok farklı birimler f çünkü bireysel nöronların ekstrasellüler kayıtları ile, motor programları sırasında bu nöronların aktivitesinin zamanlaması, tespit edilebiliraynı anda iring.
Biz askıya bukkal kitle beslenme hareketleri vivo olarak görülen niteliksel benzer görünür olduğunu gözlemledim. Önemlisi, uyaranlara (karbakol ve sırasıyla bukkal sinir 2 şube stimülasyon,) fazla azalır hazırlıklarında kullanılan ve bizim uyaranlara fizyolojik hareketleri doğurur bulgu diğer ortamlarda kullanılmak amacıyla kredibilite katıyor oylandı ısırma ve ret desenleri oluşturmak için kullanılır. Buna karşılık, yutma desenleri oluşturmak için, biz izole ganglion uygulanan olamazdı doğal bir gıda uyaran (bir deniz yosunu şerit) ile yapay bir uyaran (karbakol) birleştirdi. Biz de askıya bukkal kütle nöral desenleri duyusal geribildirim CPG gelen desenler şekillenmesinde önemli olabilir düşündüren, daha azaltılmış preparatlar elde desenler daha vivo desen daha benzer gibi görünen olduğunu gözlemledim. İzole grup Örneğin, motorlu programlarıaskıya bukkal kitle motor programları genellikle bozulmamış hayvanlardan (yayınlanmamış veri) motor programları için süresi çok daha yakın iken lia, bozulmamış hayvanlardan motor programları daha süre içinde birkaç kez daha tipik. Bukkal asılı kütle diğer bir avantajı da eşzamanlı tarafı ve besleme aygıtının ön izleme elde edilebilir. Çene kas kasılma daha iyi bir gözlem izin verirken önden görünüşüdür, in vivo olarak görülebilir ki bu da için ağız benzer bir görünüm sağlar. Yandan görünüm daha kolay farklı davranışlar sırasında biyomekanik değişimleri anlamak için yapım, bukkal kas kasılmaları gözlem ve kasların altında grasper arasında ileri ve geri hareket sağlar.
Bu hazırlık, biz aynı anda beş sinirler (radular sinir ve bilateral bukkal sinirler 2 ve 3) ve I2 kas yukarı kaydettik ve aşırı tanımlanmış iki ekstrasellüler elektrot kadar yerleştirilirganglion sinir hücreleri. Bu deneyi arzu edildiği takdirde, ilave sinirler ve / veya kas kayıt yapmak mümkün olur. Aynı zamanda, serebral bukkal internöron uyarılması, bir ortak teknik 17,19, in vivo olarak benzer davranış motorlu programlar neden olup olmadığının ilişkin bilgi verebilir serebral ganglion nöronlarının gelen teşvik ve kaydetmek mümkündür. Böylece hazırlık teknik zorluk artar rağmen, bukkal arter 15 perfüzyon hazırlanması daha güçlü ve daha uzun ömürlü davranışları (yayınlanmamış gözlemler) oluşturmak için izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma NIH hibe NS047073 ve NSF hibe DMS1010434 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:300-500 Hz nerves,10-500 Hz I2 muscle | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | ||
| Veeder-Root Totalizing Counter | Danaher | C342-0562 | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 50 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Silk Sutures | Ethicon | K89OH | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Yaki Sushi Nori Seaweed | Rhee Bros | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
References
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. J. Exp. Biol. 210, 238-260 (2007).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75, 1309-1326 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J. Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11, 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72, 1794-1809 (1994).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17, 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312, 207-222 (1991).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179, 509-524 (1996).
- Kupfermann, I. Feeding behavior in Aplysia: A simple system for the study of motivation. Behav. Biol. 10, 1-26 (1974).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173, 519-536 (1993).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6, 2403-2415 (1986).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15, 1712-1721 (2005).
- Jing, J., Weiss, K. R. Neural mechanisms of motor program switching in Aplysia. J. Neurosci. 21, 7349-7362 (2001).
- Morgan, P. T., Jing, J., Vilim, F. S., Weiss, K. R. Interneuronal and peptidergic control of motor pattern switching in Aplysia. J. Neurophysiol. 87, 49-61 (2002).
- Jing, J., Cropper, E. C., Hurwitz, I., Weiss, K. R. The construction of movement with behavior-specific and behavior-independent modules. J. Neurosci. 24, 6315-6325 (2004).
