Summary

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Published: December 19, 2012
doi:

Summary

הליך מתואר למניפולציה של פעילות תאי עצב בקליפת מוח פירמידליים מוחיים optogenetically תוך אלקטרו, electromyogram, וריכוז חומצת חלב מוחות המנוטרים. הקלטות ניסיוניות מבוצעות על עכברי כבלים-כבולים בזמן שהם עוברים מחזורי שינה / בעקבות ספונטניים. Optogenetic ציוד מורכב במעבדה שלנו; ציוד הקלטה זמין מסחרי.

Abstract

למרות שהמוח מהווה פחות מ 5% מהגוף על ידי מסה, היא מנצלת כרבע מגלוקוז בשימוש על ידי הגוף במנוחה 1. הפונקציה של שינה ללא תנועת עיניים מהירות (NREMS), החלק הגדול ביותר של שינה בזמן, אינה ודאית. עם זאת, מאפיין בולט אחד NREMS הוא ירידה משמעותית בשיעור ניצול הגלוקוז במוח ביחס לערות 2-4. זה וממצאים אחרים הוביל לאמונה מרוויחה כי שינה ממלאת תפקיד הקשור לחילוף חומרים במוח. ובכל זאת, את המנגנונים בבסיס הירידה בחילוף חומרים של הגלוקוז במוח במהלך NREMS יישארו להובהרו.

תופעה אחת קשורה NREMS שעשוי להשפיע על קצב חילוף חומרים במוח היא המופע של גלים איטיים, תנודות בתדרים של פחות מ 4 רץ, באלקטרו 5,6. גלים איטיים אלו שאותרו ברמה של הגולגולת או משטח קליפת מוח מוחות משקפיםתנודות של נוירונים בסיסיים בין מדינת depolarized / ומדינה hyperpolarized / למטה 7. במהלך את המדינה, תאים אינם עוברים פוטנציאלי פעולה למרווחים של עד כמה אלפיות שניים 100. שיקום הדרגתי ריכוז יוני עוקבים לפוטנציאל פעולה מייצג עומס מטבולים משמעותי על התא 8; העדר פוטנציאל פעולה במצבים למטה קשורים NREMS עשוי לתרום לחילוף חומרים יחסית להעיר מופחת.

שני אתגרים טכניים היו צריכים טיפול במסגרת מערכת היחסים ההיפותטי הזה כדי להיבדק. ראשית, היה צורך למדוד את חילוף חומרי glycolytic מוחות עם רזולוציה משקפת את הדינמיקה של EEG המוחי זמנית (כלומר, על שניות ולא דקות). כדי לעשות זאת, מדדה את הריכוז של חומצת חלב, התוצר של הגליקוליזה אירובית, ולכן readout של קצב חילוף חומרים של הגלוקוז במוחם של עכברים. קטט היהנמדד באמצעות חיישן קטט מונואמין מבוסס זמן אמת הגלומה בקליפת המוח הקדמית. מנגנון החישה מורכבת מאלקטרודה הפלטינה אירידיום המוקף בשכבה של מולקולות מונואמין קטט. חילוף חומרים של חומצת חלב על ידי מונואמין קטט מייצר מי חמצן, שמייצר זרם באלקטרודה הפלטינה אירידיום. אז ramping את הגליקוליזה המוח מספק עלייה בריכוזו של המצע למונואמין חומצת החלב, אשר לאחר מכן בא לידי ביטוי בעלייה נוכחית בהאלקטרודה החישה. זה היה בנוסף צורך למדוד המשתנים הללו תוך מניפולצית העירור של קליפת המוח, כדי לבודד את המשתנה הזה מהיבטים אחרים של NREMS.

אנחנו פתחנו מערכת ניסיונית למדידה בו זמנית של פעילות עצבית דרך elecetroencephalogram, מדידת שטף glycolytic דרך biosensor חומצת חלב, והמניפולציה של פעילות עצבית בקליפת מוח מוח באמצעות הפעלת optogenetic של Pyraהנוירונים midal. יש לנו מנוצלים במערכת זו כדי לתעד את היחסים בין צורות גל שינה הקשורות electroencephalographic ואת הדינמיקה מהרגע לרגע של ריכוז חומצת חלב בקליפת המוח. הפרוטוקול עשוי להיות שימושי עבור כל אדם המעוניין ללמוד, במכרסמים מתנהגים בחופשיות, קשר בין הפעילות עצבית שנמדדה ברמת electroencephalographic והאנרגטיקה סלולרית בתוך המוח.

Protocol

1. הכנה כירורגית של בעלי חיים 1. נושאים ניסיוניים השתמש עכברים של קו B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / י המהונדס 9; מתח JAX # 7612) או עכברים אחרים המבטא את הערוץ הכחול הרגיש לאור קטיון, Channelrhodopsin-2, בנוירונים בקל?…

Representative Results

כפי שמוצג באיור 2, עכבר המצויד לגירוי optogenetic וחומצת חלב / EEG / איסוף נתוני EMG עבר מעברי שינה / בעקבות ספונטניים מדינה תוך ריכוז חומצת חלב מוח EEG, EMG והיו במעקב רציף. נוכחיים בחיישן חומצת החלב מוגבר בתקופות של משרעת EEG נמוכה וירידה בתקופות של משרעת EEG ג?…

Discussion

השיטות שהוצגו כאן מאפשרים אחד כדי למדוד את הקשר בין שינה ושינויים בריכוז המוח של חומצת חלב ביניים glycolytic על ציר זמן אינו אפשרי בעבר. בעלי חיים עוברים מעברים ספונטניים בין התעוררות, וNREMS REMS. יתר על כן, אנו מסוגלים להחיל גירויי optogenetic תוך חיים עוברים המעברים האלה. נתונים ש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר מומן על ידי משרד ההגנה (ביטחון סוכנות לפרויקטי מחקר מתקדם, פקולטת פרס צעיר, מספר גרנט N66001-09-1-2117) וNINDS (R15NS070734).

Materials

Component Company Catalogue number Comments (optional)
BASi Mouse Guide Cannula Pinnacle Technology/BASi Inc 7032  
Lactate Biosensor Pinnacle Technology 7004  
Head Mount Pinnacle Technology 8402  
Sleep/Biosensor Recording system Pinnacle Technology 8400-K1-SL 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor
Tethered Mouse in-vitro Calibration kit Pinnacle Technology 7000-K1-T  
Fiber Optic Guide Cannula Plastics One C312G 21 Gauge Guide Cannula
Dummy Cannula Plastics One C312DC 21 Gauge Dummy
Diamond Fiber Scribe Thorlabs S90W  
Fiber Connector Crimp Tool Thorlabs CT042  
Furcation Tubing Thorlabs FT030 03.0 mm
  Thorlabs T10S13 Max Dia. 0.012
Furcation Tube Stripper Thorlabs FTS3  
Bare Hard Cladding Multimode Fiber Thorlabs BFL37-200 200 μm Core, 0.37 NA
Wire Snips/Kevlar Shears Thorlabs T865  
Fiber Optic Epoxy Thorlabs F112  
Fiber Stripper Tool Thorlabs    
Glass Polishing Plate Thorlabs CTG913  
Rubber Polishing Pad Thorlabs NRS913  
Eye Loupe Thorlabs JEL10  
Kim Wipes Thorlabs KW32  
Compressed Air Thorlabs CA3  
Polishing Puck Thorlabs D50-xx  
Fiber Inspection scope Thorlabs CL-200  
Polishing Films Thorlabs LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P  
FC/PC connector end Thorlabs 30126G2-240 240 μm Bore, SS Ferrule
MC Stimulus Unit Multi-Channel Systems STG-4002  
MC Stimulus Software Multi-Channel Systems MC-Stimulus V 2.1.5  
Blue Laser CrystaLaser CL473-050-0  
Laser Power supply CrystaLaser CL2005  
Fiber Optic Rotary Joint Doric Lenses FRJ-v4  
      Table 2. Supplies and equipment.

References

  1. Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).
  2. Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
  3. Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
  4. Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
  5. Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
  6. Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).
  7. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
  8. Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
  9. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  10. Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
  11. Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
  12. El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
  13. Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
  15. Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
  16. Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  17. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).
  18. Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
  19. Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).

Play Video

Cite This Article
Clegern, W. C., Moore, M. E., Schmidt, M. A., Wisor, J. Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (70), e4328, doi:10.3791/4328 (2012).

View Video