Summary

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Published: December 19, 2012
doi:

Summary

Een procedure beschreven voor het manipuleren van de activiteit van cerebrale corticale piramidale neuronen optogenetically terwijl de elektro, elektromyogram en cerebrale lactaatconcentratie bewaakt. Experimentele opnamen worden uitgevoerd op kabel-tethered muizen, terwijl ze ondergaan spontane slaap / waak cyclus. Optogenetic apparatuur geassembleerd in ons laboratorium controleapparaat handel verkrijgbaar.

Abstract

Hoewel de hersenen minder dan 5% van het lichaam massa, gebruikt het ongeveer een kwart van de glucose door het lichaam in rust 1. De functie van niet rapid eye movement slaap (NREMS), het grootste deel van de slaap door de tijd, is onzeker. Echter een opvallend kenmerk van NREMS een significant verlaagd van cerebrale glucosegebruik opzichte van waakzaamheid 2-4. Deze en andere bevindingen hebben geleid tot de wijdverbreide opvatting dat de slaap een functie met betrekking tot cerebrale metabolisme dient. Toch is de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vermindering van de cerebrale glucosemetabolisme tijdens NREMS nog worden opgehelderd.

Een fenomeen dat geassocieerd met NREMS cerebrale metabolisme kan beïnvloeden is de aanwezigheid van trage golven, trillingen bij frequenties lager dan 4 Hz, in het elektro 5,6. Deze trage golven waargenomen op het niveau van de schedel of cerebrale corticale oppervlak weerspiegelen deoscillaties van de onderliggende neuronen tussen een gedepolariseerde / omhoog staat en een gehyperpolariseerde / down toestand 7. Tijdens de beneden staat, moet cellen ondergaan actiepotentialen voor intervallen van maximaal enkele honderden milliseconden. Herstel van ionische concentratie gradiënten na actiepotentialen is een belangrijke metabole belasting van de cel 8; afwezigheid van actiepotentialen tijdens beneden die geassocieerd worden met NREMS kunnen bijdragen tot een vermindering van de stofwisseling ten opzichte van wakker.

Twee technische uitdagingen moest worden aangepakt om voor deze hypothetische relatie te testen. Eerste moest cerebrale glycolytisch metabolisme meten met een tijdsresolutie afspiegeling is van de dynamiek van de cerebrale EEG (dat wil zeggen over seconden in plaats van minuten). Hiertoe maten we de concentratie van lactaat, het product van aerobe glycolyse en derhalve een indicatie van de snelheid van glucosemetabolisme in de hersenen van muizen. Lactaat isgemeten met een lactaatoxidase gebaseerde real time sensor ingebed in de frontale cortex. De detectie mechanisme bestaat uit een platina-iridium elektrode omgeven door een laag van lactaatoxidase moleculen. Metabolisme van lactaat door lactaatoxidase produceert waterstofperoxide, die een stroom produceert in de platina-iridium elektrode. Dus een intensifiëring van cerebrale glycolyse wordt een toename in de concentratie van substraat voor lactaatoxidase, die vervolgens in verhoogde stroom gereflecteerd onder meetelektrode. Het was bovendien noodzakelijk om deze variabelen te meten tijdens het manipuleren van de prikkelbaarheid van de cerebrale cortex, om deze variabele isoleren van andere facetten van NREMS.

We bedachten een experimenteel systeem voor gelijktijdige meting van neuronale activiteit via de elecetroencephalogram, meting van de glycolytische flux via een lactaat biosensor, en manipulatie van cerebrale corticale neuronale activiteit via optogenetic activering van PyraMIDAL neuronen. We hebben dit systeem gebruikt om de relatie tussen slaapgerelateerde elektro golfvormen en het moment tot moment dynamiek van lactaatconcentratie in de cerebrale cortex documenteren. Het protocol kan nuttig zijn voor elk individu geïnteresseerd in het bestuderen in vrij gedragen knaagdieren, de relatie tussen neuronale activiteit gemeten op de elektro-niveau en cellulaire energetica in de hersenen.

Protocol

1. Chirurgische Voorbereiding van de dieren 1. Experimentele Onderwerpen Gebruik van de muizen B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgene lijn 9; JAX stam # 7612) of muizen die het blauwe lichtgevoelige kationenkanaal, Channelrhodopsin-2, in cerebrale corticale neuronen. Toepassing van blauw licht naar de cerebrale cortex van de B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J transgene lijn zorgt ervoor dat de piramidale neuronen die Channelrhodopsin-2 te depolari…

Representative Results

Zoals getoond in figuur 2, een muis uitgerust voor optogenetic stimulatie en lactaat / EEG / EMG verzamelen van gegevens onderging spontane slaap / waak-overgangen tijdens het EEG, EMG en cerebrale lactaat concentratie werden continu bewaakt. Stroom bij de lactaat-sensor verhoogd tijdens periodes van lage amplitude EEG en nam af tijdens perioden van hoge amplitude EEG. Zoals getoond in figuur 3, beide kanalen van de EEG reageren op stimuli optogenetic geleverd i…

Discussion

De werkwijzen die hier doen vrezen relatie tussen slaap en veranderingen in de hersenen concentratie van de glycolytische tussenproducten lactaat meten op een tijdschaal niet eerder mogelijk was. Dieren ondergaan spontane overgangen tussen kielzog, NREMS en REMS. Bovendien zijn we in staat om optogenetic stimuli toe te passen terwijl de dieren ondergaan deze overgangen. Verzameld tot op heden dat spontaan en geïnduceerde golven invloed op het uitlezen van een lactaatoxidase gebaseerde biosensor tonen.

<p class="jov…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Onderzoek gefinancierd door het Ministerie van Defensie (Defense Advanced Research Projects Agency, Young Faculty Award, Grant Number N66001-09-1-2117) en NINDS (R15NS070734).

Materials

Component Company Catalogue number Comments (optional)
BASi Mouse Guide Cannula Pinnacle Technology/BASi Inc 7032  
Lactate Biosensor Pinnacle Technology 7004  
Head Mount Pinnacle Technology 8402  
Sleep/Biosensor Recording system Pinnacle Technology 8400-K1-SL 2 EEG channels, 1 EMG channel, & 1 biosensor
Tethered Mouse in-vitro Calibration kit Pinnacle Technology 7000-K1-T  
Fiber Optic Guide Cannula Plastics One C312G 21 Gauge Guide Cannula
Dummy Cannula Plastics One C312DC 21 Gauge Dummy
Diamond Fiber Scribe Thorlabs S90W  
Fiber Connector Crimp Tool Thorlabs CT042  
Furcation Tubing Thorlabs FT030 03.0 mm
  Thorlabs T10S13 Max Dia. 0.012
Furcation Tube Stripper Thorlabs FTS3  
Bare Hard Cladding Multimode Fiber Thorlabs BFL37-200 200 μm Core, 0.37 NA
Wire Snips/Kevlar Shears Thorlabs T865  
Fiber Optic Epoxy Thorlabs F112  
Fiber Stripper Tool Thorlabs    
Glass Polishing Plate Thorlabs CTG913  
Rubber Polishing Pad Thorlabs NRS913  
Eye Loupe Thorlabs JEL10  
Kim Wipes Thorlabs KW32  
Compressed Air Thorlabs CA3  
Polishing Puck Thorlabs D50-xx  
Fiber Inspection scope Thorlabs CL-200  
Polishing Films Thorlabs LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P  
FC/PC connector end Thorlabs 30126G2-240 240 μm Bore, SS Ferrule
MC Stimulus Unit Multi-Channel Systems STG-4002  
MC Stimulus Software Multi-Channel Systems MC-Stimulus V 2.1.5  
Blue Laser CrystaLaser CL473-050-0  
Laser Power supply CrystaLaser CL2005  
Fiber Optic Rotary Joint Doric Lenses FRJ-v4  
      Table 2. Supplies and equipment.

References

  1. Magistretti, P., Zigmond, M. J., Bloom, F. E., Landis, S. C., Roberts, J. L., Squire, L. R. Brain Energy Metabolism. Fundamental Neuroscience. , 389-413 (1999).
  2. Maquet, P., et al. Cerebral glucose utilization during sleep-wake cycle in man determined by positron emission tomography and [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose method. Brain Res. 513 (1), 136-143 (1990).
  3. Buchsbaum, M. S., et al. Regional cerebral glucose metabolic rate in human sleep assessed by positron emission tomography. Life Sci. 45 (15), 1349-1356 (1989).
  4. Kennedy, C. Local cerebral glucose utilization in non-rapid eye movement sleep. Nature. 297 (5864), 325-327 (1982).
  5. Pappenheimer, J. R., Koski, G., Fencl, V., Karnovsky, M. L., Krueger, J. Extraction of sleep-promoting factor S from cerebrospinal fluid and from brains of sleep-deprived animals. J. Neurophysiol. 38 (6), 1299-1311 (1975).
  6. Borbely, A. A., Achermann, P., Kryger, M. H., Roth, T., Dement, W. C. Sleep homeostasis and models of sleep regulation. Principles and Practice of Sleep Medicine. , 377-390 (2004).
  7. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Spatiotemporal analysis of local field potentials and unit discharges in cat cerebral cortex during natural wake and sleep states. J. Neurosci. 19 (11), 4595-4608 (1999).
  8. Astrup, J., Sorensen, P. M., Sorensen, H. R. Oxygen and glucose consumption related to Na+-K+ transport in canine brain. Stroke. 12 (6), 726-730 (1981).
  9. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  10. Mateo, C. In Vivo Optogenetic Stimulation of Neocortical Excitatory Neurons Drives Brain-State-Dependent. Curr. Biol. , (2011).
  11. Wisor, J. P., Clegern, W. C. Quantification of short-term slow wave sleep homeostasis and its disruption by minocycline in the laboratory mouse. Neurosci. Lett. 490 (3), 165-169 (2011).
  12. El Yacoubi, M., et al. Behavioral, neurochemical, and electrophysiological characterization of a genetic mouse model of depression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6227-6232 (2003).
  13. Tsunematsu, T., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J. Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Le, S., Gruner, J. A., Mathiasen, J. R., Marino, M. J., Schaffhauser, H. Correlation between ex vivo receptor occupancy and wake-promoting activity of selective H3 receptor antagonists. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325 (3), 902-909 (2008).
  15. Burmeister, J. J., Palmer, M., Gerhardt, G. A. L-lactate measures in brain tissue with ceramic-based multisite microelectrodes. Biosens. Bioelectron. 20 (9), 1772-1779 (2005).
  16. Cardin, J. A. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat. Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  17. Destexhe, A., Contreras, D., Steriade, M. Cortically-induced coherence of a thalamic-generated oscillation. Neuroscience. 92 (2), 427-443 (1999).
  18. Liu, Z. W., Faraguna, U., Cirelli, C., Tononi, G., Gao, X. B. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J. Neurosci. 30 (25), 8671-8675 (2010).
  19. Iwai, Y., Honda, S., Ozeki, H., Hashimoto, M., Hirase, H. A simple head-mountable LED device for chronic stimulation of optogenetic molecules in freely moving mice. Neurosci. Res. 70 (1), 124-127 (2011).

Play Video

Cite This Article
Clegern, W. C., Moore, M. E., Schmidt, M. A., Wisor, J. Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (70), e4328, doi:10.3791/4328 (2012).

View Video