Summary
在这里，我们描述了一种方法激活和扩大人类NKT细胞的自体T细胞的人口使用人工抗原提呈细胞（AAPC）。 CD1D基于人工APC提供了使用功能的NKT细胞产生高的标准方法。
Abstract
自然杀伤T（NKT）细胞是一种独特的子集T细胞，自然杀伤（NK）细胞和T细胞的特征性标记物显示。不同于传统的T细胞，NKT细胞识别脂质抗原CD1分子2的上下文中。 NKT细胞的表达一个不变的TCRα链重新排列：Vα14Jα18在小鼠和Vα24Jα18的在人类中，这是与有限的多样性的Vβ链3-6，以及被称为作为规范的或不变的NKT细胞（ⅰNKT细胞）。类似传统的T细胞，NKT细胞从CD4-CD8-胸腺前体T细胞发展CD1D 7适当的信令。利用NKT细胞，用于治疗目的的潜力已显着增加的能力，以刺激和扩大人类NKT细胞的α-半乳糖（α-神经酰胺），以及各种细胞因子8。更重要的是，这些细胞保留了原有的phenotypE，分泌细胞因子，并显示抗肿瘤细胞系的细胞毒性功能。因此， 体外扩增 NKT细胞保持功能和可用于过继性免疫治疗。然而，基于NKT细胞的免疫已限制使用自体的抗原呈递细胞和刺激细胞的数量和质量，这些基本上可以变化。已报道从癌症患者的单核细胞衍生的DC的共刺激分子的表达水平降低，并产生较少的炎性细胞因子9,10。事实上，已被用于小鼠DC而不是自体的APC从CML患者11 NKT细胞的功能进行测试。然而，这种系统只能被用于在体外测试，因为NKT细胞不能进行扩展，由小鼠DC，然后用于过继性免疫治疗。因此，标准化的系统依赖于人工抗原提呈细胞（AAPC）可能产生的刺激效果的DC没有的缺陷，异体或异种CELLS 12，13。在这里，我们描述了一种的方法产生CD1D基于人工APC。由于CD1D - 抗原复合物的T细胞受体（TCR）的参与是一个基本的要求，NKT细胞活化抗原：CD1D免疫球蛋白复合物提供了一种可靠的方法来隔离，激活和扩大效应NKT细胞群。
Protocol
1。生成AAPC
- 在添加蛋白质珠，准备好所有试剂和缓冲液：0.1M 硼酸盐缓冲液 ，1X D-PBS（没有的Ca 2 +和Mg 2 +）; 珠洗涤缓冲液 （1X PBS +5％人AB血清+ 0.02％的叠氮化钠） ; 完全培养基 （RPMI培养基100 mM的丙酮酸钠，10mM的非必需的维生素溶液，100mM的MEM维生素溶液，1％2 -巯基乙醇，10μM环丙沙星，5％人AB血清）; MACS缓冲液 （1 L的PBS的免费的Ca 2 +和Mg 2 +，5克BSA，和2毫摩尔EDTA）。
- 漂洗1毫升的Dynabeads M-450环氧树脂珠与3毫升无菌的0.1M硼酸盐缓冲液（硼酸和水，pH 7.0-7.4）中，在5毫升清楚硼硅酸盐玻璃螺纹样品瓶。
- 在一个单独的1.5 ml离心管中，加100微克hCD1d-Ig的二聚体和20μg共刺激分子（例如：抗CD28mAb）至1 ml PBS W / O型的Ca 2 +和Mg 2 +。 <李>将磁铁和吸出的硼酸盐缓冲液珠的珠含玻璃小瓶。从步骤1.2玻璃瓶和蛋白质混合物更换帽。立即颠倒瓶子混合，用封口膜覆盖帽，并将其放置在旋转器上，并于4℃孵育过夜。
- 第二天，代替玻璃小瓶中的磁铁和除去蛋白质的混合物中，同时小心地避免珠。洗磁珠通过加入3ml珠洗涤缓冲液（PBS中，用5％AB血清的0.02％叠氮化钠），并在4℃下孵育5分钟，在旋转器上。重复两次。
- 珠可以被存储在此珠洗涤混合物。为了使功能性人工APC，取出一小等分，并用血球计数珠。检查，蛋白质稳定地加载到珠粒通过染色的抗体（例如，PE标记的抗小鼠IgG1），进行流式细胞仪分析。
- 要加载珠抗原，去除5×10 7珠，并添加一个小的1.5毫升的玻璃小瓶中，用1毫升无菌PBS冲洗珠。 ŕesuspend 1毫升无菌PBS洗珠，并添加抗原，例如：Loadα-GalCer/KRN7000（20,10,5）。 *注：虽然，我们并没有发现任何问题与脂溶性或胶束的形成，血脂，应按照制造商的建议。具体而言，KRN7000重新溶于DMSO（1mg/ml的）这些研究。 KRN7000和其他糖脂抗原也可以溶解在0.2毫克/毫升PBS中含有0.5％的Tween-20（在37℃下超声处理2小时。）。重要的是 - 人工APC至少48-72小时，使用前需要加载。
2。 CD161 + CD3 +细胞的分离
- 收集外周血单核细胞（PBMC）。 Ficoll密度梯度离心分离从血沉棕黄层或按患者组的淋巴细胞，首先稀释肝素化血液在室温下，用等体积的1X PBS。
- 加入15毫升的Ficoll（温热至室温），50 ml锥形管。慢慢地覆盖25毫升的稀释血液的混合物的聚蔗糖的顶部。在2,000 rpm离心30分钟，在室温下与制动切断。
- 用巴斯德吸管小心地取出淋巴细胞接口（白色环之间的媒体和Ficoll），并转移到一个新的50毫升锥形管。
- 通过填充至50毫升的管在1,500 rpm离心5分钟，用PBS和离心洗涤细胞。丢弃上清液，并结合管从一个单一的个体单管，并再次用20ml PBS洗的外周血单核细胞（PBMC）。然后计算PBMC和重新悬浮在浓度为5×10 7细胞/ ml，在MACS缓冲液（1升PBS免费的Ca 2 +和Mg 2 +，5克BSA，和2毫摩尔EDTA）中。
- 为了分离出的T细胞比例，开始用2毫升10 8个细胞（PBMC），加入100μl泛EasySep人类T细胞富集试剂盒的T细胞丰富的解决方案。在室温下孵育10分钟。 加入100μl的磁性粒子另一个10分钟的溶液中，并在室温下孵育。使终体积的溶剂至2.5毫升，并在紫色磁铁放置在管5分钟。快速倒出到一个15毫升锥形管的CD3 +馏分。
- 洗涤细胞，加入5毫升冷MACS缓冲，数一数，活细胞，FACS染色移出一份。
- 要选择CD161 +细胞，重悬丰富的T细胞在980μL冰冷的MACS缓冲，添加10微克抗CD161单克隆抗体，并在冰箱中孵育10分钟。
- 细胞在4℃下以1,500 rpm离心5分钟。重组细胞沉淀在800μl的MACS缓冲。加入200μl的抗小鼠IgG1微珠孵育10分钟的溶液，于4℃下
- 在此温育步骤，平衡一个LS列通过加入3ml MACS缓冲器。
- 接着，洗涤细胞，在4℃下以1,500 rpm离心5分钟。 RESU花的细胞MACS缓冲液3毫升。到LS MACS分离柱，然后移液管的细胞。请一定要避免产生气泡慢慢移液。通过加入3ml MACS缓冲液冲洗色谱柱。重复两次。
- 加入3毫升新鲜的MACS缓冲和删除列磁铁。把柱子成15毫升锥形管。将柱塞推出的内容，以获得纯化的CD161 + CD3 +细胞。计数NKT细胞富集馏分。你应该有2-4亿个细胞。
3。人工APC介导的NKT细胞扩增
- 设置共培养16毫升完全培养基（完全培养基+，100 U / ml的IL-2）中加入10 6富集CD161 + CD3 + T细胞和10 6人工APC。混合物通过加入160μl/孔最终体积的96孔组织培养处理的聚苯乙烯，U型底的板的低蒸发盖盘。每个第 7天通过加入80μl的新鲜培养基进行培养基更换。
- 收成细胞，计数，并进行FACS染色12日至14日。
- 如上所述在步骤3.1中，可以扩大的NKT细胞再接种，特别是重悬在16毫升完全培养基的10 6扩展的T细胞和10 6人工APC。盘通过添加160μl/孔96孔U型底的板的混合物。继续刷新共存培养基中每一个第 7天通过加入80μl的新鲜培养基。
- 最好是冻结额外的NKT细胞的膨胀后的第二轮（1×10 6/1毫升5％二甲基亚砜/ 95％FBS的离心管中。）
4。功能测试：的人工APC介导的刺激NKT细胞
- 设置为5×10 4的NKT细胞/孔5×10 5在200μl的最终体积（完全培养基），在96孔U型底的板中的人工APC。
- 24-48小时后收获细胞培养上清ELISA。
Representative Results
我们在此描述了一种方法，用于产生CD1D-Ig的基于人工APC，由CD1D-Ig和抗-CD28单克隆抗体共价偶联到磁珠刺激NKT细胞，NKT细胞（ 图1）的传播作为一个标准化的方法。首先， 1必须展示出CD1D-Ig融合蛋白质被稳定地固定到表面的磁珠。如示于图2A中 ，CD1D-Ig和抗-CD28抗体的磁珠的表面上均表示。要检查的人工APC的刺激能力，我们NKT细胞共培养的杂交瘤与人工APC过夜，收获培养物上清液和测定IL-2的生产通过ELISA。我们发现基于CD1D-Ig的人工APC能够刺激NKT细胞的杂交瘤在水平等于或高于它们的细胞（ 图3中 ，数据未示出）。有趣的是，我们发现，我们的小鼠NKT细胞杂交瘤AAPC人CD1D（FI刺激gure 2B），它提供了简单的方法，用于测试每批人工APC。
接下来，我们试图证明的繁殖潜力的人工APC，从外周血中分离出这样的人的T细胞。首先，CD161 + CD3 + T细胞磁珠分离富集馏分。然后，将T细胞与α-神经酰胺加载人工APC刺激双周。更重要的是，我们发现，即使具有相对低的初始NKT细胞种群（0.03％），我们能够扩大细胞〜67％Vα24+Vβ11+（ 图3）。我们已经扩大了NKT细胞从许多健康志愿者和癌症患者的外周血单个核细胞，并发现，α-神经酰胺装AAPC能在这两个群体中的NKT细胞群扩大。值得一提的是，捐助的扩张速度是非常依赖。正如预期的那样，较高的初始种群中的Vα24+细胞的百分比越大的膨胀。另外，当使用200万细胞起始人口的CD161 + CD3 + T细胞，可以得到> 10 7细胞的扩张两轮后（ 表1）。大约80-90％的膨胀的NKT细胞是CD4 +，〜5％的CD8 +，和剩余的大概是CD4-CD8-双负NKT细胞。这些膨胀的NKT细胞，可用于在图4A-C所示的功能研究。我们已经发现，我们的体外扩增 NKT细胞保持响应于α-GalCer的刺激，和IL-17，TNF-α，IFN-γ和是有效的生产者。应当指出，如果初始的T细胞富集人口是低的，并且一个是无法执行所述第二CD161富集步骤，的人工APC-介导的扩张可能不会产生预期的结果（参见图4D，供体1）。但是，如果循环NKT细胞的百分比是高于0.1％，一应仍是能够获得显着的膨胀的 i NKT细胞。总的来说，这些数据表明，CD1D基于人工APC可以用来有效地扩大和刺激主要的NKT细胞。
图1。示意图CD1D：基于Ig的的AAPCS胞外部分的CD1D分子的恒定区的融合到由一个短的氨基酸接头分离的免疫球蛋白重链蛋白质。这些分子可以很容易地加载与脂质抗原，如α-神经酰胺，简单地通过培养用过量的脂质的兴趣。人工APC作了耦合CD1D-Ig和抗-CD抗体磁珠。在这个系统中，CD1D-Ig的用于通过TCR和抗-CD28单克隆抗体提供共刺激信号，以提供的同源抗原特异性信号。
图2。 FACS染色AAPCS表面蛋白A）AAPCS CD1D：IgG抗体二聚体存在（通过与PE标记的抗小鼠IgG1染色）以及抗-CD28抗体（使用FITC标记的抗小鼠IgG2a）进行了测试，打开直方图显示同型对照;填充柱状图代表指定的抗体。 CD1D-Ig的表达人工APC可以刺激NKT细胞的IL-2产生。 B）Vα14+鼠标NKT细胞杂交，DN32.D3，无论是中等，可溶性抗原（α-神经酰胺），卸载AAPC或α-神经酰胺加载AAPC共培养。收获培养物上清液，并使用标准夹心ELISA测定IL-2产生。
图3。 CD1D-Ig的涂层人工抗原递呈细胞，NKT细胞的扩展。 （A）主CD3 + CD161 +双阳性细胞的分离从外周血单个核细胞，利用磁分离。排序条件刺激细胞与α-GalCer的加载，14天CD1D-Ig的涂层人工APC。将细胞染色为Vα24和Vβ11以下的人工APC刺激。 （B）的B细胞淋巴瘤线主要的人类NKT细胞介导的裂解。 C1R-CD1D NKT细胞孵育的细胞在存在或不存在的抗原，神经酰胺（100毫微克/毫升），在20-24小时的96孔U型底的板在所指示的比率。 NKT细胞介导的细胞裂解液进行了评估标准的51Cr释放法。
图4。的人工APC扩展NKT细胞的细胞因子。 5 /孔），共培养与可溶性α-神经酰胺，PMA /离子霉素，anti-CD3/28微球，或α-神经酰胺装AAPC后（2×10 5 /孔）48小时。 （A）的IL-17A，（B）的TNF-α，和（C）的IFN-γ的产生是由标准的细胞因子ELISA测定。显示的数据是减去阴性对照组（媒体和空珠）后的净细胞因子的产生。 （D）原发性T细胞的分离外周血单核细胞磁珠分离。刺激了两个星期的指示，神经酰胺加载人工APC细胞。细胞进行染色，采用ABS具体的Vα24+Vβ11+，并用流式细胞仪分析。
Discussion
AAPC可以用来研究NKT细胞激活的基本要求和体外扩增的NK T细胞过继免疫治疗中具有潜在的临床价值。 mescher 等人描述的第一胎圈的系统，其中生物素化的小鼠MHC I类肽的单链结构，B7.1和B7.2通过链霉抗生物素蛋白与生物素化的共刺激分子结合的胶乳微球体14，15的表面。这种方法已被成功地使用从转基因小鼠的抗原特异性T细胞刺激。此外，由于此方法使用了一个单链，以确保均匀的负荷的MHC分子的MHC-肽复合物，每个目标肽抗原将需要一个新的表达所需的单链MHC-肽复合物的转染，从而限制的一般性的的方法。更重要的是，施内克博士的研究小组首创的珠基于人工APC，开发另一种非基于细胞珠的人工APC，由耦合到磁珠上的HLA-Ig的，信号1，和抗-CD28，信号2，。 HLA-Ig的，通过他的研究小组开发的一个独特的多聚体形式的免疫球蛋白分子的支架16，17的稠合的HLA。随后，他们开发的MHC-Ig的基于人工APC，这已被证明有效地扩大CMV和MART-1特异性CTL 18。在这里，我们已经证明，可用于扩展功能的NKT细胞CD1D-Ig的基于人工APC。一项研究使用了一个类似的系统来检查身体的NK细胞的相互作用与CD1D 19。
值得一提的是，我们设计了一个人工抗原呈递细胞，它是适用于任何的要求，我们找到所需的最佳NKT细胞的增殖。人工APC扩展方法提供了一种简单可靠的方法，扩大和丰富人类NKT细胞。我们的人工APC系统评估潜在的共刺激分子的面板的作用，并评估其对NKT细胞增殖的作用，可以修改TION和功能。因此，AAPC一个强大的通用技术，可用于诱导和扩大NKT细胞。 AAPCS需要的产生小于1周，适合用于生产大量珠。然而，生成人工APC的一个关键步骤是，以确认CD1D-Ig的被稳定地固定化的珠的表面上，并评估它们的功能，以确保从批次间的一致性。系统是有一定的局限性，没有一个机制，在关闭刺激，机械拆除的珠子以外的地方。具体而言，卡合的T细胞受体（TCR）与抗原：CD1d/MHC络合物通常生成的免疫突触在演唱会与配件/粘附分子，这可能会导致T细胞和诱导的抑制或抑制因素抗原呈递细胞。在的人工APC系统，这些因素都可能上调的T细胞，但珠不会表达的同源配体这些受体。
此外，CD4 + NKT细胞已显示出抑制在小鼠和人类的抗肿瘤反应，因此，它是可能的非选择性的活化NKT细胞的所有错误的子集（ 即全球刺激与α-神经酰胺）或激活可以导致不想要的免疫学的结果。因此，一个人必须的表型和功能特征的的人工APC发泡NKT细胞种群。正如在图4中所示，我们已发现，表达抗-CD28刺激的α-神经酰胺加载人工APC可以导致NKT细胞产生Th1细胞，Th2细胞，和Th17型细胞因子。小鼠的研究报告说，挑战与IL-33，最近发现的细胞因子，导致循环炎性细胞因子，如IL-5和IL-13水平的提高。治疗的NKT细胞与IL-33增强细胞因子的产生20。 IL-33是ST2中，一个特定的配位体，它已被证明，可溶性ST2约n块IL-33信号。因此，作为将来的应用程序的一个例子，可以人工APC表达ST2产生和使用，以确定是否有一个可以选择性地抑制Th2型细胞因子的生产的，而诱导Th1细胞因子分泌的NKT细胞。也已报道，静脉注射KB-表示人工APC于C57BL / 6小鼠，导致减少的肺转移的肿瘤21。更重要的是，这些数据表明，人工APC交通肺和能够激活效应T细胞亚群。因此，可以生成多种类型的人工APC和检查抗原特异性T细胞亚群之间的相互作用。总之，这些研究表明，CD1D-Ig的基于人工APC可以用来取代正常细胞的APC，和具有的潜力，以提高基于NKT细胞的过继性免疫治疗的目前的临床途径。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢普里Subrahmanyam的有益讨论。作者没有竞争的经济利益。支持这项工作是由美国癌症协会，NIH / NCI K01的CA131487，R21 CA162273 R21 CA162277，和P30肿瘤免疫学和免疫计划，以TJ韦伯的补助。的内容完全是作者的责任，并不一定代表官方意见，国家癌症研究所，美国国立卫生研究院。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
| EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
| Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
| Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
| Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
| Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
| M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
| Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
| RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
| 2-mercapt–thanol | Gibco | ||
| Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
| PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
| PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
| FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
| PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
| PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
| FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
| Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
| IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
| Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
| BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
| Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |
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