Summary
ביוסינתזה Heterologous של אריתרומיצין דרך
Abstract
הייצור של מוצרים טבעיים Heterologous מורכבים הוא גישה שנועדה לתת מענה מגבלות נוכחיות ואפשרויות עתידיות. התכונה זו שימושית במיוחד עבור תרכובות אלה אשר מחזיקים ערך טיפולי, אך לא יכול להיות מיוצרים במידה מספקת או ירוויח מצורה משופרת של ייצור. הפרוצדורות הכרוכות נחלקות לשלושה מרכיבים: 1) העברה גנטית; 2) כינון מחדש Heterologous; ו3) ניתוח מוצרים. כל רכיב ניסיוני הוא תחת אופטימיזציה מתמדת כדי לעמוד באתגרים ולחזות את ההזדמנויות הקשורות לגישה המתפתחת הזה.
ביוסינתזה Heterologous מתחילה בזיהוי של רצף גנטי האחראי למוצר טבעי בעל ערך. העברת רצף זה למארח Heterologous הוא מסובך בשל מורכבות מסלול biosynthetic והאחראיות ליצירת מוצר. אריתרומיצין האנטיביוטיקה הוא דוגמה טובה. עשרים גנים (ההיקף> 50 KB) נדרש לביוסינתזה סופו של דבר. בנוסף, שלושה מהגנים הללו מקודדים megasynthases אנזימים, רב הדומיין של כל אחד ~ 300 KDA בגודל. חומר גנטי זה חייב להיות מתוכנן והועבר לE. coli לביוסינתזה משוחזרת. השימוש בבידוד PCR, בניית אופרון, פלסמידים רבים cystronic, והפיכת אלקטרו שיתואר בהעברת אריתרומיצין מקבץ גנטי לE. coli.
ברגע שהועבר, א ' תא חיידק חייב לתמוך ביוסינתזה סופו של דבר. תהליך זה גם מאתגר בהתחשב בהבדלים המשמעותיים בין ה coli ומארחים המקוריים ביותר האחראים להיווצרות מוצר טבעית מורכבת. התא חייב לספק מצעים דרושים כדי לתמוך ביוסינתזה ומתואם להביע מקבץ הגנטי הועבר לייצר אנזימים פעילים. במקרה של אריתרומיצין, א ' תא חיידק נאלץ להיות מהונדס כדי לספק את שני מבשרים (יחסי הציבורopionyl-CoA ו( 2S)-methylmalonyl-CoA) דרוש לסינתזה. בנוסף, שינויים גנטיים ברצף, מספר העותק פלסמיד, chaperonin שיתוף ביטוי, שינוי אנזימטי לאחר translational וטמפרטורת תהליך היו נדרשו גם כדי לאפשר אריתרומיצין הסופי היווצרות.
לבסוף, הפקה מוצלחת חייבת להיות מוערכת. לאריתרומיצין מקרה, אנחנו נציג שתי שיטות. הראשון הוא כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית מסה (LC-MS) כדי לאשר ולכמת ייצור. הפעילות הביולוגית של אריתרומיצין גם תאושר על ידי שימוש במבדק שבפעילות האנטיביוטיקה נבדקה נגד subtilis Bacillus. מבחני ההערכה קובע אריתרומיצין ביוסינתזה מE. coli ולהכין את הבמה למאמצים הנדסיים עתידיים לשיפור או לגוון וייצור לייצור תרכובות טבעיות מורכבות חדשות באמצעות הגישה הזאת.
Introduction
אריתרומיצין הוא אנטיביוטיקת polyketide מיוצרת על ידי חיידק האדמה Saccharopolyspora erythraea גראם החיובי, והפקה נוכחית כבר השתפרה באופן הדרגתי ל/ ~ 10 ליטר גרם במשך עשרות שנים של mutagenesis המסורתי ופרוטוקולי סינון ולאחרונה באמצעות תוכניות ייעול תהליך 1-6. אסטרטגיות mutagenesis והקרנה שכיחות בפיתוח מוצרים טבעי לאנטיביוטיקה כתוצאה מקשיים בculturing ו / או גנטי מניפולצית מארחי ייצור מקומיים ובגלל הפעילות אנטיביוטית הזמינה או פנוטיפים צמיחה משופרים כדי לסייע בחירה. במקרה של אריתרומיצין, ש ' erythraea מוגבל על ידי פרופיל צמיחה איטי וחוסר טכניקות מניפולציה גנטיות ישירות יותר (יחסית לאורגניזמים כמו E. coli), ובכך, פוגע שיפורים מהירים בייצור וביוסינתזה של נגזרים חדשים. לאחר שזיהה את בעיות ייצור ונעול diversificatiעל אפשרויות עם תרכובות כמו אריתרומיצין, קהילת המחקר החלה לרדוף את הרעיון של ביוסינתזה Heterologous (איור 1) 7. מאמצים אלה עלו בקנה אחד עם מידע רצף זמין לאריתרומיצין אשכול גנים 8-11. יודגש כי מספר אשכולות רצף מורכב טבעיים מוצר גן התרחב מאוד 12-16, מתן התמריץ להמשך המאמצים ביוסינתזה Heterologous לגשת פוטנציאל מרפא מקודד. כדי לעשות זאת, כינון מחדש Heterologous דורש שמארח החדש לענות על הצרכים של מסלול biosynthetic הספציפי. א coli מספק נוחות טכנית, סט רחב של טכניקות המשתרע-ביולוגיה מולקולריות, ואסטרטגיות הנדסיות מטבוליים ותהליך לפיתוח מוצר. עם זאת, בהשוואה למארחי ייצור מקומיים, E. חיידק אינו תערוכה על אותה הרמה של ייצור מוצר טבעי מורכב. לכן היה ידוע אם E. חיידק יכול לשמש כאפשרות מעשית עבור Heterologous ביוסינתזה מוצר טבעית מורכבת. עם זאת, הנחה הייתה כי ה coli יהיה אורגניזם מארח אידיאלי אם אפשר להשיג ביוסינתזה Heterologous.
עם מטרה זו במוחו, מאמצים ראשוניים החלו לייצר aglycone polyketide 6-deoxyerythronolide B (6dEB) דרך ה coli. עם זאת, א 'יליד חילוף חומרים של חיידק לא יכול לספק רמות ניכרות של propionyl-CoA ומבשרים (2S)-methylmalonyl-CoA דרוש כדי לתמוך ביוסינתזה 6dEB לא יכול המארח החדש לאחר translationally לשנות synthase B deoxyerythronolide (ארן) אנזימים. כדי לתקן את הבעיות הללו, מסלול מטבולים המורכבים מילידים ואנזימי Heterologous נבנה לתוך ה coli כאלה שפרופיונאט האכיל exogenously הוסב intracellularly לpropionyl-CoA ולאחר מכן (2S)-methylmalonyl-CoA; בהנדסה כדי להשלים מסלול זה, גן SFP הונח לתוך הכרומוזום דואר של E. coli BL21 (DE3) לייצר זן חדש נקרא BAP1. אנזים SFP הוא מסוגל transferase phosphopantetheinyl של הצמדת cofactor 4'-phosphopantetheine לאנזימי דבס 17,18. השלושה גני דבס (כל אחד ~ 10 ק"ג) היו מניחים בשני וקטורי ביטוי בנפרד לבחירה המכילים מקדמי T7 מושרים. לאחר התאמת מפתח של טמפרטורה לאחר האינדוקציה (עד 22 מעלות צלזיוס), גני דבס התבטאו מתואם בתוך BAP1 במדינה מסוגלת לייצר 19 6dEB פעילה.
המרדף של אריתרומיצין מלא ביוסינתזה אז החל להשתמש באשכול מקביל גן מMicromonospora megalomicea או מסלול היברידי מורכבים מגנים מס erythraea, ש ' fradiae, וס venezuelae שהפיק ביניים אריתרומיצין C ו 6-deoxyerythromycin D, בהתאמה 20-22. לאחרונה, הקבוצה שלנו האריכה מאמצים אלה על ידי ייצור erythromycin (צורה קלינית הרלוונטית ביותר של אריתרומיצין) דרך ה coli. בניגוד לעבודה קודמת, האסטרטגיה שלנו מתואם הביעה 20 ס המקורי גני erythraea דרוש לביוסינתזה polyketide, ביוסינתזה deoxysugar מצורף, חייטות נוספות, והתנגדות עצמית (איור 2). בסך הכל, 26 גנים (יליד וHeterologous) הונדסו כדי לאפשר א coli כדי לייצר אריתרומיצין בשעת 4 מ"ג / ליטר 23,24. תוצאה זו הוקמה ייצור מלא של מוצר טבעי polyketide מורכב באמצעות ה coli, ומשמש כבסיס למינוף אפשרות הייצור החדש הזה, או לפתוח בחדשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטקסט שלהלן הוא ספציפי לאריתרומיצין אנטיביוטיקה, אך השלבים מתוכננים להיות באופן כללי החלים על מוצרים טבעיים אחרים כמועמדים לביוסינתזה Heterologous.
1. אריתרומיצין העברת צביר גנטית
- primers PCR עיצוב כדי להגביר את כל הגנים הקשורים באריתרומיצין מקבץ בתוך ס כרומוזום erythraea. צעד זה הוא ספציפי למועמדים האלה טבעיים המוצר שהרצפים גנטיים כבר נקבעו. לחלופין, את הגנים הנדרשים עשויים להיות מסונתזים (דרך כמה אפשרויות של ספקים מסחריות) עם היתרון שהגנים המסונתזים חדש יהיו מיועדים לשימוש אופטימלי בקודון א 'החדשה מארח coli. אם סינתזת דנ"א הוא רדף, אתגר נוכחי הוא יצירת גני megasynthase אשר עשוי יעלו על 10 ק"ג באורך. מבחינה טכנית, סינתזה יכולה להיות מושלמת, אבל זה מאתגר ויקר. זה צפוי כי improvem המתמידents בטכנולוגיית סינתזת גן יעסוק מגרעות נוכחיות ונוסף לאמת גישה זו למתן חומר Heterologous גנטי.
- לבצע באמצעות PCR ס המוכן טרי הדנ"א הגנומי erythraea כתבנית. ה-DNA הכרומוזומלי עשויה להיות מוכנה מתרבויות של ס erythraea או ממניות קפוא של החיידק (איור 3) 25. תגובות PCR עשויות להפיק תועלת מתוספת של DMSO (4 μl ב 50 תגובות μl) לחשבון לתכולה גבוהה G+ C ביעד ס גני erythraea. כל גן מוגבר צריך להיות רצף כדי לאשר שהגן המלא אוחזרה וכי לא מוטציות שהוכנסו בתהליך ה-PCR.
- דרך לעכל הגבלה וקשירה, הכנס כל אחד מהגנים המבודדים לוקטורי ביטוי שנועדו עבור E. coli (איור 3). זה הוא שיזם עיצוב אתרי הגבלה בתוך primers PCR כדי לאפשר עיכול וקשירה לאקס מתאיםוקטורי דיכאון (למשל נכלל באיור 3). יש לנו להשתמש גם pET21 וpET28 וקטורים. PET28 הווקטור מאפשר הכללת רצף המנהיג 5 'שסייע לביטוי גנים באריתרומיצין מקרה. אשר ביטוי גני הפרט באמצעות RT-PCR, ניתוח SDS-PAGE (באמצעות שברי חלבון מסיסים), או מבחנים פנוטיפי נוחים (איור 4).
- לבנות operons המבוסס על גנים הביעו בהצלחה מפלסמידים ביטוי בודדים (איור 3). אנחנו השתמשנו באופן מסורתי בשילובים של אנזימי הגבלה תואם מלוכדים (כמו SPE אני Xba אני ו) 24 ברצף להמרה לגני operons, עם זאת, האתרים שנבחרו להגבלת בניית אופרון אסור מתגוררים בתוך (או יש להסיר מן) המבודדים רצפי גנים (נושא שיכול להימנע אם סינתזת גן משמשת). צעד זה מאחד 20 אריתרומיצין A גנים לפני E. coli transformation. נכון לעכשיו, יש לנו להשתמש בשיטה זו כדי לכלול עד 20 ק"ג של דנ"א זר לתוך וקטור PET סטנדרטי (שני גנים של ~ 10 ק"ג כל אחת). יתר על כן, יש לנו להשתמש בגישה זו כדי ליצור operons המכיל 9 גנים. לא ידוע בדיוק כמה DNA או כמה גנים יכול להיות משולב בפלסמידים חיית מחמד מסוג, עם זאת, את המדדים שהוזכרו לעיל מספקים התייחסות למערכות מורכבות כמו מסלול biosynthetic אריתרומיצין. לבסוף, סטנדרטי בשלבי קשירת מבחנה וצעדי שינוי מוצלחים שלאחר מכן הופכים לקשה יותר ויותר כאופרון ומגדילת הגודל פלסמיד. טמפרטורת קשירה (12-22 מעלות) וזמן (3-24 שעות) הן מגוונים והפיכת אלקטרו משמשת כדי לסייע בתהליך הפקת פלסמיד מבני קבע.
- להפוך את פלסמידים biosynthetic החדש תוכננו לE. coli להתאמץ BAP1 באמצעות שינוי-אלקטרו (איור 5). ההליך עשוי להיות הניסיון עם פלסמידים הציג שני ברצף או בשיתוףmbination. כאשר הפיכת גודל מסוגל או פלסמידים רבים, יש לנו להשתמש באופן מסורתי, שינוי אלקטרו (בניגוד לשינוי כימי). ברגע ששינה, צלחת התאים במדיום LB מוצק המכיל טטרציקלין (5 מ"ג / ליטר), carbenicillin (100 מ"ג / ליטר), kanamycin (50 מ"ג / הליטר), סטרפטומיצין (50 מ"ג / ליטר), וapramycin (50 מ"ג / ליטר ) כדי לבחור עבור תחזוקת פלסמיד. זה חריג מאוד להשתמש 6 אנטיביוטיקה לאחר שינוי בחירה שונה של א ' תא חיידק, אבל זה פשוט משקף את המספר הכולל של פלסמידים הדרושים כדי לאפשר אריתרומיצין הסופי יוסינתזה. אמנם אפשרי, הגישה תגביל את יכולות ייצור של התרכובת הפעם culturing החל (ראה להלן).
2. א כינון biosynthetic coli
- BAP1 המתח תוכנן כדי לספק את המצעים הדרושים לביוסינתזה ולפרסם-translationally לשנות megasynthase B deoxyerythronolide. גנים בודדים של erythromycin מסלול נבדק על ביטוי גנים ואוחדה operons לתוך פלסמידים ביטוי. קטע זה מוקדש לתרבות לבדיקת תנאים לפעילות מתואמת של אריתרומיצין מלא מסלול.
- קח 3 מושבות נפרדות של BAP1 הפך טרי ולחסן 1.5 תרבויות מיליליטר LB המכילות את אנטיביוטיקת בחירת פלסמיד הדרושה (באותם ריכוזים שצוין לעיל כדי לבחור לtransformants על מדיום מוצק), איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG: 100 מיקרומטר ) וarabinose (2 מ"ג / מ"ל) כדי לגרום לביטוי גנים, ונתרן 20 מ"מ פרופיונאט לתמוך היווצרות מבשר biosynthetic תאית. ברגע שייצור אושר, תרבויות גדולות יותר עשויות להתבצע בניסיון להרחיב ולהגדיל titers המוצר.
- תרבות התאים ב22 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד עבור 24-48 שעות. במקרה זה, בחירת אנטיביוטיקה מבטיחה כי פלסמידים הנדרשים נשמרים בשלבים המוקדמים של התרבות התאית. עם זאת, פלסמידזה עלול ללכת לאיבוד בקלות כמו רמות הבחירה אנטיביוטיות לשנות במהלך תקופת culturing. זה עלול להוביל לחוסר יציבות פלסמיד (כלומר, הפסד של פלסמידים אחד או יותר במהלך התרבות), אשר היו אז להגביל את יכולת ייצור. הבעיה מחריפה כאשר פלסמידים שאינם תואמים משמשים להציג אשכול גני Heterologous מלא. כזה הוא המקרה לאריתרומיצין מתחם (איור 5) ויהיה צורך לתקן באמת שייצור המתחם מE. coli. עם זאת, לצורך הדגמת ייצור ראשוני, פגמי עיצוב כאלה נסבלים למען הקמת ההיתכנות של גישת Heterologous מתוכנן.
- להבהיר את התרבויות על ידי צנטריפוגה בסל"ד 10000 באפנדורף microfuge. הסר את supernatant ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך ניתוח.
- במקרה של אריתרומיצין, חוסר ייצור מתחם היה ממוען על ידי הכללת GroES / EL chaperonin (באמצעות pGro7במיוחד כדי לענות חוסר הפעילות של אנזימים לאחר הביטוי) וההכללה של עותקים של גנים נוספים (לגנים אלה חשודים בביטוי / פעילות חלש). אסטרטגיות דומות עשויות להיות נחוצות במאמצים אחרים Heterologous טבעיים מוצר ייצור.
3. ניתוח מוצר
- כדי לאשר ולכמת אריתרומיצין היווצרות, להזריק supernatant התרבות על LC-MS מערכת (6 איור). אריתרומיצין הזמין מסחרי שמש לייצור ולאשר כסטנדרט בכימות. במקרים ללא סטנדרטים מסחריים זמינים, ניתוח LC-MS ידרוש אפיון כימי נוסף על ידי NMR וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה.
- השווה ייצור בין 3 מושבות / תרבויות מBAP1 טרנספורמציה. בחר את המפיק הגבוה ביותר ולהכין מלאי גליצרול ממקור המושבה. צעד זה יכול להיעשות במקביל לתרבויות הייצור של סעיף פרוטוקול2 באמצעות חלק קטן מהתרבויות להכין מניות גליצרול. אחסן את מניית גליצרול ב° C מקפיא -80.
- השימוש אשרו מניות תא, הגבוהות ביותר לייצור, מתחיל תרבות ייצור נפרדת ולחלץ את supernatant הסופי עם נפח 2x אתיל יצטט. השתמש במערכת אידוי ואקום לייבוש התמצית וresuspend במתנול μl 100. להעביר את התמצית לדיסק מסנן סטרילי (~ קוטר 1/4 אינץ') ולאפשר את הדיסק לייבוש. בנפרד, התרבות ב ' subtillis בנוזל LB בן הלילה. הוסף 20 μl של B. subtilis תרבות עד 20 מ"ל של נוזל אגר LB ב 45 ° C. הצלחת אגר ולאפשר לביסוס. הכנס את הדיסק של המסנן בצלחת ולדגור על 37 מעלות צלזיוס (איור 7). לחלופין, ניתן להוסיף תמצית לתרבויות נוזליות בתוך צלחת 96 היטב כדי לכמת את הפעילות באמצעות קורא צלחת (איור 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה הרצויה של גישה זו היא הייצור של מוצר טבעי לחלוטין מיו ה coli Heterologous מארח. זה מיוצג על ידי מיטב תוצאות LC-MS משמשות כדי לאשר ולכמת ייצור (איור 6) ומבדק אנטיבקטריאלי להשתמש כדי לאשר פעילות סופית (איור 7). במערך הכולל של ביוסינתזה Heterologous, תוצאה זו מגדירה הצלחה. השיג פעם, מאמצי מחקר ואז פונים לאופטימיזציה (שניהם על המאזניים הסלולריים ותהליך) והנדסה מולקולרית. המטרות הסופיות כוללות תהליכי ייצור חסכוניים למתחם והשליטה המקוריים במערכת כך ששינויים רציונליות לתהליך יכולים להתבצע לייצר גרסות של המתחם המקורי עם הפוטנציאל לספקטרום פעילות מוגברת או הרחיב Heterologous.
כישלון לייצר מתחם רצוי, ואז מפעיל תוכניות מגירות רבות to להעריך איזה חלק של הגישה זו אוסרת ביוסינתזה מוצלחת. רבים ממנגנונים אלה לפתרון בעיות, הם במובנה בתוך ההליך שתואר לעיל. מניסיוננו, זה חשוב, לכל הפחות, כדי לאשר את ביטוי גן מוצלח (ניתוח של אנזימים מסיסים biosynthetic SDS-PAGE) של אשכול הגנים שהוצג זה עתה לפני שאנסה להעריך ביוסינתזה של המוצר הטבעי שנוצר. ביטוי הודעה, כאמור, השימוש של מלווי חלבון מתקפלים, מספר עותק גן משופר וטמפרטורת תהליך היה אמצעי יעיל המאפשר ביוסינתזה סופו של דבר.
איור 1. תיאור כללי של תכנית biosynthetic Heterologous המוצרים הטבעית הכולל אריתרומיצין מתחם. השלבים הניסיוניים הנדרשים כוללים 1) עיצוב והעברה של אריתרומיצין גן אשכול frהאום ס erythraea לE. coli, 2) כינון מחדש של ביוסינתזה בתוך E. coli; ו3) ניתוח של מוצר אריתרומיצין א
איור 2. א אשכול גני אריתרומיצין כמאורגן במולדת ס כרומוזום erythraea. ב אריתרומיצין יוסינתזה. בתוך א coli, אנזים SFP נדרש לשינוי posttranslational של DEBS1, 2, 3 ואנזימי synthase polyketide (כל אחד> 300 KDA); זה הוא כונה על ידי זרוע חיבור משויכת לכל תחום של ACP. אנזימי דבס יוצרים 2 β 2 α γ 2 מתחם מחולק ליחידות שמודול לזרז את הצמצומים הרצופים של יחידה אחת המתנע propionyl-CoA ו6 (2-S)-methylmalonyl-יחידות מאריך CoA ליצירת polyketide 6-deoxyerythronolide B (6dEB). KS-ketosynthase; AT-acyl transferase; ACP-acyl חלבון מוביל; KR-ketoreductase (עם KR הפעיל ציין במודול 3); DH-dehydratase; ER-enoyl רדוקטאז; TE-thioesterase. PrpE (synthetase propionyl-CoA) וPCC (carboxylase propionyl-CoA, מורכב משתי יחידות משנת חלבון) נדרשים להמיר פרופיונאט אקסוגניים למצעים מתחילים propionyl-CoA ו( 2-S)-methylmalonyl-CoA. הגנים של SFP וPrpE הונדסו בעבר בתוך BAP1 E. coli כרומוזום 19. מרה של מולקולת 6dEB לאריתרומיצין מושגת על ידי ביוסינתזה deoxysugar המצורף, חייטות נוספות, ואנזימים-התנגדות עצמית. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. בידוד א גנים בודדים הנדרשים לאריתרומיצין ביוסינתזה (למעט השלושה גני דבס). עיצוב פלסמיד פרט כולל primers PCR oligonucleotide משמש לבידוד eryCI; אתרי הגבלת פריימר כבר הצביעו ברצף נועז ומשלים כבר עם קו תחתון. היא כלל גם את ניתוח ההגבלה של pET21 וpET28 וקטורים המתקבלים המכילים גנים וoperons בודדים. B. אני. איחוד גני biosynthetic הדרושים לחייטות polyketide כoperons למבוא לE. אתר coli ii הגבלה ואלמנטי ביטוי אחרים שהיו מעורבים בבנייה ועיצוב אופרון;.. X / S מייצג את הקשירה תואמת המלוכדת שלי Xba וSPE I אתרי שתוצאה ברצף בלתי מוכר חדש או על ידי restrictiבאנזים. לחץ כאן לצפייה בתרשים 3.
איור 4. ניתוח א SDS-PAGE של הגנים הבודדים שהוצגו באיור 3. הכוכביות מציינות הגנים האלה באים לידי ביטוי ברצפי מנהיג 5 'הנובעים מוקטור הביטוי pET28. הערכה פנוטיפי B. מארמי (התנגדות אריתרומיצין). אריתרומיצין בתוך המדיום המוצק המשמש לבדיקת ה זני coli מחסה פלסמידים עם או בלי הארמי אריתרומיצין גן התנגדות. צמיחת התא הציל עם עם ביטוי ארמי.
איור 5. סכמטי א אריתרומיצין מלא מסלול הציג לE. coli, כולל הפלסמיד לGroEL / ES chaperonin (pGro7) ומכיל עותק נוסף של eryK פלסמיד. השוואת טרנספורמציה B. בין שיטות כימיות ואלקטרו באמצעות שני שילוב (i) והקדמת רצף (ii) של פלסמידים. ג יציבות פלסמיד של מתח משתנה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 6. סטנדרטי LC-MS שמץ של אריתרומיצין מופק מE. coli.
איור 7. מבדק א מוצק שלב של דיסקים המכילים מסנן אני. לחלץ מBAP1 א uninduced שליטת coli שלילי; השני אריתרומיצין הזמין מסחרי (ביקורת חיובית);.. וג אריתרומיצין מופקות מושרה BAP1 E. coli מערכת. העדשות היו מצופות על דשא של B. חיידקי subtilis ואזורים כתוצאה של עיכוב מעידים על פעילות אנטיביוטית. Assay ב הוכיח בשלב נוזלי באמצעות דגימות כמובן זמן צלחת 96-כן. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים ביוסינתזה Heterologous הם נתקלו בכל אחת משלוש הנקודות פרוצדורליים בתהליך: 1) העברה גנטית; 2) כינון מחדש biosynthetic; ו3) ניתוח מוצרים. בעיה בכל שלב תהיה לשבש את המטרה הסופית של הקמת ביוסינתזה Heterologous. אולי היבט המאתגר ביותר של התהליך הוא הקמת ביוסינתזה משוחזרת, מאז זה נדרש לחלוטין כדי לאפשר ניתוח מוצלח. עם זאת, כינון מחדש תלוי בעיצוב והעברה מדוקדקים של החומר האחראי לביוסינתזה סופו של דבר הגנטי. כמו כן, הוקם, שיטות אנליטיות רגישות (כמו LC-MS) יכולות לזהות רמות כייל קטנים כי אחר עלולים להתפרש כחוסר ייצור. זה הוא שיאו של המצבים האלה שמעוררים ביוסינתזה Heterologous מאתגר.
בכל קשור לאריתרומיצין דוגמה, רצפי גנים אשרו שבודדו על ידי PCR נבדקו בנפרד עבור expression לפני איחוד הגנים לביטוי מתואם והיווצרות מוצר טבעית. במהלך ניסיונות ראשוניים בניתוח מוצרים, תרכובות ביניים זוהו לראשונה רק כאשר chaperonin (GroEL / ES) היה השותף שהביעה עם אשכול גני החובה. המוצר הסופי הופק רק כאשר עותק נוסף של הגן האחראי לשלב האחרון בביוסינתזה (eryK) נכלל. שני צעדים אלה נהנו משיטת LC-MS אנליטית הרגישה השתמשה בתחילה על מנת להעריך ייצור.
עכשיו שהייצור אושר, א ' רקע סלולרי coli מציע הזדמנויות הנדסיות רבות. הראשון שבם הוא לייעל ייצור של אריתרומיצין יליד מתחם. זה היה מציע מסלול ייצור חלופי עם פוטנציאל חיסכון בזמן תהליך ועלות. יתר על כן, אריתרומיצין מסלול עשוי להיות מתופעל במטרה לגוון את היווצרות מוצר. אנלוגים חדשים להציעפוטנציאל של אנטיביוטיקה חדשה (או טיפולי אחרים) פעילות. אותן הזדמנויות אלה קיימות ליישומים כלליים של ביוסינתזה Heterologous ולספק את המניע העיקרי לגישה, נתמך יותר על ידי האתגרים נתקלו באורגניזמים רבים מייצרים מקוריים. יישומים ושיפורים של הגישה המתוארת במאמר זה מתמשך יגדילו את התדר של הצלחת biosynthetic Heterologous עתיד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מודים NIH (AI074224 וGM085323) וNSF (0712019 ו0924699) למימון לתמיכה בפרויקטים המיועדים לביוסינתזה Heterologous.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
- Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
- McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W.
- Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
- Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
- Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
- Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
- Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
- Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
- Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
- Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
- McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
- Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
- Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
- Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
- Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
- Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
- Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
- Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45 (2007).
- Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
- Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
- Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
- Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).
