De heterologe biosynthese van erythromycine A door<em> E. coli</em> Bevat de volgende experimentele stappen: 1) genetische overdracht, 2) heterologe reconstitutie en 3) productanalyse. Elke stap zal worden toegelicht in de context van de motivatie, potentieel en uitdagingen in het produceren natuurlijke producten met therapeutische<em> E. coli</em> Als surrogaat gastheer.
De heterologe productie van complexe natuurlijke producten is een benadering ontwikkeld om de huidige beperkingen en toekomstige mogelijkheden aan te pakken. Het is bijzonder nuttig voor die verbindingen die therapeutische waarde bezitten, maar niet voldoende geproduceerd of zou profiteren van een verbeterde vorm van productie. De betrokken experimentele procedures kunnen worden onderverdeeld in drie componenten: 1) genetische overdracht, 2) heterologe reconstitutie, en 3) productanalyse. Elke experimentele component is onder voortdurende optimalisatie om de uitdagingen te ontmoeten en te anticiperen op de mogelijkheden in verband met deze opkomende benadering.
Heterologe biosynthese begint met de identificatie van een genetische sequentie die verantwoordelijk is voor een waardevol natuurproduct. Overdracht van deze sequentie een heterologe gastheer wordt gecompliceerd door de biosynthese complexiteit verantwoordelijk voor productvorming. Het antibioticum erytromycine A is een goed voorbeeld. Twintig genen (in totaal> 50 kb) zijn vereist voor eventuele biosynthese. Daarnaast zijn drie van deze genen coderen megasynthases, multi-domein enzymen elk ~ 300 kDa in grootte. Dit genetische materiaal moet zodanig zijn ontworpen en naar E. coli voor gereconstitueerd biosynthese. Het gebruik van PCR isolatie, operon constructie, meerdere cystronic plasmiden en electro-transformatie worden beschreven in de overdracht van erytromycine A genetische cluster E. coli.
Het overgezette E. coli cel moet ondersteunen uiteindelijke biosynthese. Dit proces wordt ook uitdagend, gezien de grote verschillen tussen E. coli en meest originele gastheren die verantwoordelijk zijn voor complexe natuurlijke producten formatie. De cel moet noodzakelijk substraten biosynthese ondersteunen en gecoördineerd overgedragen drukken de genetische cluster actieve enzymen. In het geval van erythromycine A, de E. coli cel moest worden ontworpen om de twee voorlopers (pr biedenopionyl-CoA en (2S)-methylmalonyl-CoA) vereist voor biosynthese. Daarnaast werden gensequentie wijzigingen plasmide kopienummer, chaperonine co-expressie, post-translationele modificatie enzymatische en procestemperatuur ook vereist om definitief erythromycine A mogelijk formatie.
Tenslotte moet succesvolle productie worden beoordeeld. Voor het erythromycine A geval we twee methoden. De eerste is vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) te bevestigen en te kwantificeren productie. De bioactiviteit van erytromycine A wordt ook bevestigd door het gebruik van een biologische bepaling waarbij de antibiotische activiteit getoetst Bacillus subtilis. De beoordeling assays vestigen erythromycine A biosynthese van E. coli en de weg geëffend voor toekomstige engineering inspanningen te verbeteren of te diversifiëren productie en voor de productie van nieuwe complexe natuurlijke verbindingen met behulp van deze aanpak.
Erythromycine A is een polyketide antibioticum geproduceerd door de Gram-positieve bacterie Saccharopolyspora erythraea, en de lopende productie is stapsgewijs verbeterd ~ 10 g / L door decennia van traditionele mutagenese en screening protocollen en recenter door procesoptimalisatie's 1-6. Mutagenese en screening strategieën voor in natuurlijke antibiotica productontwikkeling als gevolg van moeilijkheden bij het kweken en / of genetisch manipuleren natieve productie gastheren en omdat beschikbaar antibiotische werking of verbeterde groei fenotypen aan selectie steun. In het geval van erythromycine A, S. erythraea wordt begrensd door een langzame groei profiel en het ontbreken van meer directe genetische manipulatietechnieken (vergeleken met organismen zoals E. coli), dus belemmert snelle verbetering van de productie en de biosynthese van nieuwe derivaten. Na opname van de productie problemen en ontgrendeld diversificatiop mogelijkheden verbindingen zoals erythromycine A, onderzoekers begon het idee van heterologe biosynthese (figuur 1) 7 oefenen. Deze inspanningen samen met de beschikbare sequentie-informatie voor de erythromycine A gencluster 8-11. Benadrukt moet worden dat het aantal van opeenvolgende complexe natuurlijke product genclusters sterk is 12 tot 16 uitgebreid, die de aanzet tot verdere inspanningen in heterologe biosynthese om gecodeerde therapeutische kracht te openen. Hiertoe heterologe gereconstitueerd de nieuwe gastheer de behoeften van de specifieke biosynthetische route. E. coli biedt technische gemak, een breed verspreid set van moleculair-biologische technieken, en metabole en procestechniek strategieën voor productontwikkeling. Maar vergeleken met natief productie gastheren, E. coli vertoont niet dezelfde mate van complexe natuurlijke product productie. Het was dan ook niet bekend of E. coli kan dienen als een haalbare optie voor heterologe complexe natuurlijke product biosynthese. Er werd aangenomen dat E. coli zou ideaal zijn als gastheerorganisme heterologe biosynthese kon worden.
Met dit doel voor ogen, de eerste pogingen begonnen de polyketide aglycon produceren 6-deoxyerythronolide B (6dEB) tot en met E. coli. Echter, inheemse E. coli metabolisme konden geen aanzienlijke niveaus van propionyl-CoA en (2S)-methylmalonyl-CoA precursors nodig 6dEB biosynthese ondersteunen noch kon de nieuwe gastheer posttranslationeel wijzigen deoxyerythronolide B synthase (DEBS) enzymen. Om deze problemen te verhelpen werd een metabolische route uit natieve en heterologe enzymen ingebouwd in E. coli zodanig dat exogeen gevoed propionaat intracellulair omgezet tot propionyl-CoA en (2S)-methylmalonyl-CoA, tijdens de engineering Dit pad voltooien werd een sfp gen geplaatst in the chromosoom van E. coli BL21 (DE3) een nieuwe stam te produceren BAP1 genoemd. Het enzym is een Sfp phosphopantetheinyl transferase kan bevestigen van de 4'-cofactor phosphopantetheine de DEBS enzymen 17,18. De drie DEBS-genen (elk ~ 10 kb) werden daarna afzonderlijk op twee selecteerbare expressievectoren die induceerbare T7 promoters. Na een correctiesleutel na inductie van temperatuur (22 ° C) werden de DEBS-genen die binnen gecoördineerd BAP1 in een actieve toestand kunnen genereren 6dEB 19.
Het streven naar volledige erytromycine A biosynthese begon toen met een analoog gencluster van Micromonospora megalomicea of een hybride pad bestaat uit genen van S. erythraea, S. fradiae, en S. venezuelae die de tussenproducten erythromycine C en 6-D deoxyerythromycin respectievelijk 20-22 geproduceerd. Onlangs heeft onze groep uitgebreid deze inspanningen door het produceren van erythromycin A (de meest klinisch relevante vorm van erythromycine) tot en met E. coli. In tegenstelling tot eerder werk, onze strategie gecoördineerd sprak de 20 originele S. erythraea genen die nodig zijn voor polyketide biosynthese, deoxysugar biosynthese en gehechtheid, extra tailoring, en zelf-weerstand (figuur 2). In totaal werden 26 (autochtone en heterologe) genen ontworpen om E. coli tegen erytromycine A produceren bij 4 mg / L 23,24. Dit resultaat vastgesteld volledige productie van een complex polyketide natuurlijk product met E. coli en dient als basis om gebruik te maken van deze nieuwe productie-optie of de uitoefening van nieuwe.
Kritische stappen in heterologe biosynthese worden aangetroffen in elk van de drie procedurele punten in het proces: 1) genetische overdracht, 2) biosynthetische reconstitutie en 3) productanalyse. Een probleem in elk stadium zal ontsporen het uiteindelijke doel van de oprichting van heterologe biosynthese. Misschien het moeilijkste aspect van het proces is het vaststellen gereconstitueerde biosynthese, aangezien dit absoluut noodzakelijk voor succesvolle analyse mogelijk is. Echter reconstitutie is afhankelijk zorgvuld…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken de NIH (AI074224 en GM085323) en NSF (0712019 en 0924699) voor financiering van projecten gericht op heterologe biosynthese te ondersteunen.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
Electroporator | BioRad | Micropulser | |
IPTG | Fisher | BP1620 | |
Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
L-arabinose | Sigma | A3256 | |
Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |