التركيب الحيوي من A مغاير من خلال الاريثروميسين<em> E. القولونية</em> تتضمن الخطوات التالية التجريبية: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة مغاير، و 3) تحليل المنتج. وسيتم شرح كل خطوة في سياق الدافع، وإمكانات، والتحديات في إنتاج المنتجات الطبيعية العلاجية باستخدام<em> E. القولونية</em> كمضيف بديلة.
إنتاج مغاير للمنتجات الطبيعية المعقدة هو نهج مصممة لمعالجة أوجه القصور الحالية واحتمالات المستقبل. انها مفيدة بشكل خاص لتلك المركبات التي تمتلك قيمة علاجية ولكن لا يمكن تصنيعها بشكل كاف أو أن تستفيد من نموذج تحسين الإنتاج. ويمكن تقسيم الإجراءات التجريبية المعنية إلى ثلاثة عناصر: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة مغاير، و 3) تحليل المنتج. كل مكون التجريبية التحسين المستمر تحت لمواجهة التحديات والفرص المرتبطة توقع مع هذا النهج الناشئة.
غيروي الحيوي يبدأ تحديد تسلسل الجيني المسؤول عن المنتجات الطبيعية القيمة. نقل هذا التسلسل لمجموعة مغايرة من قبل معقد تعقيد مسار السكروز المسؤولة عن تشكيل المنتج. والاريثروميسين المضادات الحيوية A هو مثال جيد. الجينات والعشرين (مطلوبة مجموعها> 50 KB) لالحيوي في نهاية المطاف. وبالإضافة إلى ذلك، ثلاثة من هذه الجينات ترميز megasynthases، متعددة المجالات الانزيمات ~ 300 كيلو دالتون كل في الحجم. يجب أن تصمم هذه المواد الجينية ونقل إلى E. الإشريكية لالمعاد الحيوي. وسيتم وصف استخدام العزل PCR، والبناء OPERON، البلازميدات متعددة cystronic، والتحول الكهربائية في نقل الاريثروميسين A الكتلة الجينية لE. القولونية.
نقل مرة واحدة، E. يجب أن خلية دعم القولونية الحيوي في نهاية المطاف. كما أن هذا عملية صعبة نظرا للاختلافات جوهرية بين E. ومعظم المضيفين القولونية الأصلي المسؤولة عن تشكيل مجمع المنتج الطبيعي. يجب توفير ركائز الخلية اللازمة لدعم الحيوي والتعبير عن coordinately الكتلة نقل الوراثية لإنتاج الانزيمات النشطة. في حالة وجود الاريثروميسين، وE. كان خلية بكتيريا أن هندستها لتوفير السلائف اثنين (العلاقات العامةopionyl، لجنة الزراعة و(2S)-ميثيل، لجنة الزراعة) اللازمة لالحيوي. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة أيضا تعديلات تسلسل الجينات، البلازميد في عدد النسخ، chaperonin شارك في التعبير، بعد التعديل متعدية الأنزيمية، ودرجة الحرارة للسماح عملية الاريثروميسين النهائي A التشكيل.
وأخيرا، يجب تقييم الإنتاج الناجحة. لالاريثروميسين A الحالة، سوف نقدم طريقتين. الأول هو السائل اللوني الكتلة الطيفي (LC-MS) لتأكيد وتحديد الإنتاج. وأيضا النشاط الحيوي من الاريثروميسين A تأكيد من خلال استخدام الأحيائي التي يتم اختبار فعالية المضاد الحيوي ضد العصوية الرقيقة. والمقايسات تقييم تنشئ الاريثروميسين A الحيوي من E. القولونية ومهدت الطريق لجهود هندسة المستقبل لتحسين أو لتنويع الإنتاج وإنتاج مركبات جديدة الطبيعية المعقدة باستخدام هذا النهج.
الاريثروميسين هو مضاد حيوي A متعدد الكيتيد التي تنتجها إيجابية الجرام بكتيريا التربة Saccharopolyspora قنطريون أحمر، وقد تحسنت تدريجيا الإنتاج الحالي إلى 10 ~ L / ز خلال عقود من الطفرات والبروتوكولات التقليدية الفرز، ومؤخرا من خلال خطط عملية التحسين 1-6. الطفرات وفحص استراتيجيات شائعة في المضادات الحيوية وتطوير المنتجات الطبيعية نتيجة لصعوبات في زراعة و / أو التلاعب وراثيا تستضيف الإنتاج الأصلي وبسبب النشاط المضاد الحيوي متاحة بسهولة أو الظواهر تحسن النمو لمساعدة الاختيار. في حالة وجود الاريثروميسين، S. ويقتصر قنطريون أحمر من قبل الملف النمو البطيء وعدم وجود أكثر مباشرة تقنيات التلاعب الجيني (نسبة إلى الكائنات الحية مثل الإشريكية القولونية)، وبالتالي، عرقلة تحسينات سريعة في الإنتاج والتركيب الحيوي للمشتقات جديدة. بعد أن أدرك قضايا الإنتاج ومقفلة diversificatiعلى الاحتمالات مع مركبات مثل A الاريثروميسين، بدأت الأوساط البحثية لمتابعة فكرة الحيوي غيروي (الشكل 1) 7. تزامنت هذه الجهود مع تسلسل المعلومات المتاحة لالاريثروميسين كتلة الجينات 8-11. ينبغي التأكيد على أن عدد المعقدة الطبيعية التسلسل الجيني مجموعات المنتجات وسعت إلى حد كبير 12-16، توفير الزخم اللازم للاستمرار في الجهود للوصول مغاير الحيوي المحتملة الطبية المشفرة. للقيام بذلك، إعادة مغاير يتطلب أن المضيف الجديد تلبية احتياجات محددة طريق السكروز. E. القولونية توفر الراحة الفنية، ومجموعة واسعة تمتد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية، والهندسة استراتيجيات عملية التمثيل الغذائي وتطوير المنتجات ل. حتى الآن، بالمقارنة مع المضيفين الإنتاج الأصلي، E. القولونية لا يحمل نفس المستوى من مجمع لإنتاج المنتجات الطبيعية. ولم يعرف ما إذا كان ذلك E. يمكن أن تكون بمثابة القولونية الخيار لغيري قابلة للمجمع الحيوي المنتج الطبيعية. ومع ذلك، كان من المفترض أن E. والإشريكية يكون الكائن الحي المضيف المثالي يمكن أن يتحقق إذا الحيوي مغاير.
مع هذا الهدف في الاعتبار، بدأت الجهود الأولية لإنتاج الجزء اللاسكري متعدد الكيتيد 6 deoxyerythronolide B (6dEB) من خلال E. القولونية. ومع ذلك، E. الأصلي يمكن التمثيل الغذائي القولونية لا توفر مستويات ملموس من بروبيونيل، لجنة الزراعة و(2S)-ميثيل، لجنة الزراعة السلائف اللازمة لدعم الحيوي 6dEB ولا يمكن للمضيف جديد بعد translationally تعديل سينسيز B deoxyerythronolide (DEBS) الانزيمات. لمعالجة هذه القضايا، تم بناء المسار الأيضي تتألف من الإنزيمات الأصلية وغير متجانسة إلى E. القولونية بحيث تم تحويل الاحتياطي الفيدرالي خارجيا بروبيونات داخل خلوي لبروبيونيل، لجنة الزراعة وبعد ذلك (2S)-ميثيل، لجنة الزراعة، وخلال الهندسة لاستكمال هذا المسار، وضعت جين SFP في الكروموسوم (ه) من E. ووصف القولونية BL21 (DE3) لإنتاج سلالة جديدة BAP1. الانزيم هو قادر SFP phosphopantetheinyl ترانسفيراز من العامل المساعد إرفاق 4'-phosphopantetheine إلى الإنزيمات DEBS 17،18. ثم وضعت ثلاثة DEBS الجينات (كل ~ 10 KB) على اثنين من ناقلات التعبير بشكل منفصل تحتوي على اختيار محرض المروجين T7. بعد تعديل مفتاح من بعد تحريض درجة الحرارة (C ° إلى 22)، وأعرب عن coordinately الجينات داخل DEBS BAP1 في حالة نشطة قادرة على توليد 6dEB 19.
السعي من الاريثروميسين كامل A الحيوي ثم بدأت باستخدام الجينات كتلة مشابهة من megalomicea البوغانة أو طريقا الهجين يتكون من جينات من S. قنطريون أحمر، S. الفرادية، وS. venezuelae التي أنتجت سيطة الاريثروميسين C و D 6 deoxyerythromycin على التوالي 20-22. في الآونة الأخيرة، وسعت مجموعتنا هذه الجهود من خلال إنتاج erythromفايز A (الشكل الأكثر سريريا ذات الصلة من الاريثروميسين) من خلال E. القولونية. وعلى النقيض من الأعمال السابقة، وأعرب coordinately استراتيجيتنا في 20 S. الأصلي الجينات اللازمة لقنطريون أحمر الحيوي متعدد الكيتيد، deoxysugar الحيوي والمرفقات والخياطة إضافية، وحقها في المقاومة (الشكل 2). في المجموع، تم تصميم 26 (أصلي وغيري) جينات للسماح E. الإشريكية لإنتاج الاريثروميسين A في 4 ملغ / L 23،24. هذه النتيجة التي أنشئت الإنتاج الكامل للمنتج معقد متعدد الكيتيد الطبيعية باستخدام E. القولونية ويخدم كأساس للاستفادة من هذا الخيار إنتاج جديدة أو متابعة جديدة.
واجهت خطوات حاسمة في التركيب الحيوي مغاير في كل من النقاط الثلاث الإجرائية في العملية: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة السكروز، و 3) تحليل المنتج. وهناك مشكلة في أي مرحلة عرقلة الهدف النهائي من إنشاء الحيوي مغاير. ولعل الجانب الأكثر تحديا لعملية التركيب الحيوي وإنشاء المعاد، ح…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر NIH (AI074224 وGM085323) وجبهة الخلاص الوطني (0712019 0924699 و) للحصول على تمويل لدعم مشاريع مخصصة لغيري الحيوي.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
Electroporator | BioRad | Micropulser | |
IPTG | Fisher | BP1620 | |
Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
L-arabinose | Sigma | A3256 | |
Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
Methanol | Sigma | 322415 | |
Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |