Summary
التركيب الحيوي من A مغاير من خلال الاريثروميسين
Abstract
إنتاج مغاير للمنتجات الطبيعية المعقدة هو نهج مصممة لمعالجة أوجه القصور الحالية واحتمالات المستقبل. انها مفيدة بشكل خاص لتلك المركبات التي تمتلك قيمة علاجية ولكن لا يمكن تصنيعها بشكل كاف أو أن تستفيد من نموذج تحسين الإنتاج. ويمكن تقسيم الإجراءات التجريبية المعنية إلى ثلاثة عناصر: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة مغاير، و 3) تحليل المنتج. كل مكون التجريبية التحسين المستمر تحت لمواجهة التحديات والفرص المرتبطة توقع مع هذا النهج الناشئة.
غيروي الحيوي يبدأ تحديد تسلسل الجيني المسؤول عن المنتجات الطبيعية القيمة. نقل هذا التسلسل لمجموعة مغايرة من قبل معقد تعقيد مسار السكروز المسؤولة عن تشكيل المنتج. والاريثروميسين المضادات الحيوية A هو مثال جيد. الجينات والعشرين (مطلوبة مجموعها> 50 KB) لالحيوي في نهاية المطاف. وبالإضافة إلى ذلك، ثلاثة من هذه الجينات ترميز megasynthases، متعددة المجالات الانزيمات ~ 300 كيلو دالتون كل في الحجم. يجب أن تصمم هذه المواد الجينية ونقل إلى E. الإشريكية لالمعاد الحيوي. وسيتم وصف استخدام العزل PCR، والبناء OPERON، البلازميدات متعددة cystronic، والتحول الكهربائية في نقل الاريثروميسين A الكتلة الجينية لE. القولونية.
نقل مرة واحدة، E. يجب أن خلية دعم القولونية الحيوي في نهاية المطاف. كما أن هذا عملية صعبة نظرا للاختلافات جوهرية بين E. ومعظم المضيفين القولونية الأصلي المسؤولة عن تشكيل مجمع المنتج الطبيعي. يجب توفير ركائز الخلية اللازمة لدعم الحيوي والتعبير عن coordinately الكتلة نقل الوراثية لإنتاج الانزيمات النشطة. في حالة وجود الاريثروميسين، وE. كان خلية بكتيريا أن هندستها لتوفير السلائف اثنين (العلاقات العامةopionyl، لجنة الزراعة و(2S)-ميثيل، لجنة الزراعة) اللازمة لالحيوي. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاجة أيضا تعديلات تسلسل الجينات، البلازميد في عدد النسخ، chaperonin شارك في التعبير، بعد التعديل متعدية الأنزيمية، ودرجة الحرارة للسماح عملية الاريثروميسين النهائي A التشكيل.
وأخيرا، يجب تقييم الإنتاج الناجحة. لالاريثروميسين A الحالة، سوف نقدم طريقتين. الأول هو السائل اللوني الكتلة الطيفي (LC-MS) لتأكيد وتحديد الإنتاج. وأيضا النشاط الحيوي من الاريثروميسين A تأكيد من خلال استخدام الأحيائي التي يتم اختبار فعالية المضاد الحيوي ضد العصوية الرقيقة. والمقايسات تقييم تنشئ الاريثروميسين A الحيوي من E. القولونية ومهدت الطريق لجهود هندسة المستقبل لتحسين أو لتنويع الإنتاج وإنتاج مركبات جديدة الطبيعية المعقدة باستخدام هذا النهج.
Introduction
الاريثروميسين هو مضاد حيوي A متعدد الكيتيد التي تنتجها إيجابية الجرام بكتيريا التربة Saccharopolyspora قنطريون أحمر، وقد تحسنت تدريجيا الإنتاج الحالي إلى 10 ~ L / ز خلال عقود من الطفرات والبروتوكولات التقليدية الفرز، ومؤخرا من خلال خطط عملية التحسين 1-6. الطفرات وفحص استراتيجيات شائعة في المضادات الحيوية وتطوير المنتجات الطبيعية نتيجة لصعوبات في زراعة و / أو التلاعب وراثيا تستضيف الإنتاج الأصلي وبسبب النشاط المضاد الحيوي متاحة بسهولة أو الظواهر تحسن النمو لمساعدة الاختيار. في حالة وجود الاريثروميسين، S. ويقتصر قنطريون أحمر من قبل الملف النمو البطيء وعدم وجود أكثر مباشرة تقنيات التلاعب الجيني (نسبة إلى الكائنات الحية مثل الإشريكية القولونية)، وبالتالي، عرقلة تحسينات سريعة في الإنتاج والتركيب الحيوي للمشتقات جديدة. بعد أن أدرك قضايا الإنتاج ومقفلة diversificatiعلى الاحتمالات مع مركبات مثل A الاريثروميسين، بدأت الأوساط البحثية لمتابعة فكرة الحيوي غيروي (الشكل 1) 7. تزامنت هذه الجهود مع تسلسل المعلومات المتاحة لالاريثروميسين كتلة الجينات 8-11. ينبغي التأكيد على أن عدد المعقدة الطبيعية التسلسل الجيني مجموعات المنتجات وسعت إلى حد كبير 12-16، توفير الزخم اللازم للاستمرار في الجهود للوصول مغاير الحيوي المحتملة الطبية المشفرة. للقيام بذلك، إعادة مغاير يتطلب أن المضيف الجديد تلبية احتياجات محددة طريق السكروز. E. القولونية توفر الراحة الفنية، ومجموعة واسعة تمتد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية، والهندسة استراتيجيات عملية التمثيل الغذائي وتطوير المنتجات ل. حتى الآن، بالمقارنة مع المضيفين الإنتاج الأصلي، E. القولونية لا يحمل نفس المستوى من مجمع لإنتاج المنتجات الطبيعية. ولم يعرف ما إذا كان ذلك E. يمكن أن تكون بمثابة القولونية الخيار لغيري قابلة للمجمع الحيوي المنتج الطبيعية. ومع ذلك، كان من المفترض أن E. والإشريكية يكون الكائن الحي المضيف المثالي يمكن أن يتحقق إذا الحيوي مغاير.
مع هذا الهدف في الاعتبار، بدأت الجهود الأولية لإنتاج الجزء اللاسكري متعدد الكيتيد 6 deoxyerythronolide B (6dEB) من خلال E. القولونية. ومع ذلك، E. الأصلي يمكن التمثيل الغذائي القولونية لا توفر مستويات ملموس من بروبيونيل، لجنة الزراعة و(2S)-ميثيل، لجنة الزراعة السلائف اللازمة لدعم الحيوي 6dEB ولا يمكن للمضيف جديد بعد translationally تعديل سينسيز B deoxyerythronolide (DEBS) الانزيمات. لمعالجة هذه القضايا، تم بناء المسار الأيضي تتألف من الإنزيمات الأصلية وغير متجانسة إلى E. القولونية بحيث تم تحويل الاحتياطي الفيدرالي خارجيا بروبيونات داخل خلوي لبروبيونيل، لجنة الزراعة وبعد ذلك (2S)-ميثيل، لجنة الزراعة، وخلال الهندسة لاستكمال هذا المسار، وضعت جين SFP في الكروموسوم (ه) من E. ووصف القولونية BL21 (DE3) لإنتاج سلالة جديدة BAP1. الانزيم هو قادر SFP phosphopantetheinyl ترانسفيراز من العامل المساعد إرفاق 4'-phosphopantetheine إلى الإنزيمات DEBS 17،18. ثم وضعت ثلاثة DEBS الجينات (كل ~ 10 KB) على اثنين من ناقلات التعبير بشكل منفصل تحتوي على اختيار محرض المروجين T7. بعد تعديل مفتاح من بعد تحريض درجة الحرارة (C ° إلى 22)، وأعرب عن coordinately الجينات داخل DEBS BAP1 في حالة نشطة قادرة على توليد 6dEB 19.
السعي من الاريثروميسين كامل A الحيوي ثم بدأت باستخدام الجينات كتلة مشابهة من megalomicea البوغانة أو طريقا الهجين يتكون من جينات من S. قنطريون أحمر، S. الفرادية، وS. venezuelae التي أنتجت سيطة الاريثروميسين C و D 6 deoxyerythromycin على التوالي 20-22. في الآونة الأخيرة، وسعت مجموعتنا هذه الجهود من خلال إنتاج erythromفايز A (الشكل الأكثر سريريا ذات الصلة من الاريثروميسين) من خلال E. القولونية. وعلى النقيض من الأعمال السابقة، وأعرب coordinately استراتيجيتنا في 20 S. الأصلي الجينات اللازمة لقنطريون أحمر الحيوي متعدد الكيتيد، deoxysugar الحيوي والمرفقات والخياطة إضافية، وحقها في المقاومة (الشكل 2). في المجموع، تم تصميم 26 (أصلي وغيري) جينات للسماح E. الإشريكية لإنتاج الاريثروميسين A في 4 ملغ / L 23،24. هذه النتيجة التي أنشئت الإنتاج الكامل للمنتج معقد متعدد الكيتيد الطبيعية باستخدام E. القولونية ويخدم كأساس للاستفادة من هذا الخيار إنتاج جديدة أو متابعة جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
النص أدناه هو محددة لالاريثروميسين مضاد حيوي، ولكنها مصممة على خطوات لتكون قابلة للتطبيق عموما لمنتجات الطبيعية الأخرى كمرشحين لغيري الحيوي.
1. الاريثروميسين A نقل الكتلة الوراثية
- تصميم الاشعال لتضخيم PCR كل من الجينات المرتبطة الاريثروميسين كتلة داخل S. قنطريون أحمر كروموسوم. هذه الخطوة هي محددة لهؤلاء المرشحين الذين نتاج طبيعي الوراثية وقد تم تحديد متواليات. بدلا من ذلك، يمكن توليفها الجينات المطلوبة (من خلال عدة خيارات بائع التجارية) مع ميزة أن تصميم جينات مركبة جديدة للاستخدام الأمثل كودون داخل E. جديدة القولونية المضيفة. إذا اتبعت توليف الحمض النووي، والتحدي الحالي هو توليد الجينات التي قد تتجاوز megasynthase 10 كيلو بايت في الطول. من الناحية الفنية، ويمكن تحقيق التوليف، لكنه يمثل تحديا ومكلفة. من المتوقع أن استمرار improvemوالوالدان في تكنولوجيا الجينات معالجة السلبيات التوليف الحالية والتحقق من صحة هذا النهج كذلك لتوفير المادة الوراثية مغاير.
- أداء PCR باستخدام S. الطازجة قنطريون أحمر الحمض النووي الجيني كقالب. قد تكون مستعدة للDNA الكروموسومات من ثقافات S. قنطريون أحمر أو من المخزونات المجمدة للبكتيريا (الشكل 3) 25. قد تستفيد من ردود الفعل PCR إضافة DMSO (4 ميكرولتر في 50 ميكرولتر ردود الفعل) لحساب نسبة عالية من C G+ في الهدف S. الجينات قنطريون أحمر. يجب أن تكون متسلسلة كل الجينات تضخيم لتأكيد أنه تم استرجاع الجين الكاملة والتي أدخلت الطفرات لا أثناء عملية PCR.
- من خلال تقييد وربط هضم، إدراج كل من الجينات المعزولة في التعبير ناقلات مصممة لE. القولونية (الشكل 3). يبدأ هذا من خلال تصميم مواقع داخل تقييد الاشعال PCR للسماح الهضم وربط في السابق مناسبةناقلات pression (أدرج مثالا في الشكل 3). وقد استخدمنا كل pET21 وناقلات pET28. الناقل pET28 يسمح بإدراج تسلسل زعيم 5 'الذي ساعد في التعبير الجيني الاريثروميسين A القضية. تأكيد الفردية التعبير الجيني من خلال RT-PCR، SDS-PAGE تحليل (باستخدام الكسور البروتين للذوبان)، أو المقايسات المظهري مريحة (الشكل 4).
- بناء على أساس الجينات operons أعرب بنجاح من البلازميدات التعبير الفردي (الشكل 3). وقد استخدمنا تقليديا مجموعات من الإنزيمات قيود متوافق مع متماسكة (مثل Xba الأول وجمعية مهندسي البترول I) 24 بشكل تسلسلي لتحويل الجينات إلى operons، إلا أن المواقع المختارة لتقييد البناء OPERON يجب ألا تتواجد داخل (أو يجب إزالة من) معزولة تسلسل الجينات (وهي القضية التي يمكن تجنبها إذا تم استخدام توليف الجينات). هذه الخطوة يعزز الاريثروميسين 20 A الجينات قبل E. القولونية transformation. حاليا، وقد استخدمنا هذا الأسلوب لتشمل ما يصل إلى 20 كيلو بايت من الحمض النووي الأجنبية إلى ناقل الحيوانات الأليفة القياسية (من اثنين من الجينات KB 10 ~ لكل منهما). وعلاوة على ذلك، وقد استخدمنا هذا النهج لتوليد operons تضم تسعة الجينات. ومن غير المعروف بالضبط كم DNA أو الجينات كم يمكن دمجها في نوع PET-البلازميدات، إلا أن المقاييس المذكورة أعلاه توفر مرجعية لأنظمة معقدة مثل الاريثروميسين طريق السكروز. وأخيرا، ومعيار في الخطوات اللاحقة وربط المختبر خطوات التحول الناجح يصبح من الصعب على نحو متزايد مع زيادة حجم OPERON والبلازميد. درجة الحرارة ربط (12-22 ° C) والوقت (3-24 ساعة) متنوعة ويستخدم الكهربائية التحول للمساعدة في عملية إنتاج بنيات البلازميد النهائي.
- تحويل السكروز البلازميدات المصممة حديثا في E. القولونية سلالة BAP1 الكهربائية باستخدام التحول (الشكل 5). قد حاول الإجراء مع البلازميدات قدم إما بشكل تسلسلي أو في المشاركةmbination. عندما تحويل الحجم قادرة أو البلازميدات عديدة، وقد استخدمنا تقليديا الكهربائية التحول (على العكس من التحول الكيميائي). تحولت مرة واحدة، لوحة الخلايا على المتوسط LB الصلبة التي تحتوي على التتراسيكلين (5 ملغم / لتر)، كربنيسيلين (100 ملغ / ل)، الكاناميسين (50 مجم / لتر)، الستربتوميسين (50 مجم / لتر)، وأبراميسين (50 ملغ / لتر ) لتحديد لصيانة بلازميد. أنه من غير المألوف للغاية لاستخدام المضادات الحيوية الستة المختلفة بعد اختيار التحول لE. خلية بكتيريا، ولكن هذا يعكس ببساطة العدد الإجمالي للالبلازميدات اللازمة للسماح الاريثروميسين النهائي A الحيوي. في حين أمكن، فإن نهج الحد من القدرات الإنتاجية للمجمع مرة واحدة وقد بدأت زراعة (انظر أدناه).
2. E. السكروز القولونية إعادة إعماره
- وقد تم تصميم BAP1 سلالة لتوفير ركائز المطلوبة لالحيوي ومرحلة ما بعد translationally تعديل megasynthase B deoxyerythronolide. فرد جينات erytوقد تم اختبار hromycin طريقا للتعبير الجينات والموحدة كما في operons البلازميدات التعبير. وهذا القسم مخصص للظروف الثقافة لاختبار النشاط متضافرة من الاريثروميسين كامل طريقا.
- يستغرق 3 مستعمرات منفصلة من BAP1 تحولت حديثا وتطعيم 1.5 مل تحتوي على الثقافات LB المطلوبة المضادات الحيوية اختيار البلازميد (في تركيزات نفس المشار إليه أعلاه لتحديد لtransformants على وسط الصلبة)، الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG و 100 ميكرومتر ) وأرابينوز (2 ملغ / مل) للحث على التعبير الجيني، و 20 ملي الصوديوم بروبيونات لدعم تشكيل الخلايا السلائف السكروز. مرة واحدة وقد تم تأكيد الإنتاج، قد يتم إجراء أكبر الثقافات في محاولة لتوسيع نطاق المنتجات وتعظيم التتر.
- ثقافة الخلايا في 22 ° C و 250 دورة في الدقيقة لمدة 24-48 ساعة. في هذه الحالة، واختيار المضاد الحيوي يضمن الحفاظ على البلازميدات المطلوبة في المراحل الأولى للثقافة الخلوية. ومع ذلك، بلازميدويمكن ليالي خسر بسهولة اختيار مستويات المضادات الحيوية تغيير على مدى فترة زراعة. وهذا قد يؤدي إلى عدم الاستقرار بلازميد (أي فقدان واحد أو أكثر خلال البلازميدات الثقافة)، والذي من شأنه أن يحد ثم القدرة على الإنتاج. وتتفاقم المشكلة عندما تستخدم البلازميدات غير متوافق لإدخال الجينات كاملة الكتلة مغاير. هذا هو الحال بالنسبة للمجمع الاريثروميسين A (الشكل 5) ويتعين معالجتها على الإفراط في الإنتاج حقا من المجمع E. القولونية. ومع ذلك، لغرض إثبات الإنتاج المبدئي، يتم التسامح مع مثل هذه العيوب في التصميم من أجل إنشاء بسرعة جدوى النهج مغاير.
- توضيح الثقافات بواسطة الطرد المركزي عند 10،000 دورة في الدقيقة في microfuge إيبندورف. إزالة طاف وتخزينها في 4 درجات مئوية لتحليلها.
- في حالة وجود الاريثروميسين، قلة إنتاج مركب كانت موجهة من قبل إدراج chaperonin GroES / EL (باستخدام pGro7خصيصا لمعالجة نقص نشاط الانزيمات التعبير عن آخر) وإدراج نسخ الجين إضافية (على تلك الجينات يشتبه في التعبير ضعيفة / النشاط). قد تكون هناك حاجة استراتيجيات مماثلة مع غيري الطبيعية الأخرى جهود إنتاج المنتج.
3. تحليل المنتج
- لتأكيد وتحديد الاريثروميسين A تشكيل، حقن طاف الثقافة على نظام LC-MS (الشكل 6). الاريثروميسين المتاحة تجاريا واستخدم لتأكيد الإنتاج وكمعيار خلال القياس الكمي. لحالات دون المعايير المتاحة تجاريا، سوف LC-MS تحتاج الى مزيد من التحليل الخواص الكيميائية بواسطة NMR وارتفاع القرار مطياف الكتلة.
- مقارنة بين إنتاج المستعمرات 3 / ثقافات من التحول BAP1. اختيار أعلى المنتجة وإعداد الأسهم الجلسرين من المصدر مستعمرة. ويمكن أن يتم هذه الخطوة بالتوازي مع الثقافات إنتاج قسم البروتوكول2 باستخدام جزء صغير من الثقافات لإعداد مخزون الجلسرين. تخزين المخزون الجلسرين في الفريزر -80 ° C.
- باستخدام أكد أعلى، والأوراق المالية الخلية المنتجة، تبدأ إنتاج ثقافة منفصلة واستخراج طاف النهائي مع حجم 2X إيثيل أسيتات. استخدام نظام التبخر فراغ لتجفيف استخراج و resuspend في 100 ميكرولتر الميثانول. نقل إلى القرص استخراج مرشح العقيمة (~ قطر 1/4 بوصة) والسماح ليجف القرص. بشكل منفصل، والثقافة، B. subtillis في السائل LB بين عشية وضحاها. إضافة 20 ميكرولتر من B. ثقافة الرقيقة إلى 20 مل من السائل LB أجار في 45 ° C. لوحة للأجار والسماح لترسيخ. ضع القرص تصفية على لوحة واحتضان عند 37 درجة مئوية (الشكل 7). وبدلا من ذلك، يمكن إضافة استخراج السائل على الثقافات داخل لوحة 96-جيدا لقياس النشاط باستخدام قارئ لوحة (الشكل 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتيجة المرجوة من هذا النهج هو إنتاج منتج طبيعي تماما النشطة بيولوجيا من E. القولونية مغاير المضيف. ويمثل هذا أفضل من نتائج LC-MS تستخدم لتأكيد وتحديد الإنتاج (الشكل 6) ومضادة للجراثيم تستخدم الأحيائي لتأكيد النشاط النهائي (الشكل 7). في الخطة الشاملة للغيروي الحيوي، هذه النتيجة يعرف النجاح. إنجاز مرة واحدة، ثم انتقل الجهود البحثية لتحسين (سواء على المستويات الخلوية وعملية) والهندسة الجزيئية. وتشمل الأهداف النهائية لعمليات الإنتاج الاقتصادي المجمع الأصلي والسيطرة على نظام مغاير بحيث يمكن إجراء تعديلات عقلانية لعملية لإنتاج أنواع من المجمع الأصلي مع احتمال ازدياد النشاط طائفة أو توسيع.
فشل لإنتاج مركب يطلق المطلوب ثم العديد من خطط الطوارئ رس تقييم أي جزء من نهج وتحظر الحيوي ناجحة. العديد من هذه الآليات هي حل المشاكل في بناء داخل الإجراء المذكورة أعلاه. في تجربتنا، من المهم، على الأقل، للتأكد من نجاح التعبير الجيني (SDS-PAGE تحليل الانزيمات السكروز القابلة للذوبان) من الكتلة الجينات المدخلة حديثا قبل محاولة تقييم الحيوي من الناتج الطبيعية تشكيلها. التعبير آخر، كما هو مبين أعلاه، وقد تم استخدام مرافقين للطي البروتين، وتعزيز عدد النسخ الجيني، ودرجة الحرارة وسيلة فعالة لعملية التركيب الحيوي يسمح في نهاية المطاف.
الشكل 1. تصويرا العام للغيروي المنتجات الطبيعية مخطط السكروز وشارك فيها الاريثروميسين A المجمع. الخطوات التجريبية المطلوبة تشمل 1) تصميم ونقل الجينات الاب الكتلة الاريثروميسينأم S. قنطريون أحمر لE. القولونية، 2) إعادة تشكيل الحيوي ضمن E. القولونية، و 3) تحليل المنتج من الاريثروميسين A.
الشكل 2. A. الكتلة الجينات الاريثروميسين نظمت كما في S. الأصلي قنطريون أحمر كروموسوم. B. A الاريثروميسين الحيوي. ضمن E. القولونية، يتعين على انزيم SFP لتعديل ما بعد النقل من DEBS1، 2، و 3 الانزيمات سينسيز متعدد الكيتيد (كل> 300 كيلو دالتون)؛ وتدل بذلك عن طريق ربط الذراع المرتبطة بكل مجال ACP. الانزيمات DEBS تشكيل α β 2 2 2 γ معقدة تنقسم إلى وحدات الوحدة النمطية التي تحفز تكثفات متتالية من وحدة واحدة، لجنة الزراعة بروبيونيل كاتب وستة (2 S)-ميثيل-وحدات الموسع جنة الزراعة لتشكيل متعدد الكيتيد 6 deoxyerythronolide B (6dEB). KS-ketosynthase؛ AT-ترانسفيراز أسيل؛ ACP-أسيل البروتين الناقل؛ KR-ketoreductase (مع KR غير نشط لوحظ في وحدة 3)؛ DH-نازعة الماء؛ ER-enoyl اختزال؛ TE-thioesterase. وثمة حاجة إلى PrpE (بروبيونيل، لجنة الزراعة مخلقة) وPCC (بروبيونيل، لجنة الزراعة كربوكسيلاز، ويتألف من البروتين مفارز اثنين) لتحويل بروبيونات الخارجية إلى ركائز بدءا بروبيونيل، لجنة الزراعة و(2 S)-ميثيل جنة الزراعة. كانت قد صممت من قبل الجينات لمدرسة السلام وPrpE داخل E. BAP1 القولونية كروموسوم 19. ويتم إنجاز تحويل جزيء 6dEB لالاريثروميسين من الحيوي deoxysugar والمرفقات والخياطة إضافية، والإنزيمات المقاومة الذاتية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. A. عزل الجينات الفردية اللازمة لالحيوي A (باستثناء الجينات DEBS ثلاثة) الاريثروميسين. وقد أكد وأشير مواقع التقييد في تسلسل التمهيدي جريئة ومتكاملة، وتصميم البلازميد الفردية بما في ذلك الآنخطابات وقليل النوكليوتيد PCR تستخدم لعزل eryCI. كما شملت هو تحليل تقييد ناقلات pET21 وpET28 الناتجة تحتوي على الجينات الفردية وoperons. B. ط. توطيد الجينات اللازمة لخياطة السكروز متعدد الكيتيد كما operons لإدخالها في E. .. القولونية الثاني تقييد موقع وعناصر التعبير الأخرى المشاركة في بناء وتصميم OPERON؛ X / S يمثل ربط متوافق مع متماسكة من جمعية مهندسي البترول وXba I I المواقع مما يؤدي إلى سلسلة جديدة غير المعترف بها من قبل أي من restrictiعلى الانزيم. انقر هنا لمشاهدة الشكل 3 .
الشكل 4. A. SDS-PAGE تحليل الجينات الفردية المعروضة في الشكل 3. العلامات النجمية دلالة على تلك الجينات أعرب الزعيم مع تسلسل 5 'الناتجة عن ناقلات التعبير pET28. B. تقييم المظهري من ErmE (A الاريثروميسين المقاومة). الاريثروميسين A في المتوسط الصلبة المستخدمة لاختبار E. سلالات القولونية إيواء البلازميدات مع أو بدون الاريثروميسين ermE A الجينات المقاومة. ينجو من الموت مع نمو الخلايا مع التعبير ermE.
الشكل 5. عرض A. تخطيطي لالاريثروميسين كامل طريقا إلى E. القولونية، بما في ذلك البلازميد لchaperonin GroEL / ES (pGro7) وتحويل البلازميد التي تحتوي على B. نسخة إضافية من eryK. مقارنة بين الطرق الكيميائية والكهربائية باستخدام كل مجموعة (ط) ومتسلسلة (الثاني) مقدمة من البلازميدات. C. الاستقرار البلازميد من سلالة تتحول. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 6. LC-MS A معيار التتبع من الاريثروميسين A المنتجة من E. القولونية.
الشكل 7. A. الأحيائي المرحلة الصلبة من الأقراص التي تحتوي على فلتر ط. استخراج من E. BAP1 uninduced السيطرة القولونية السلبية؛ الثاني الاريثروميسين المتاحة تجاريا A (مراقبة إيجابية)؛. والاريثروميسين الثالث A المستخرج من E. BAP1 يسببها القولونية النظام. كانت مطلية الأقراص على حشيش B. الرقيقة والبكتيريا الناتجة من مناطق تثبيط تشير إلى نشاط المضادات الحيوية. B. الفحص أظهر في الطور السائل باستخدام عينات 96-جيدا بالطبع لوحة الزمن. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
واجهت خطوات حاسمة في التركيب الحيوي مغاير في كل من النقاط الثلاث الإجرائية في العملية: 1) نقل الجينية؛ 2) إعادة السكروز، و 3) تحليل المنتج. وهناك مشكلة في أي مرحلة عرقلة الهدف النهائي من إنشاء الحيوي مغاير. ولعل الجانب الأكثر تحديا لعملية التركيب الحيوي وإنشاء المعاد، حيث انه يلزم على الاطلاق للسماح هذا التحليل ناجحة. ومع ذلك، يتوقف على إعادة التصميم الدقيق ونقل المادة الوراثية المسؤولة عن الحيوي في نهاية المطاف. وبالمثل، المعمول بها، يمكن أن الأساليب التحليلية الحساسة (مثل LC-MS) الكشف عن مستويات عيار صغير على خلاف ذلك قد تفسر على أنها نقص الإنتاج. ذلك هو تتويج لهذه الحالات التي تجعل الحيوي مغاير الصعبة.
فيما يتعلق الاريثروميسين A سبيل المثال، تم اختبار فردي تسلسل الجينات أكد معزولة من قبل PCR لإكسبression قبل توحيد الجينات للتعبير منسق والطبيعية تشكيل المنتج. خلال المحاولات الأولية في تحليل المنتجات، وأول من عرف مركبات وسيطة فقط عندما كان لchaperonin (GroEL / ES) شارك في الكتلة أعرب مع الجينات المطلوبة. تم إنتاج المنتج النهائي فقط عندما تم تضمين نسخة إضافية من الجين المسؤول عن الخطوة الأخيرة في التركيب الحيوي (eryK). كل من هذه التدابير استفادت من الأسلوب التحليلي الحساسة LC-MS في البداية تستخدم لتقييم الإنتاج.
الآن تم تأكيد أن الإنتاج، وE. خلفية القولونية الخلوية توفر فرصا عديدة الهندسة. وأولها هو تحسين الإنتاج من الاريثروميسين الأصلية A المجمع. هذا من شأنه أن يقدم طريقا إنتاج بديلة مع تحقيق وفورات محتملة في الوقت والتكلفة عملية. وعلاوة على ذلك، قد يتم التلاعب الاريثروميسين طريقا لغرض تنويع تشكيل المنتج. النظير جديدة تقدمالمحتملة للمضادات الحيوية الجديدة (أو العلاجية الأخرى) النشاط. هذه الفرص وجود نفس للتطبيقات العامة من الحيوي مغاير وتوفير الدافع الرئيسي لهذا النهج، تقديم المزيد من الدعم من قبل مع التحديات التي واجهتها العديد من الكائنات الأصلية المنتجة. والتطبيقات والتحسينات المستمرة للنهج الموضحة في هذه المقالة زيادة وتيرة النجاح في المستقبل السكروز مغاير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أشكر NIH (AI074224 وGM085323) وجبهة الخلاص الوطني (0712019 0924699 و) للحصول على تمويل لدعم مشاريع مخصصة لغيري الحيوي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
- Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
- McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W.
- Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
- Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
- Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
- Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
- Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
- Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
- Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
- Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
- McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
- Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
- Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
- Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
- Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
- Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
- Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
- Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45 (2007).
- Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
- Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
- Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
- Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).
