La logique, les étapes expérimentales, et le potentiel de la biosynthèse hétérologue produit naturel Avec l'érythromycine complexe de l'antibiotique A produite par<em> E. coli</em

Summary

La biosynthèse hétérologue de l'érythromycine A travers<em> E. coli</em> Comprend les étapes suivantes: 1) expérimentales de transfert génétique, 2) la reconstitution hétérologue, et l'analyse du produit 3). Chaque étape sera expliquée dans le contexte de la motivation, le potentiel et les défis dans la production de produits thérapeutiques naturels à l'aide<em> E. coli</em> Comme un hôte de substitution.

Abstract

La production hétérologue de produits naturels complexes est une approche visant à remédier aux limitations actuelles et les possibilités futures. Il est particulièrement utile pour les composés qui possèdent une valeur thérapeutique, mais peut-être pas suffisamment produites ou bénéficieraient d'une forme améliorée de la production. Les procédures expérimentales impliquées peuvent être subdivisés en trois volets: 1) le transfert génétique; 2) la reconstitution hétérologue, et 3) l'analyse du produit. Chaque composante expérimentale est en cours d'optimisation continue pour relever les défis et anticiper les opportunités liées à cette nouvelle approche.

Biosynthèse hétérologue commence par l'identification d'une séquence génétique responsable d'un produit naturel précieux. Le transfert de cette séquence à un hôte hétérologue est compliquée par la complexité voie de biosynthèse responsable de la formation du produit. L'antibiotique érythromycine A est un bon exemple. Vingt gènes (un total de> 50 kb) sont nécessaires pour la biosynthèse éventuelle. En outre, trois de ces gènes codent megasynthases, multi-domaines enzymes chacun 300 ~ kDa dans la taille. Ce matériel génétique doit être conçu et transféré à E. coli pour la biosynthèse reconstitué. Le recours à l'isolement PCR, la construction opéron, multi-cystronic plasmides et électro-transformation sera décrite dans le transfert de l'érythromycine Un cluster génétique de E. coli.

Une fois transféré, l'E. coli cellule doit prendre en charge la biosynthèse éventuelle. Ce processus est également difficile étant donné les différences substantielles entre E. coli et la plupart des hôtes d'origine responsables de la formation produit naturel complexe. La cellule doit fournir des substrats nécessaires pour soutenir la biosynthèse et coordonnée exprimer le cluster génétique transféré à produire des enzymes actives. Dans le cas de l'érythromycine A, la E. coli cellule a dû être conçu pour fournir les deux précurseurs (RPopionyl-CoA et l'acide (2S)-méthylmalonyl-CoA) nécessaire à la biosynthèse. En outre, des modifications de séquences de gènes, le nombre de copies du plasmide, chaperonine co-expression, de modification post-traductionnelle enzymatique, et la température de processus ont également été nécessaire pour permettre à l'érythromycine finale A de formation.

Enfin, la production doit être évaluée avec succès. Pour l'érythromycine A cas, nous présentons deux méthodes. La première est la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) pour confirmer et quantifier la production. La bioactivité de l'érythromycine A seront également confirmés par l'utilisation d'un test biologique dans lequel l'activité antibiotique est testé contre Bacillus subtilis. Les tests d'évaluation établissent la biosynthèse de l'érythromycine A partir de E. coli et préparer le terrain pour les futurs efforts d'ingénierie pour améliorer ou diversifier la production et à la production de nouveaux composés naturels complexes en utilisant cette approche.

Introduction

L'érythromycine est un antibiotique A polykétide produite par le Gram positif bactérie du sol Saccharopolyspora erythraea et la production actuelle a été progressivement améliorée à ~ 10 g / L pendant des décennies de mutagenèse traditionnelle et protocoles de dépistage et, plus récemment, grâce à des programmes d'optimisation des processus ^1-6. Stratégies de mutagenèse et de criblage sont courantes dans le développement de produits antibiotique naturel en raison des difficultés de culture et / ou manipuler génétiquement hôtes de production indigènes et en raison de l'activité antibiotique ou facilement disponibles phénotypes de croissance améliorées pour faciliter la sélection. Dans le cas de l'érythromycine A, S. erythraea est limitée par un profil de croissance lente et l'absence de plus directs techniques de manipulation génétique (par rapport à des organismes comme E. coli), donc, ce qui entrave l'amélioration rapide de la production et de la biosynthèse de nouveaux produits dérivés. Ayant reconnu les problèmes de production et déverrouillé diversificatisur les possibilités avec des composés tels que l'érythromycine A, la communauté scientifique a commencé à poursuivre l'idée de la biosynthèse hétérologue (Figure 1) ^7. Ces efforts ont coïncidé avec des informations de séquence disponible pour l'érythromycine Un cluster ^8-11 gène. Il convient de souligner que le nombre de séquences complexes naturels groupes de gènes de produits s'est considérablement élargie ^12-16, fournissant l'impulsion de poursuivre les efforts dans la biosynthèse hétérologue d'accès codé potentiel médicinal. Pour ce faire, la reconstitution hétérologue exige que le nouvel hôte de répondre aux besoins de la voie de biosynthèse spécifique. E. coli offre une commodité technique, un ensemble large couvrant des techniques de biologie moléculaire, et des stratégies d'ingénierie métabolique et le processus de développement de produits. Pourtant, lorsqu'on les compare à des hôtes de production indigènes, E. coli ne présentent pas le même niveau de production produit complexe naturel. Il était donc ignore si E. coli pourrait servir comme une option viable pour la biosynthèse hétérologue produit naturel complexe. Cependant, il a été supposé que E. coli serait un organisme hôte idéal si biosynthèse hétérologue pourrait être accompli.

Avec cet objectif à l'esprit, les efforts initiaux ont commencé à produire de l'aglycone polycétide 6-désoxyérythronolide B (6dEB) à E. coli. Cependant, natif E. coli métabolisme n'a pas pu fournir des niveaux appréciables de la propionyl-CoA et de (2S)-méthylmalonyl-CoA précurseurs nécessaires pour soutenir la biosynthèse 6dEB ne pouvait le nouvel hôte post-traductionnelle modifier la synthase B désoxyérythronolide (DEBS) enzymes. Pour remédier à ces problèmes, une voie métabolique composé d'enzymes natives et hétérologues a été construite dans E. coli telles que le propionate de manière exogène a été alimenté à une transformation intracellulaire propionyl-CoA et l'acide (2S)-méthylmalonyl-CoA, au cours de l'ingénierie pour effectuer cette voie, un gène sfp a été placé dans the chromosome de E. coli BL21 (DE3) pour produire une nouvelle souche appelée BAP1. L'enzyme est une Sfp capable phosphopantéthéinyle transférase de fixation du cofacteur 4'-phosphopantéthéine aux enzymes DEBS ^17,18. Les trois gènes DEBS (chaque ~ 10 kb) ont ensuite été placés sur deux vecteurs d'expression contenant sélectionnables séparément promoteurs inductibles T7. Après un ajustement de la clé après l'induction de la température (de 22 ° C), les gènes DEBS été coordonnée au sein BAP1 exprimé dans un état ​​actif capable de générer 6dEB ^19.

La poursuite de l'érythromycine A la biosynthèse complète puis a commencé à utiliser un cluster de gènes analogues de Micromonospora megalomicea ou une voie hybride composé de gènes de S. erythraea, S. fradiae et S. venezuelae qui a produit l'érythromycine intermédiaires C et 6-désoxyérythromycine D, respectivement ^20-22. Récemment, notre groupe a étendu ces efforts en produisant erythromycin A (la forme la plus cliniquement pertinente de l'érythromycine) à E. coli. Contrairement aux travaux antérieurs, notre stratégie coordonnée exprimé le S. 20 d'origine gènes erythraea nécessaire pour la biosynthèse des polykétides, deoxysugar biosynthèse et de fixation, couture supplémentaire, et l'auto-résistance (figure 2). Au total, 26 (natif et hétérologues) gènes ont été conçus pour permettre E. coli pour produire de l'érythromycine A à 4 mg / L ^23,24. Ce résultat place la production complète d'un produit complexe naturel polycétide utilisant E. coli et sert de base pour tirer parti de cette possibilité nouvelle production ou de poursuivre de nouvelles.

Protocol

Le texte ci-dessous est spécifique de l'antibiotique érythromycine A, mais les étapes sont généralement conçus pour être applicable à d'autres produits naturels comme candidats pour la biosynthèse hétérologue. 1. Érythromycine A Transfert génétique Cluster Conception des amorces de PCR pour amplifier l'ensemble des gènes associés à l'érythromycine Un cluster dans le S. chromosome erythraea. Cette étape est spécifique à ces pro…

Representative Results

Le résultat attendu de cette approche est la production d'un produit entièrement naturel bioactif de l'E. coli hétérologues hôte. Ceci est mieux représenté par les résultats de LC-MS utilisé pour confirmer et quantifier la production (figure 6) et le bio-essai antibactérien utilisé pour confirmer l'activité finale (figure 7). Dans le régime général de la biosynthèse hétérologue, ce résultat définit le succès. Une fois accompli, les efforts de re…

Discussion

Les étapes critiques dans la biosynthèse hétérologue sont rencontrés à chacun des trois points de procédure dans le processus: 1) de transfert génétique, analyse des produits et 3), 2) la reconstitution de biosynthèse. Un problème à n'importe quelle étape fera dérailler l'objectif ultime d'établir la biosynthèse hétérologue. Peut-être l'aspect le plus difficile du processus est d'établir la biosynthèse reconstitué, car cela est absolument nécessaire pour permettre une analyse r…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PCR machine	Eppendorf	Mastercycler personal
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231
Electroporator	BioRad	Micropulser
IPTG	Fisher	BP1620
Sodium propionate	Sigma	P1880
L-arabinose	Sigma	A3256
Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	MaxQ 4000
Microfuge	Eppendorf	Centrifuge 5415D
pGro7	Takara	Chaperone Plasmid Set (3340)
pET21, pET28, pCDF-Duet-1	EMD Chemicals	69742-3, 69864, 71340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Ethyl acetate	Sigma	270989
Methanol	Sigma	322415
Vacuum centrifuge	Eppendorf	Concentrator 5301
Rotary Evaporator	Buchi	R-200