Logic, Experimentella trappan och potential av heterologa naturprodukt Biosynthesis Med den komplexa antibiotika erytromycin A framställs genom<em> E. E. coli</em

Summary

Den heterologa biosyntesen av erytromycin A genom<em> E. E. coli</em> Omfattar följande experimentella steg: 1) genetisk överföring, 2) heterolog rekonstitution, och 3) produktanalys. Varje steg kommer att förklaras i samband med motivation, potential och utmaningar i att producera terapeutiska naturprodukter med<em> E. E. coli</em> Som ett surrogat värd.

Abstract

Den heterologa produktionen av komplexa naturliga produkter är en strategi för att hantera nuvarande begränsningar och framtida möjligheter. Det är särskilt användbart för sådana föreningar som har terapeutiskt värde, men kan inte vara tillräckligt producerats eller skulle dra nytta av en förbättrad form av produktionen. De experimentella inblandade förfaranden kan delas in i tre delar: 1) genetisk överföring, 2) heterolog beredning, och 3) produktanalys. Varje experimentell komponent är under ständig optimering för att möta de utmaningar och förutse de möjligheter som är förknippade med denna nya strategi.

Heterolog biosyntes börjar med identifiering av en genetisk sekvens som ansvarar för en värdefull naturprodukt. Överföra denna sekvens till en heterolog värd kompliceras av den biosyntetiska reaktionsvägen komplexitet ansvarig för produktbildning. Den antibiotiska erytromycin A är ett bra exempel. Tjugo gener (totalt> 50 kb) krävs för eventuell biosyntes. Dessutom tre av dessa gener kodar megasynthases, multi-domän enzymer vardera ~ 300 kDa i storlek. Detta genetiska material skall utformas och överföras till E. E. coli för rekonstituerad biosyntes. Användningen av PCR-isolering, konstruktion operon, flera cystronic plasmider, och elektro-transformation kommer att beskrivas i överföra erytromycin A genetiska kluster till E. coli.

När överföras, E. E. coli-cell måste stödja eventuella biosyntes. Denna process är också en utmaning med tanke på de stora skillnaderna mellan E. coli och mest originella värdar som ansvarar för komplexa natur produktbildning. Cellen måste tillhandahålla nödvändiga underlag för att stödja biosyntes och koordinerat uttryck den överförda genetiska kluster för att producera aktiva enzymer. I fallet med erytromycin A, E. coli-cell måste vara konstruerad för att ge de två prekursorerna (propionyl-CoA och (2S)-metylmalonyl-CoA) som krävs för biosyntes. Dessutom har gensekvenser modifieringar plasmidkopieantalet, chaperonin samexpression, post-translationell enzymatisk modifiering och processtemperaturen också krävs för att slutligt erytromycin A formation.

Slutligen måste framgångsrik produktion bedömas. För erytromycin fall kommer vi att presentera två metoder. Den första är vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) för att bekräfta och kvantifiera produktionen. Bioaktiviteten av erytromycin A kommer också att bekräftas genom användning av en bioanalys, i vilken den antibiotiska aktiviteten testas mot Bacillus subtilis. De bedömningsgrunder analyser upprättar erytromycin A biosyntes från E. coli och lagt grunden för framtida tekniska insatser för att förbättra eller diversifiera produktionen och för produktion av nya komplexa naturliga föreningar med detta tillvägagångssätt.

Introduction

Erytromycin A är en polyketid antibiotikum som produceras av grampositiva jordbakterien Saccharopolyspora erythraea, och nuvarande produktion har stegvis förbättrats ~ 10 g / L genom årtionden av traditionella mutagenes och protokoll screening och på senare tid genom processoptimeringsåtgärder system ^1-6. Mutagenes och screening strategier är vanliga i antibiotika naturlig produkt utveckling som ett resultat av svårigheter odling och / eller genetiskt manipulera infödda produktions värdar och på grund av den lättillgänglig antibiotisk verkan eller förbättrade fenotyper tillväxt till stöd val. I fallet med erytromycin A, S erythraea begränsas av en långsam tillväxt profil och avsaknaden av mer direkta genetiska manipulation tekniker (i förhållande till organismer som E. coli), således hämmar snabba förbättringar i produktion och biosyntesen av nya derivat. Efter att ha erkänt produktions frågor och olåst diversificatipå möjligheter med föreningar som erytromycin A började forskarsamhället att fullfölja idén om heterologa biosyntes (figur 1) ^7. Dessa ansträngningar sammanföll med tillgängliga sekvensinformationen för erytromycin A genklustret ^8-11. Det bör understrykas att antalet sekvenserade komplexa naturliga kluster produktgen kraftigt har expanderat ^12-16, vilket ger impulser till fortsatta ansträngningar i heterologa biosyntesen att komma kodad medicinsk potential. För att göra detta krävs heterolog beredning att den nya värden möta behoven i de enskilda biosyntesvägen. E. E. coli ger teknisk bekvämlighet, ett brett spänner uppsättning av molekylärbiologisk teknik, och metabola och process strategier tekniska för produktutveckling. Men jämfört med infödda produktions värdar, E. E. coli uppvisar inte samma nivå av komplexa naturprodukten produktion. Det var därför okänt om E. E. coli kan tjäna som en livskraftig heterolog alternativ för komplexa naturprodukt biosyntes. Emellertid antogs det att E. E. coli skulle vara en idealisk värdorganism om heterologa biosyntesen skulle kunna fullföljas.

Med detta mål i sikte, började inledande insatser för att producera polyketid aglykon 6-deoxyerythronolide B (6dEB) genom E. coli. Men infödda E. E. coli ämnesomsättning kunde inte ge märkbara nivåer av propionyl-CoA och (2S)-metylmalonyl-CoA-prekursorer för att stödja 6dEB biosyntes heller kunde den nya värden posttranslationellt modifiera deoxyerythronolide B-syntas (DEBS) enzymer. Att rätta till dessa problem, har en metabolisk väg som består av inhemska och heterologa enzymer inbyggda i E. E. coli så att exogent matas propionat omvandlas intracellulärt till propionyl-CoA och sedan (2S)-metylmalonyl-CoA, under konstruktion för att slutföra denna väg, har en SFP-gen placeras i the kromosomen hos E. coli BL21 (DE3) för att producera en ny stam benämnd BAP1. SFP enzymet är en phosphopantetheinyl transferas kan fästa 4'-phosphopantetheine kofaktor till Debs enzymerna ^17,18. De tre Debs generna (varje ~ 10 kb) placerades sedan på två separat valbara expressionsvektorer innehållande inducerbara T7-promotorer. Efter en viktig justering av post-induktion temperatur (till 22 ° C), var Debs generna uttrycks koordinerat inom BAP1 i ett aktivt tillstånd som kan generera 6dEB ^19.

Strävan efter fullständig erytromycin A biosyntes sedan började använda en analog genkluster från Micromonospora megalomicea eller en hybrid väg som består av gener från S. erythraea, S. fradiae, och S. venezuelae som producerade intermediärer erytromycin C och 6-deoxierytromycin D respektive ^20-22. Nyligen har vår grupp förlängdes dessa insatser genom att producera erythromycin A (mest kliniskt relevant form av erytromycin) genom E. coli. I motsats till tidigare arbete, uttryckt vår strategi koordinerat den 20 ursprungliga S. erythraea gener som behövs för polyketide biosyntes, deoxysugar biosyntes och fastsättning, extra sömnad, och själv-resistens (Figur 2). Sammanlagt 26 (infödda och heterologa) gener konstruerade så att E. coli för att producera erytromycin A vid 4 mg / L ^23,24. Detta resultat etablerat komplett produktion av en komplex polyketid naturprodukt med E. coli och fungerar som en grund för att utnyttja denna nya produktion alternativet eller utöva nya.

Protocol

I texten nedan är specifik för erytromycin A antibiotikum, men stegen är avsedda att vara allmänt tillämpbar på andra naturliga produkter som kandidater för heterolog biosyntes. 1. Erytromycin en genetisk Cluster Transfer Design PCR-primers för att amplifiera alla gener associerade med erytromycin A kluster inom S. erythraea kromosom. Detta steg är specifik för de naturliga produktkandidater vars genetiska sekvenser har bestämts. Alternativt, kan de erforderlig…

Representative Results

Det önskade resultatet av denna metod är framställningen av en fullt bioaktiv naturlig produkt från E. E. coli heterologa värden. Detta är bäst representeras av LC-MS resultat som används för att bekräfta och kvantifiera produktionen (Figur 6) och det antibakteriella bioanalys används för att bekräfta sista aktivitet (Figur 7). I det övergripande system av heterologa biosyntesen definierar detta resultat framgång. När åstadkommit, forskningsinsatser vänder sed…

Discussion

Kritiska steg i heterologa biosyntesen påträffas vid de tre processrättsliga punkter i processen: 1) genetisk överföring, 2) biosyntetiska rekonstituering, och 3) produktanalys. Ett problem i något skede kommer att spåra ur det yttersta målet att inrätta heterologt biosyntes. Kanske den mest utmanande aspekten av processen är att etablera rekonstituerade biosyntes, eftersom detta är absolut nödvändig för att möjliggöra framgångsrik analys. Dock är beredning beroende noggrann design och överföring av …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
PCR machine	Eppendorf	Mastercycler personal
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231
Electroporator	BioRad	Micropulser
IPTG	Fisher	BP1620
Sodium propionate	Sigma	P1880
L-arabinose	Sigma	A3256
Refrigerated Shaker	Thermo Scientific	MaxQ 4000
Microfuge	Eppendorf	Centrifuge 5415D
pGro7	Takara	Chaperone Plasmid Set (3340)
pET21, pET28, pCDF-Duet-1	EMD Chemicals	69742-3, 69864, 71340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Ethyl acetate	Sigma	270989
Methanol	Sigma	322415
Vacuum centrifuge	Eppendorf	Concentrator 5301
Rotary Evaporator	Buchi	R-200