のためのウイルス粒子<emインビボ></em>腫瘍イメージング
Summary
植物ウイルス粒子（VNPs）は生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、植物VNP伝播、精製、特性評価、バイオコンジュゲーションするための手順について説明します。最後に、我々は腫瘍ホーミングとマウス異種移植モデルおよび蛍光イメージングを用いたイメージング用VNPsの応用を示す。
Abstract
ナノ材料の使用は、材料科学と医学に革命を起こす可能性を秘めています。現在、異なるナノ粒子の数は、イメージング及び治療への応用が検討されている。植物由来のウイルス粒子（VNPs）が定義されたサイズと形状を持つ自己組織化bionanomaterialsとみなすことができる。シュタインメッツのラボで研究中の植物ウイルスは直径30nmのが、どちらもササゲモザイクウイルス （CPMV）とブロムモザイクウイルス （BMV）によって形成された正二十面体粒子が挙げられる。我々はまた、以下の植物ウイルス由来の棒状、糸状の構造を開発している：18 nmで、300 nmの寸法、および糸状粒子515を形成ポテトウイルスX（PVX）で剛体棒を形成したタバコモザイクウイルス （TMV）、長さと幅で13 nmのナノメートル（ リーダーがレフリーと呼ばれています。VNPsの詳細については、1および2）。
<p class="jove_content">ビューの材料科学者の視点から、VNPsはいくつかの理由のための魅力的なビルディングブロックです：粒子が単分散で、 プランタで大規模に容易に製造することができる、非常に安定していて、生体適合性である。また、VNPsは、特に遺伝子組み換えや化学バイオコンジュゲーション法3を用いて操作することができる"プログラマブル"単位です。 VNPsの構造を原子レベルの分解能に知られており、変更は原子レベル4、現在の最先端の技術を有する合成ナノ材料を用いて達成することができないコントロールのレベルで空間的な精度で行うことができる。本稿では、 緑豆ungiuculataとNicotiana benthamianaのプラントで CPMV、PVX、TMV、とBMVの伝播を記述します。各VNPための抽出と精製プロトコルが与えられている。精製し、化学的に標識VNPsのキャラクタリゼーションのための方法が記載されている。そこで、本研究ではchに焦点を当てるフルオロフォア（ 例えばのAlexa Fluor 647）、ポリエチレングリコール（PEG）とVNPsのemicalラベリング。染料は、5月10日 VNPsの追跡および検出を容易にし、8,11その薬物動態を向上させながら、PEGはタンパク質性ナノ粒子の免疫原性を低減します。我々は、マウス異種移植腫瘍モデルを用いてPEG化VNPsのホーミング腫瘍を実証している。マエストロイメージングシステムを用いて組織ex vivoでの蛍光イメージングの組み合わせは、均質化された組織における蛍光定量、および共焦点顕微鏡は、生体内分布を研究するために使用されています。 VNPsは細網内皮系（RES）を経由してクリアされます。ホーミング腫瘍が強化された透過性と保持（EPR）効果12を介して受動的に達成されます。 VNPナノテクノロジーは、画像に強力なプラグ·アンド·プレイ·テクノロジーであり、 生体内での病気のサイトを扱います。今後はへの薬物貨物や臨床的に意義のあるイメージング部分、ならびに組織特異的リガンドを運ぶためにVNPsを開発しているがんや心臓血管疾患で過剰発現分子の受容体を標的とする。
Protocol
1。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）伝搬一日の15時間（100％の光、25℃、65％湿度）と夜の9時間（0％光、22℃、60％湿度）に屋内植物室制御を設定します。 表1のタイムラインによると、植物に接種する。 CPMV PVX、TMV、とBMV 0日目：植物3ササゲ種子/ポット。 <e…
Representative Results
Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation. <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/4352…
Discussion
このプロトコルは、in vivoでの腫瘍イメージングのためのVNPsとその応用の化学修飾のためのアプローチを提供します。ここで紹介する動物蛍光イメージング、蛍光定量、および免疫組織化学の技術は生体内分布を研究し、腫瘍がホーミング評価するのに役立ちます。これらの技法は、EPR効果による腫瘍へのナノ粒子のアクセスに関する貴重な情報を提供します。種々の分析方法?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの/ NIBIB助成R00 EB009105（NFS）とP30-EB011317 NFS（へ）、NIHの/ NIBIB訓練助成T32 EB007509（AMW）に、ケース·ウェスタン·リザーブ大学学際アライアンス·インベストメント·グラント（NFSへ）によってサポートされていましたとケース総合がんセンター助成P30 CA043703（NFS）である。我々は、彼らのためにシュタインメッツラボ学部生の研究者に感謝ハンズオンサポート：ナディア唱、ケビン·チェン、ソウラヴ（SID）Deyさん、アリスヤン、サムアレクサンダー、クレイグD'クルス、だからスティーブン鷺、ローレンランドルフ、ブライアン、ポールChariou 。
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack’s Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 |
References
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NanoparticlesIn Vivo Tumor ImagingNanomaterialsMaterials ScienceMedicineViral Nanoparticles (VNPs)Plant VirusesCowpea Mosaic Virus (CPMV)Brome Mosaic Virus (BMV)Tobacco Mosaic Virus (TMV)Potato Virus X (PVX)Monodisperse ParticlesLarge-scale ProductionStabilityBiocompatibilityGenetic ModificationChemical Bioconjugation MethodsAtomic Resolution
Cite This Article
Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).