Summary

Nanopartículas virais para<em> Em vivo</em> Imaging Tumor

Published: November 16, 2012
doi:

Summary

Nanopartículas de plantas virais (VNPs) são promissoras plataformas para aplicações em biomedicina. Aqui, descrevemos os procedimentos para a propagação de plantas VNP, purificação, caracterização e bioconjugação. Por fim, mostramos a aplicação de VNPs para homing tumor e de imagem usando um modelo de xenoenxerto mouse e imagens de fluorescência.

Abstract

O uso de nanomateriais tem o potencial de revolucionar a ciência de materiais e medicamentos. Actualmente, um número de diferentes nanopartículas estão a ser investigados para aplicações em imagiologia e terapia. Nanopartículas virais (VNPs) derivados de plantas pode ser considerada de auto-montagem bionanomaterials com tamanhos e formas definidas. Vírus de plantas em estudo em laboratório Steinmetz incluem partículas formadas por icosaédrica Cowpea mosaic virus (CPMV) e vírus do mosaico Brome (BMV), ambos os quais são de 30 nm de diâmetro. Também estamos a desenvolver estruturas em forma de bastonete e filamentosas derivados de vírus de plantas os seguintes: vírus do mosaico do tabaco (TMV), o qual forma hastes rígidas com as dimensões de 300 nm por 18 nm, e os vírus da batata X (PVX), que formam as partículas filamentosas 515 nm de comprimento e 13 nm de largura (o leitor é remetido para refs. 1 e 2 para mais informações sobre VNPs).

<p class="jove_content"> Do ponto de um cientista de materiais da vista, VNPs são blocos de construção atractivos por diversas razões: as partículas são monodispersas, podem ser produzidos com facilidade em larga escala in planta, são excepcionalmente estáveis ​​e biocompatíveis. Além disso, VNPs são "unidades programáveis", que podem ser especificamente modificados usando a modificação genética ou métodos químicos bioconjugação 3. A estrutura de VNPs é conhecida a resolução atómica, e modificações podem ser efectuadas com uma precisão espacial ao nível atómico 4, um nível de controle que não pode ser conseguido usando os nanomateriais sintéticos com correntes estado-da-arte.

Neste artigo, descreve a propagação de CPMV, PVX, TMV e BMV em Vigna ungiuculata e plantas Nicotiana benthamiana. Extracção e purificação de protocolos para cada VNP são dadas. Métodos para caracterização da purificada e VNPs quimicamente marcados encontram-se descritos. Neste estudo, nos concentramos em chrotulagem emical de VNPs com fluoróforos (por exemplo, Alexa Fluor 647) e polietileno glicol (PEG). Os corantes de rastreamento e facilitar a detecção dos VNPs 5-10, e PEG reduz a imunogenicidade das nanopartículas proteicas enquanto melhora sua farmacocinética 8,11. Demonstramos tumor homing de VNPs peguilado utilizando um rato modelo de xenoenxerto de tumor. Uma combinação de imagens de fluorescência de tecidos ex vivo utilizando Maestro Imaging System, a quantificação da fluorescência em tecidos homogeneizados, e microscopia confocal é utilizada para estudar a biodistribuição. VNPs são limpas por meio do sistema reticuloendotelial (RES); tumor homing de forma passiva, através da maior permeabilidade e efeito de retenção (EPR) 12. A nanotecnologia VNP é um poderoso plug-and-play tecnologia para imagem e tratar locais de doença in vivo. Estamos aprofundar VNPs para transportar cargas de drogas e porções de imagem clinicamente relevantes, bem como tecido-específicos para ligandosalvo receptores moleculares overexpressed em câncer e doenças cardiovasculares.

Protocol

1. VNP (CPMV, VMB, PVX, e TMV) Propagação Defina a câmara de plantas de interior controla a 15 horas do dia (100% de luz, 25 ° C, umidade 65%) e 9 horas da noite (luz 0%, 22 ° C, umidade 60%). Inocular plantas de acordo com a linha do tempo na Tabela 1. CPMV PVX, TMV e BMV Dia 0: Fábrica 3 caupi sementes / vaso. Dia 0:</s…

Representative Results

Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation. <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/4352…

Discussion

Este protocolo proporciona uma abordagem para a modificação química da VNPs e suas aplicações para a imagiologia de tumores in vivo. As técnicas de imagem de animais de fluorescência, quantificação de fluorescência, e imunohistoquímica aqui apresentadas são úteis para o estudo de biodistribuição e avaliar tumor homing. Estas técnicas proporcionam informação valiosa sobre o acesso das nanopartículas para o tumor, através do efeito EPR. Ao combinar os resultados dos vários métodos d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIBIB bolsas R00 EB009105 (para NFS) e P30 EB011317 (para NFS), um NIH / NIBIB treinamento concessão T32 EB007509 (para AMW), um Case Western Reserve University Interdisciplinar Alliance Investment Grant (a NFS), E um caso Comprehensive Cancer Center concessão P30 CA043703 (para NFS). Agradecemos aos Steinmetz Lab pesquisadores estudantes de graduação para suas mãos no apoio: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Assim, e Paulo Chariou .

Materials

Material Name Company Catalogue number Comments (optional)
      VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2  
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A  
N. benthamiana seeds     N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500  
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400  
Jack’s Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860  
      Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901  
SW 32 Ti rotor Beckman 369694  
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672  
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149  
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020  
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910  
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c  
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU  
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01  
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66  
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850  
Maestro 2 Caliper Life Sciences   In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395  
Microplate reader Tecan Infinite-200  
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE  
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000  
      Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G  
384 well black plate BD Biosciences 353285  
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX  
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008  
Acetic Acid Fisher A385-500  
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L  
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277  
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006  
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250  
Boric acid Fisher A74-500  
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25  
CsCl Acros Organics 42285-1000  
DAPI MP Biomedicals 157574  
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100  
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406  
Goat serum Invitrogen 16210-064  
KCl Fisher BP366-500  
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050  
Methanol Fisher A412P-4  
MgCl2 Fisher BP214-500  
Microscope slides Fisher 12-544-3  
Microscope cover glass VWR 48366-277  
MOPS buffer Invitrogen NP0001  
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212  
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149  
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050  
Permount Fisher SP15-100  
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1  
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1  
Sodium acetate Fisher BP333-500  
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050  
Sodium sulfite Amresco 0628-500G  
Sucrose Fisher S6-500  
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu  
Tris base Fisher BP152-500  
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1  
β-mercaptoethanol Fisher O3446I-100  
      Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020  
Hemocytometer Fisher 0267110  
HT-29 cells ATCC HTB-38  
L-glutamine Invitrogen 25030-080  
PBS Cellgro 21-040-CV  
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016  
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089  
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01  
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054  
      Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637  
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234  
NCR nu/nu mice     CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583  

References

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Cite This Article
Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

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