Plant viral nanopartikler (VNPs) er lovende plattformer for applikasjoner i biomedisin. Her beskriver vi prosedyrene for plante VNP forplantning, rensing, karakterisering og bioconjugation. Til slutt viser vi anvendelsen av VNPs for tumor homing og bildebehandling ved hjelp av en mus xenograft modell og fluorescens bildebehandling.
Bruken av nanomaterialer har potensial til å revolusjonere materialer vitenskap og medisin. For tiden er en rekke ulike nanopartikler under etterforskning for bruk i bildebehandling og terapi. Viral nanopartikler (VNPs) stammer fra planter kan betraktes som selvkonfeksjonerte bionanomaterials med definerte størrelser og former. Plante virus under etterforskning i Steinmetz lab inkluderer icosahedral partikler dannet av Cowpea mosaikk virus (CPMV) og Brome mosaikk virus (BMV), som begge er 30 nm i diameter. Vi utvikler også stavformede og trådformede strukturer avledet fra følgende plante virus: Tobakk mosaikk virus (TMV), som danner stive stenger med dimensjoner på 300 nm etter 18 nm, og potet Virus X (PVX), som danner filamentous partikler 515 nm i lengde og 13 nm i bredden (leseren er henvist til refs. 1 og 2 for ytterligere informasjon om VNPs).
<p class="jove_content"> Fra en materialer vitenskapsmann synspunkt, VNPs er attraktive byggesteiner for flere grunner: Partiklene er monodisperse, kan bli produsert med letthet på stor skala i planta, er usedvanlig stabil, og biokompatibelt. Også VNPs er "programmerbare" enheter, som kan være spesielt utviklet med genmodifisering eller kjemiske bioconjugation metoder 3. Strukturen av VNPs er kjent for atom oppløsning, og modifikasjoner kan utføres med romlig presisjon på atomnivå 4, et nivå av kontroll som ikke kan oppnås ved hjelp av syntetiske nanomaterialer med dagens state-of-the-art teknologi.I denne artikkelen beskriver vi utbredelsen av CPMV, PVX, TMV, og BMV i Vigna ungiuculata og Nicotiana benthamiana planter. Ekstraksjon og rensing protokoller for hver VNP er gitt. Metoder for karakterisering av renset og kjemisk-merkede VNPs beskrives. I denne studien har vi fokus på lmemical merking av VNPs med fluoroforer (f.eks Alexa Fluor 647) og polyetylenglykol (PEG). Fargestoffer rette sporing og påvisning av VNPs 5-10, og PEG reduserer immunogenisiteten av de proteinholdige nanopartikler og samtidig forbedre deres farmakokinetikk 8,11. Vi viser tumor homing av pegylert VNPs ved hjelp av en mus xenograft svulst modell. En kombinasjon av fluorescens avbildning av vev ex vivo ved hjelp av Maestro Imaging System, fluorescens kvantifisering i homogenisert vev, og konfokalmikroskopi brukes for å studere biodistribusjon. VNPs cleares via det retikuloendoteliale system (RES), tumor homing oppnås passivt via forbedret permeabilitet og retensjon (EPR) effekt 12. Den VNP nanoteknologi er et kraftfullt plug-and-play-teknologi til bilde og behandle områder av sykdom in vivo. Vi videreutvikle VNPs å bære bedøve cargos og klinisk relevante bildebehandling molekyldeler samt vevsspesifikke ligander tilmålrette molekylære reseptorer overexpressed i kreft og hjerte-og karsykdommer.
Denne protokollen gir en tilnærming for kjemisk modifisering av VNPs og deres applikasjoner for in vivo tumor imaging. The Animal fluorescens bildebehandling, fluorescens kvantifisering, og immunhistokjemi teknikkene som presenteres her er nyttige for å studere biodistribusjon og evaluering svulst homing. Disse teknikkene gir verdifull informasjon om tilgang av nanopartikler til svulsten via EPJ effekt. Ved å kombinere resultatene fra de ulike analysemetoder, får vi en kraftig tilnærming for å vurdere lok…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIBIB tilskudd R00 EB009105 (til NFS) og P30 EB011317 (til NFS), en NIH / NIBIB trening stipend T32 EB007509 (til AMW), en Case Western Reserve University Tverrfaglig Alliance Investment Grant (til NFS), og en sak Comprehensive Cancer Center stipend P30 CA043703 (til NFS). Vi takker Steinmetz Lab undergraduate student forskere for sin hands-on støtte: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Så og Paul Chariou .
Material Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
VNP production | |||
Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
Carborundum | Fisher | C192-500 | |
Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
Jack’s Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
Equipment | |||
50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
Cryostat | Leica | CM1850 | |
Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
Chemicals and Reagents | |||
3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
Boric acid | Fisher | A74-500 | |
Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
KCl | Fisher | BP366-500 | |
L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
Methanol | Fisher | A412P-4 | |
MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
NaCl | Fisher | BP358-212 | |
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
Permount | Fisher | SP15-100 | |
Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
Sucrose | Fisher | S6-500 | |
TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
Tris base | Fisher | BP152-500 | |
Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
β-mercaptoethanol | Fisher | O3446I-100 | |
Tissue Culture | |||
Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
Animal Studies | |||
18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 |