Summary

Nanoparticelle virali per<em> In vivo</em> Imaging Tumore

Published: November 16, 2012
doi:

Summary

Nanoparticelle vegetali virali (VNPs) sono promettenti piattaforme per le applicazioni in campo biomedico. Qui, descriviamo le modalità di propagazione delle piante VNP, purificazione, caratterizzazione e bioconjugation. Infine, mostriamo l'applicazione di VNPs per homing tumore e immagini utilizzando un modello di xenotrapianto mouse e imaging di fluorescenza.

Abstract

L'uso di nanomateriali ha il potenziale per rivoluzionare scienza dei materiali e della medicina. Attualmente, un certo numero di differenti nanoparticelle sono stati studiati per applicazioni di imaging e terapia. Nanoparticelle virali (VNPs) derivati ​​da piante può essere considerata autoassemblati bionanomaterials con dimensioni e forme definite. Virus di piante in esame in laboratorio Steinmetz sono particelle formate icosaedrici dal virus del mosaico Cowpea (CPMV) e virus del mosaico Brome (BMV), entrambi i quali sono 30 nm di diametro. Stiamo anche sviluppando strutture a forma di bastoncello e filamentose derivati ​​dai virus delle piante seguenti: virus del mosaico del tabacco (TMV), che costituisce aste rigide con dimensioni di 300 nm da 18 nm, e Virus X della patata (PVX), che formano le particelle filamentose 515 nm di lunghezza e 13 nm in larghezza (si rimanda il lettore al refs. 1 e 2 per ulteriori informazioni sulla VNPs).

<p class="jove_content"> Dal punto uno scienziato dei materiali di vista, VNPs sono elementi interessanti per diversi motivi: le particelle sono monodisperse, può essere prodotta con facilità su larga scala in planta, sono eccezionalmente stabili e biocompatibili. Inoltre, VNPs sono "programmabili" unità, che possono essere specificamente progettati utilizzando modificazione genetica o metodi chimici bioconjugation 3. La struttura di VNPs è noto risoluzione atomica, e modifiche possono essere effettuate con precisione spaziale a livello atomico 4, un livello di controllo che non può essere raggiunto utilizzando nanomateriali di sintesi con le attuali state-of-the-art.

In questo articolo, si descrive la propagazione di CPMV, PVX, TMV, e BMV a Vigna ungiuculata e piante di Nicotiana benthamiana. Protocolli di estrazione e purificazione di ogni VNP sono dati. Metodi per la caratterizzazione dei purificato e VNPs chimicamente etichettati sono descritti. In questo studio, ci concentriamo su chetichettatura emical di VNPs con fluorofori (es. Alexa Fluor 647) e polietilenglicole (PEG). I coloranti facilitare il monitoraggio e la rilevazione dei VNPs 5-10, e PEG riduce immunogenicità delle nanoparticelle proteici migliorando loro farmacocinetica 8,11. Dimostriamo tumore homing di VNPs pegilati utilizzando un modello di topo xenotrapianto del tumore. Una combinazione di imaging di fluorescenza di tessuti ex vivo utilizzando Maestro Imaging System, quantificazione fluorescenza nei tessuti omogeneizzati, e microscopia confocale viene utilizzato per studiare biodistribuzione. VNPs vengono cancellati tramite il sistema reticolo-endoteliale (RES); tumore homing avviene passivamente attraverso la permeabilità maggiore e ritenzione (EPR) effetto 12. La nanotecnologia VNP è un potente plug-and-play della tecnologia per l'immagine e il trattamento di siti di malattia in vivo. Stiamo sviluppando ulteriormente VNPs portare carichi di droga e frazioni di imaging clinicamente rilevanti, così come tessuto-specifici ligandi dibersaglio i recettori molecolari sovraespresse nel cancro e malattie cardiovascolari.

Protocol

1. VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Propagazione Impostare la camera di impianto al coperto di controllo per 15 ore del giorno (100% di luce, 25 ° C, 65% di umidità) e 9 ore di notte (0% luce, 22 ° C, 60% di umidità). Inoculare le piante in base alla timeline nella Tabella 1. CPMV PVX, TMV, e BMV Giorno 0: Stabilimento 3 fagiolo dall'occhio semi /…

Representative Results

Figure 1. Plant virus-infected plants. Vigna unguiculata plants infected with CPMV (A). Nicotiana benthamiana plants infected with PVX (B), TMV (C), and BMV (D). The pictures were taken about 10 days post infection by mechanical inoculation. <img alt="Figure 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/4352…

Discussion

Questo protocollo fornisce un approccio per la modifica chimica di VNPs e delle loro applicazioni per imaging in vivo del tumore. Le tecniche di imaging di fluorescenza animale, quantificazione fluorescenza, l'immunoistochimica e presentati in questa sede sono utili per lo studio di biodistribuzione e la valutazione del tumore homing. Queste tecniche forniscono informazioni importanti per quanto riguarda l'accesso delle nanoparticelle al tumore attraverso l'effetto EPR. Combinando i risultati dei va…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIBIB sovvenzioni R00 EB009105 (per NFS) e P30 EB011317 (per NFS), il NIH / NIBIB formazione concessione T32 EB007509 (a AMW), un Case Western Reserve University Interdisciplinare Alliance Investment Grant (per NFS), e una causa Comprehensive Cancer Center di sovvenzione P30 CA043703 (per NFS). Ringraziamo i ricercatori laboratorio per studenti universitari Steinmetz per le loro mani-sul sostegno: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Quindi, e Paul Chariou .

Materials

Material Name Company Catalogue number Comments (optional)
      VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2  
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A  
N. benthamiana seeds     N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500  
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400  
Jack’s Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860  
      Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901  
SW 32 Ti rotor Beckman 369694  
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672  
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149  
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020  
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910  
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c  
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU  
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01  
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66  
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850  
Maestro 2 Caliper Life Sciences   In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395  
Microplate reader Tecan Infinite-200  
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE  
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000  
      Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G  
384 well black plate BD Biosciences 353285  
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX  
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008  
Acetic Acid Fisher A385-500  
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L  
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277  
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006  
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250  
Boric acid Fisher A74-500  
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25  
CsCl Acros Organics 42285-1000  
DAPI MP Biomedicals 157574  
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100  
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406  
Goat serum Invitrogen 16210-064  
KCl Fisher BP366-500  
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050  
Methanol Fisher A412P-4  
MgCl2 Fisher BP214-500  
Microscope slides Fisher 12-544-3  
Microscope cover glass VWR 48366-277  
MOPS buffer Invitrogen NP0001  
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212  
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149  
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050  
Permount Fisher SP15-100  
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1  
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1  
Sodium acetate Fisher BP333-500  
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050  
Sodium sulfite Amresco 0628-500G  
Sucrose Fisher S6-500  
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu  
Tris base Fisher BP152-500  
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1  
β-mercaptoethanol Fisher O3446I-100  
      Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020  
Hemocytometer Fisher 0267110  
HT-29 cells ATCC HTB-38  
L-glutamine Invitrogen 25030-080  
PBS Cellgro 21-040-CV  
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016  
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089  
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01  
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054  
      Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637  
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234  
NCR nu/nu mice     CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583  

References

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Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

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