Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

에 대한 바이러스 나노 입자 doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

공장 바이러스 나노 입자 (VNPs)은 생물 의약의 응용 프로그램 플랫폼을 약속하고 있습니다. 여기, 우리는 공장 VNP 전파, 정화, 특성화 및 bioconjugation에 대한 절차를 설명합니다. 마지막으로, 우리는 마우스 이종 이식 모델과 형광 이미징을 사용하여 종양 추적 및 이미징을위한 VNPs의 응용 프로그램을 보여줍니다.

Abstract

나노 소재의 사용은 재료 과학 및 의학에 혁명을 할 수있는 가능성이 있습니다. 현재, 서로 다른 나노 입자의 수​​는 이미징 및 치료에 응용 프로그램에 조사하고 있습니다. 식물에서 파생 바이러스 성 나노 입자 (VNPs)가 정의 크기와 모양으로 자기 조립 bionanomaterials으로 간주 할 수 있습니다. Steinmetz 연구실에서 조사중인 공장 바이러스는 직경 30 nm의 아르 둘 다 Cowpea 모자이크 바이러스 (CPMV)와 Brome 모자이크 바이러스 (BMV)에 의해 형성 icosahedral 입자가 포함되어 있습니다. 우리는 또한 다음과 같은 식물 바이러스로부터 파생 된 막대 모양과 filamentous 구조를 개발하고 있습니다 : 18 나노 미터로 300 nm의 크기, 그리고 filamentous 입자 515를 형성 감자 바이러스 X (PVX)로 강성 봉을 형성 담배 모자이크 바이러스 (TMV), 길이, 폭 13 나노 미터의 나노 미터는 (독자는 심판이 판결이라고합니다. VNPs에 대한 자세한 내용은 1, 2).

planta에 대규모로 쉽게 제작 할 수 매우 안정적이고 biocompatible 있습니다. 또한, VNPs는 특히 유전자 변형 또는 화학 bioconjugation 방법 3을 사용 설계 할 수 있습니다 "프로그램"단위입니다. VNPs의 구조는 원자 해상도로 알려져 있으며, 수정은 원자 레벨 4, 현재의 최첨단 기술과 합성 나노 소재를 사용하여 달성 할 수없는 제어 수준의 공간적 정밀도로 수행 할 수 있습니다.

이 논문에서, 우리는 CPMV, PVX, TMV, 그리고 Vigna ungiuculata와 Nicotiana benthamiana 공장에서 BMV의 전파에 대해 설명합니다. 각 VNP에 대한 추출 및 정제 프로토콜은 주어집니다. 정화되고 화학적으로 라벨이 표시된 VNPs의 특성에 대한 방법은 설명되어 있습니다. 본 연구에서는, 우리는 채널에 초점을emical fluorophores과 VNPs의 라벨 (예를 들면, 알렉사 형석 647) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 염료는 추적 및 5-10 VNPs의 확인을 용이하게하고, 자신의 pharmacokinetics 8,11을 향상하는 동안 PEG는 proteinaceous 나노 입자의 immunogenicity을 감소시킨다. 우리는 마우스 이종 이식 종양 모델을 사용 PEGylated VNPs의 유도 종양을 보여줍니다. 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 조직 예 생체의 형광 이미징, 균질 조직의 형광 정량화하고, 공 촛점 현미경의 조합이 biodistribution을 연구하는 데 사용됩니다. VNPs는 reticuloendothelial 시스템 (RES)를 통해 해제되며, 추적 종양이 향상된 투자율 및 유지 (EPR) 효과를 통해 수동적으로 12 달성된다. VNP의 나노 기술은 강력한 플러그 앤 플레이 이미지에 기술하고 생체 내 질병의 사이트를 취급합니다. 우리는 더에 약물 cargos 및 임상 - 관련 영상 moieties뿐만 아니라 조직 별 리간드를 수행 할 VNPs를 개발하고 있습니다암과 심장 혈관 질환에 overexpressed 분자 수용체를 타겟팅합니다.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 전파

  1. 실내 식물 챔버 하루 15 시간 (100 % 등, 25 ° C, 65 % 습도)와 밤 9 시간 (0 % 등, 22 ° C, 60 % 습도)에 제어합니다.
  2. 표 1의 타임 라인에 따라 식물의 예방.
CPMV PVX, TMV, 그리고 BMV
일 0 : 공장 3 cowpea 씨앗 / 화분. 일 0 : 공장 ~ 30 N. benthamiana 씨 / 냄비. 1 큰술 비료 / 5 L의 물을 일주일에 한 번 비옥.
일 14 : 1 공장 / 냄비에서 다시 냄비 N. benthamiana.
10 일 : 감염은 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 CPMV (5 μg/50 μl / 잎)를 기본 잎을 남긴다. 일 28 : 감염 3 F필자는 카보 런덤의 살충제 빛을 사용하여 기계 접종하여 PVX, TMV, 또는 BMV (5 μg/50 μl / 잎)로 출발합니다.
일 20 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C. 일 42 : 수확 잎과 -80에 저장 ° C.

성장 감염, 그리고 잎을 수확을위한 표 1. 타임 라인.

참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 정화

참고 : 모든 단계는 얼음 또는 4에서 수행되는 ° C.

  1. 추위 버퍼 2 볼륨을 (표 2 참조)를 사용하여 표준 믹서기에서 냉동 잎 100g을 균질화. 일종의 투박한 무명로부터 2-3 층을 통해 필터링 할 수 있습니다.
  2. PVX를 들어, 1 M HCL을 사용하여 6.5에 pH를 조정합니다. 0.2 % (w / V) 아스코르브 산 및 0.2 % (w / V) 나트륨 sulfi을 추가테.
  3. 20 분에 5,500 XG에서 원유 공장 homogenate를 원심 분리기. 표면에 뜨는 수집합니다.
  4. BMV를 들어, 레이어 10 % (w / V) 자당 솔루션의 5 ML 이상 표면에 뜨는 25 ML. 38.5 % CsCl 용액 (w / V)의 3 시간과 resuspend 펠릿을위한 9,000 XG에서 원심 분리기. 5 시간에 진동에 의한 혼합 한 다음 단계 2.12를 계속합니다.
  5. 1시 1분 (V / V) 클로로포름 :1-부탄올의 0.7 볼륨을 추가하여 식물 자료를 추출합니다. 30-60 분 동안 혼합물을 저어.
  6. 20 분에 5,500 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 위 수성 단계를 수집합니다.
  7. 0.2 M와 8 % (w / V) PEG (MW 8000)에 NaCl을 추가합니다. TMV의 경우도 (V / V) 트라이 튼 X-100 1 %를 추가 할 수 있습니다. 적어도 1 시간에 저어, 최소한 1 시간에 앉아 보자.
  8. 15 분에 15,000 XG에서 솔루션을 원심 분리기. 버퍼의 10 ML에 Resuspend 펠릿. PVX를 들어, 0.5 M.에 0.1 % β-메르 캅토 에탄올 및 요소를 추가
  9. 30 분에 8,000 XG에 원심 분리기와 표면에 뜨는 수집합니다.
  10. 3 시간에 160,000 XG에 표면에 뜨는을 Ultracentrifuge. 5 ML 버퍼 O에 Resuspend 펠릿vernight.
  11. 동일한 10 % 권, 20 %, 30 %, 및 버퍼에 40 % 자당을 (무거운 첫 번째)를 사용하여 10-40%의 자당 기울기를 준비합니다. 기울기가 실온에서 하룻밤 평형 할 수 있습니다.
  12. Ultracentrifuge은 2 시간 (BMV 24 시간)에 100,000 XG에서 자당 기울기를 통해 펠릿을 resuspended.
  13. 광 분산 밴드를 수집하고 버퍼에 대한 dialyze.
  14. 4에 VNPs (아래)와 상점을 특징 ° C. 장기 저장을 위해, -80에 저장 ° C.를
CPMV 및 TMV 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0)
38.5 MM KH 2 PO 4
61.5 MM K 2 HPO 4
PVX 0.5 M borate 버퍼 (산도 7.8)
0.5 M 붕소의 산성
NaOH로 pH를 조정
BMV 사마 버퍼 (산도 4.5)
250 MM 나트륨 아세테이트
10 MM MgCl 2
이 MM β-메르 캅토 에탄올 (신선한 추가)

표 2. 각 VNP에 대한 버퍼 및 요리법.

참고 : CPMV 전파가 예제로 증명된다.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, 그리고 TMV) 특성

  1. VNPs의 농도를 결정하기 위해 UV / 눈에 보이는 분광을 수행합니다.
    1. NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 샘​​플 2 μl의 흡광도를 측정합니다.
    2. 맥주 램버트 법을 사용하여 입자와 염료의 농도를 결정 (A는 흡광도입니다 A = εcl, ε 흡광 계수이며, C는 농도이며, 전 경로 길이입니다.) 경로 길이는 NanoDrop에 0.1 cm입니다.
      VNP 별 흡광 계수는 다음과 같습니다
      CPMV : 8.1 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
      PVX : 2.97 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
      TMV : 3.0 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
      BMV : 5.15 cm -1 MG -1 ML (260 nm의에서)
  2. 크기 제외 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)에 의해 입자를 분석합니다.
    1. Superose 6 크기 배제 컬럼과 악타 익스플로러, 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼 (산도 7.0) 200 μl에 VNPs의 부하 50-100 μg을 사용합니다.
    2. 260 나노 미터 (핵산), 280 nm의 (단백질), 그리고 연결된 염료의 여기 파장에 감지기를 설정합니다.
    3. 72 분 동안 0.5 ML / 분의 유량으로 실행합니다.
    4. 용출 프로필과 A260 : A280 나노 미터는 VNP 준비가 순수 여부와 입자가 온전하고 조립 있는지 여부를 나타냅니다.
      다음 A260 : 280 비율이 순수한 VNP 준비를 나타냅니다 :
      CPMV : 1.8 ± 0.1
      PVX : 1.2 ± 0.1
      TMV :1.1 ± 0.1
      BMV : 1.7 ± 0.1
  3. 개별 코트 단백질에 준비 및 활용의 순도를 분석 할 (예정 주물 NuPAGE) 비스 - 트리스의 polyacrylamide 4-12% 기울기 겔 전기 영동을 denaturing 수행합니다.
    1. 인산 칼륨 버퍼의 9 μl에있는 입자의 10 μg에 4X LDS 샘플 버퍼 3 ML을 추가합니다. 이황화 채권의 높은 수를 줄이기 위해 BMV에 4X LDS 샘플 버퍼와 β-메르 캅토 에탄올 3 μl의 추가 1 μl를 추가합니다.
    2. 100 5 분에 열 블록에 품다 ° C.
    3. SDS 젤에 샘플을로드합니다.
    4. 버퍼를 실행 1X 걸레에 1 시간에 대해 200 V에서 샘플을 실행합니다.
    5. 형광 코트 단백질을 시각화하기 위해 UV 빛 아래에있는 젤을 문서화.
    6. 비 형광 단백질의 경우 1 시간에 Coomassie 블루 (0.25 % (w / V) Coomassie 브릴리언트 블루 R-250, 30 % (V / V) 메탄올, 10 % (V / V) 아세트산 산)와 얼룩.
    7. 밤새 30 % 메탄올, 10 % 아세트산과 Destain. 찬GE는이 솔루션이 필요합니다.
    8. 하얀 빛 아래 젤을 문서화.
  4. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의한 입자의 무결성을 분석합니다.
    1. 0.1-1 MG / DI 물을 20 μl의 ML에 샘플을 희석.
    2. Parafilm에있는 샘플의 20 μl 방울을 넣으십시오.
    3. TEM 그리드와 방울을 커버 2 분 동안 앉아 보자. 필터 종이 그리드에 초과 솔루션을 위크.
    4. 드라이 wicking 후 DI 워터 드롭 배치하여 격자를 씻으십시오.
    5. 2 % 20 μl 드롭 (w / V) 2 분에 대한 uranyl 아세트산에 배치하여 격자를 청바지. 필터 종이 얼룩 초과를 위크.
    6. 물에 한 번 더 그리드를 씻으십시오.
    7. 전송 전자 현미경으로 격자를 관찰.

4. PEG와 Fluorophores, 정제 및 특성과 VNPs의 화학 결합

  1. 아래의 반응에 대한 계산은 VNPs의 몰 질량은 다음과 같습니다
    CPMV : 5.6X 10 6 G / 몰
    PVX : 35 X 10 6 G / 몰
    TMV : 41 X 10 6 G / 몰
    BMV : 4.6 X 10 6 G / 몰
  2. 한 단계 N-하이드 록시 succinimide 커플 링 반응을 이용하여 CPMV과 PVX의 표면 lysines에 염료와 PEG를 공액 : 알렉사 형석 647 succinimidyl 에스테르 및 4500 등가물의 2500 몰 등가물 (모든 어금니 과도한는 VNP 당 어금니를 초과 참조) 추가 NHS를 PEG (MW 5,000) 0.1 M의 칼륨 인산 버퍼에 CPMV에 DMSO에 용해. PVX와 함께 작업 할 경우 NHS-염색 및 NHS-PEG의 만 몰 초과를 추가합니다. CPMV와 PVX의 최종 농도가 2 밀리그램 / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 빛으로부터 보호 상온에서 반응 혼합물은 하루 아침에 품다. CPMV 및 PVX는 각각 300 및 1270 번지 lysines 있습니다. (독자가에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다CPMV 및 PVX의 화학 수정 : 13-15).
  3. diazonium 커플 링에 의한 TMV의 tyrosines에 공액 염료와 PEG는 구리 (I) 촉매 azide - alkyne cycloaddition이 나타납니다.
    1. 0.3 M P-toluenesulfonic의 산성 일 수화물, 3.0 M의 아질산 나트륨의 25 μl, 그리고 0.68 M 소주 1 시간에 대해 4 ° C에서 아세토 니트릴에 용해 3 ethynylaniline의 75 μl 400 μl를 혼합하여 diazonium 염 (alkyne)를 준비합니다.
    2. TMV의 1.25 ML (20 MG / ML 주식 솔루션)에 NaCl 100 MM를 포함하는 borate 버퍼, 산도 8.8의 3.3 ML를 추가합니다.
    3. alkyne 결합이 diazonium 커플 링으로 TMV에 처리 추가하는 3 시간에 얼음 욕조에서 diazonium 염 (alkyne) 솔루션 450 μl로 TMV를 반응한다. 이 솔루션은 밝은 갈색 컬러로 돌아갈 것입니다. TMV는 활용을위한 2140 사용할 수 tyrosines 있습니다.
    4. 단계 4.4에 설명 된대로 자당의 쿠션을 사용하여 최종 제품을 정화.
    5. azide - 기능 알렉사 형석 647 및 PEG-azide (MW 5,000) 쓰겠다고를 첨부g의 구리 (I) 촉매 azide - alkyne의 cycloaddition (CuAAC). 1 ㎜ CuSO 4, 2 MM의 AMG, 그리고 15 분 동안 실온에서 2 MM 나트륨 아스 코브 산으로 코트의 단백질과 품다 당 염료 및 PEG-azide 2 동등을 추가합니다. TMV의 최종 반응 농도가 2 밀리그램 / ML이라는 버퍼 볼륨 등 조정합니다. (: 16,17 리더는 TMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.)
  4. lysines 및 BMV 시스테인 돌연변이 (cBMV)의 cysteine​​s에 PEG에 염료를 변화시키다 :
    1. 0.1 M TNKM 버퍼 (50 MM 트리스베이스, 50 MM NaCl, 10 MM KCl, 5 MM MgCl 2, 산도 7.4)에 cBMV에 DMSO에 용해 오레곤 그린 488 succinimidyl 에스테르 2,000 몰 동등을 추가합니다. BMV의 최종 농도가 1 MG / ML 및 DMSO 콘텐츠가 전체 반응 부피의 10 %입니다 그러한 버퍼와 DMSO 볼륨을 조정합니다. 4에서 하룻밤 반응 혼합물을 품어 ° C 빛으로부터 보호되고 있습니다.
    2. centri를 사용하여 정화 입자같은 fugal 필터는 단계 4.4에 설명되어 있습니다.
    3. 이전과 동일한 반응 조건을 사용하여 PEG-maleimide (MW 2000)의 2000 몰 초과를 추가하고 4시에 2 시간의 반응 혼합물을 품어 ° C. cBMV 180 반응 lysines과 cysteine​​s 있습니다. (: 18 리더는 BMV의 화학 수정에 대한 추가 읽기를 위해 다음과 같은 참조라고합니다.)
  5. 정제 : 2.5 시간에 160,000 XG의 40 % (w / V) 자당의 쿠션을 통해 솔루션을 전달합니다. 버퍼에 펠렛를 다시 분해. 또한, 10 kDa 컷 - 오프 스핀 필터를 사용 적절한 버퍼에 대한 dialyze.
  6. 특성화 : PEGylated과 휘황-라벨 VNPs은 위에서 설명한 방법 사용 분석 : 표시 / UV 분광, SDS 겔 전기 영동, FPLC, 그리고 TEM (미도 그러나,도 6 및 7 참조).

5. 마우스 이종 이식 모델을 사용하여 종양 타겟팅 및 이미징

  1. 문화 HT-29 RPMI 매체에서 인간 대장 암 세포는 175cm이 세포 배양 플라스크를 사용하여 5 % CO 2 5 % FBS, 37시 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신, 그리고 1% L-글루타민 ° C로 보충.
  2. 5 분에 37 ° C에서 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 5 ML과 잠복기에 의해 멸균 PBS와 수확을 두 번 세포를 씻으십시오. RPMI 매체의 5 ML과 트립신을 비활성화. 5 분 500 XG에 centrifuging하여 세포를 수집합니다. 4에 5x10 6 cells/50 μl 매체 (trypan 파랑과 hemocytometer를 사용하여 총 세포 수를 결정)에 신선한 RPMI에서 ° C와 resuspend. 주사 (모든 솔루션 및 시약은 멸균 유지) 이전에 matrigel의 동일한 볼륨으로 섞는다.
  3. 조달 6 주 이전 NCR 뉴 / 뉴 마우스, 2 주 알팔파 무료로 다이어트를을 유지하고 있습니다. [참고 :. 모든 동물 절차는 IACUC 승인해야합니다]의 피하 주입하여 종양 xenografts을 유발 5x10 6 cells/100 멸균 18 2분의 1 게이지를 사용하여 측면에서 μl / 종양 (2 종양 / 마우스)바늘. 정기적으로 동물을 모니터링 할 수 있습니다. 캘리퍼스를 사용하여 종양 크기를 측정하고 종양 20mm 3 (향후 12 일 이내)의 평균 볼륨으로 성장 할 수 있습니다. PBS와 VNP (N = 3 동물 / 그룹 / 시간 점) : 무작위로 두 개의 서로 다른 그룹에 쥐를 지정합니다. 1 ML 28 게이지 인슐린 주사기를 사용 정맥 주사 멸균 PBS의 꼬리 정맥 주입 100 μl 또는 10 밀리그램 / kg V​​NP 제제에 의해 관리 할 수​​ 있습니다.

참고 : 라이브 동물과 조직 문화 실험과 연구가 증명되지 않습니다. 손 -에 시범 조직 처리 및 데이터 수집으로 제한됩니다. HT-29 종양의 이종 이식 모델에서 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. 19

세 기술은 VNPs의 유도 종양을 평가하는 데 사용됩니다 :

  1. CO 2를 사용하여 다른 시간 지점 (2, 24, 72 시간)에 희생 마우스 : 마에스트로 이미징 시스템을 사용하여 형광 이미징가스. 측면에있는 종양과 함께 동물과 소비세 모든 주요 기관 (뇌, 심장, 폐, 비장, 신장, 간) 해부, parafilm에 조직을 배치하고, (800 밀리 노란색 여기와 방출 필터를 사용 형광 이미징 장비와 분석 조직에서 형광 신호 (VNPs에 복합 A647 레이블에서 파생)의 존재를 감지 노출). 이미지를 저장하고 ImageJ 1.44o 소프트웨어 (사용 형광 농도 분석 http://imagej.nih.gov/ij을 ). 시간이 주요 조직과 종양의 VNPs의 이해의 패턴을 비교합니다.
  2. 이미징 후, 반으로 각 조직을 잘라 cryo-sectioning 및 공 촛점 분석 10월 화합물에 반을 삽입 할 수 있습니다. 미리 무게 cryo-병에 나머지 절반을 수집하고 즉시 액체 N 2를 사용 동결. 스토어 -80 ° C에서 추가 처리를위한 준비가 될 때까지.
  3. 형광 정량화 : 재코드는 조직 가중치를. 실온에서 냉동 조직을 해동하고 PBS 1 ML을 포함하는 별도의 50 ML 팔콘 튜브에 배치합니다. 휴대용 조직 균질를 사용하여 PBS에서 2-3 분을위한 조직을 균질화 한 후 microfuge 튜브에 homogenate를 전송합니다. 비 무균 조직을 제거하는 13,000 XG에서 10 분의 homogenates을 원심 분리기.
  4. 384도 검은 색 UV 판에 각 그룹 (PBS 및 VNP 공법 / 시간 점)에서 조직의 표면에 뜨는의 Pipet 100 μl. 접시 리더를 사용하여 형광 강도를 (예 / EM 파장 665분의 600) 평가합니다. 조직 가중치에 의해 얻은 형광 값을 정상화.
  5. Immunohistochemistry : -20 ° C.에 cryo-마이크로톰 섹션 (10 μm)와 상점을 준비 세포 핵 (DAPI)과 내피 세포 마커 (CD31 항체 안티 - 마우스 FITC-라벨)에 대한 조직 섹션을 청바지. 휘황 - 라벨 VNP의 혈관과 간 tumoral 현지화를 매핑 할 공 촛점 현미경 분석을 수행s입니다.

참고 :이 절차는 증명되지 않습니다 대리인 데이터는 그림 8에 표시됩니다. immunohistochemistry와 설명 착색 방법에 대한 참조를 들어, 리더는 심판이라고합니다. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

이 프로토콜은 생체 종양 이미징에 대한 VNPs 및 응용 프로그램의 화학 조작을위한 접근 방식을 제공합니다. 여기에 제시된 동물 형광 이미징, 형광 정량화 및 immunohistochemistry 기술 biodistribution을 공부하고 종양 추적 평가하는 데 유용합니다. 이 기술은 EPR 효과를 통해 종양에 나노 입자의 접근에 관한 귀중한 정보를 제공합니다. 다양한 분석 방법의 결과를 결합하여, 우리는 VNPs의 지역화와 biodistribution을 평가하기위한 강력한 방법을.

이러한 연구는 그러나 수행 할 수 있습니다 전에, 순수한 바이러스 준비를 얻기 위해 필수적입니다. 이외에도 기계 접종에서 VNP 전파에 대한 가능한 대안은 높은 변화와 축적 속도를 가질 수 agroinfiltration입니다. VNPs를 전파 할 때주의가 별도의 t와 같은 다른 바이러스에 감염된 식물을 유지하기 이동해야합니다교차 오염을 방지 O. 특히, TMV는 쉽게 확산과 기계적으로 전송됩니다. 염두에두고해야 할 또 다른 중요한 단계는 얼음에 또는 4 ° C.에서 바이러스 정화를 수행합니다 모든 버퍼는 얼음처럼 차가워를 사용합니다. 낮은 온도 프로테아제와 식물 재료에 존재하는 산화 효소의 결과로 VNPs의 손상을 방지 할 필요가 있습니다.

정화 VNPs의 낮은 수율은 여러 요소에서 발생할 수 있습니다. 가능한 원인은 전파에 사용되는 VNPs의 시대가 될 수 있습니다. 그것은 최근 바이러스 준비를 사용하는 것이 바람직합니다. 예를 들어, CPMV의 S 코트 단백질의 C-말단 24 아미노산은 유전자 입을의 억제를위한 필요합니다. 이 표면 노출 지역의 삭제는 proteolysis로 인해 시간이 지남에 발생합니다. CPMV의 구조와 안정성이 영향을받지 않습니다 있지만, 성장 지체 및 지연이 바이러스 결과의 확산. 낮은 수율의 또 다른 소스 정화하는 동안 VNPs의 손실입니다. 의 특정tention는 PEG 강수량 후 resuspension 단계에 부여해야합니다. 펠렛의 불완전한 resuspension는 다음 원심 분리 단계의 펠렛에서 길을 잃었 VNP 될 것입니다.

전반적으로, 여기에 제시된 bioconjugation 화학은 간단합니다. 설명 14,17,18,21 특성화 방법은 입자의 무결성을 보장하고 활용의 범위를 결정하는 가치가 있습니다. 어금니 과도한는 그에 따라 응용 프로그램 및 원하는 작용의 정도에 따라 조정할 수 있습니다.

마우스 이종 이식 모델로 작업 할 때, 가장 중요한 연습은 무균 기술을 따라하고 있습니다. 또한, 꼬리 정맥 주입은 각 마우스에 대한 균일 한 샘플 복용량을 보장하는 중요한 단계입니다. 그것은 미리 정맥을 치료하는데 따뜻한 물에 꼬리를 배치하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또 다른 고려 사항은 형광 이미징 및 측정에 대한 autofluorescence입니다. 일반적으로 조직 autofluorescence은 minimiz입니다이미징 프로브와 같은 최적의 600 nm의 이상 방출 맥시멈으로 긴 파장 염료를 만드는 600 나노 미터, 이후 거구나. 그러나, 정상적인 마우스 식단은 붉은 색 fluoresces 엽록소 함유 알팔파,로 구성되어 있습니다. 그 결과, 배경 신호를 줄이기 위해 최소 2 주 동안 알팔파 무료로 다이어트에 쥐를 유지하기 위해 필요한 것입니다. 마지막으로,이 형광 이미징을 사용하여 형광 검출 인해 다양한 조직의 분산 및 흡수 환경의 차이로 제한됩니다 것을인지해야합니다. 정량화가 조직 homogenates를 사용하여 수행하는 동안 따라서, 영상은 시각화를 위해 및 모니터링 biodistribution에 대한 초기 방법으로 사용됩니다.

플랫폼 기술로 VNPs을 사용의 장점은 자신의 monodispersity, biocompatibility, 스케일 업 생산을위한 능력, 여러 작용 전략에 복종 할 의무입니다. 화학 공학뿐만​​ 아니라, 유전 공학은 introduc과 함께 도시된다bioconjugation의 대상으로 BMV하는 cysteine​​s의 기. 유전 공학은 펩티드 또는 선호도 태그를 타겟으로 소개하는 데 사용할 수 있습니다. 설명 된 프로토콜 (염료 및 PEG) 입자 이중 라벨을 활용 있지만, 지속적인 연구 조직 특이성 및 치료 효능을 향상시키기 위해 추가 기능을 (즉, 치료학 타겟팅) 통합을 찾고 있습니다. 따라서, 이러한 방식은 미래의 의학 응용 프로그램의 토대를 낳는다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 NIH / NIBIB 보조금 R00 EB009105 (NFS로)와 P30 EB011317 (NFS에), NIH / NIBIB 훈련 보조금 T32 EB007509 (AMW에), 케이스 웨스턴 리저브 대학의 학제 연합 투자 기금 (NFS로)에 의해 지원되었다 및 사례 종합 암 센터 보조금 P30 CA043703 (NFS로). 우리는의 Steinmetz 연구실 학부 학생 연구원에게 감사 실질적인 지원 : 나디아 Ayat, 케빈 첸, Sourav (SID) 데이, 앨리스 양 샘 알렉산더, 크레이그 D' 크루즈 스티븐 왜가리, 로렌 랜돌프, 브라이언 그래서 바울 Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
에 대한 바이러스 나노 입자<em&gt; 생체에</em&gt; 종양 이미징
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter