Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Viral Nanopartikler for doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

Plant viral nanopartikler (VNPs) er lovende plattformer for applikasjoner i biomedisin. Her beskriver vi prosedyrene for plante VNP forplantning, rensing, karakterisering og bioconjugation. Til slutt viser vi anvendelsen av VNPs for tumor homing og bildebehandling ved hjelp av en mus xenograft modell og fluorescens bildebehandling.

Abstract

Bruken av nanomaterialer har potensial til å revolusjonere materialer vitenskap og medisin. For tiden er en rekke ulike nanopartikler under etterforskning for bruk i bildebehandling og terapi. Viral nanopartikler (VNPs) stammer fra planter kan betraktes som selvkonfeksjonerte bionanomaterials med definerte størrelser og former. Plante virus under etterforskning i Steinmetz lab inkluderer icosahedral partikler dannet av Cowpea mosaikk virus (CPMV) og Brome mosaikk virus (BMV), som begge er 30 nm i diameter. Vi utvikler også stavformede og trådformede strukturer avledet fra følgende plante virus: Tobakk mosaikk virus (TMV), som danner stive stenger med dimensjoner på 300 nm etter 18 nm, og potet Virus X (PVX), som danner filamentous partikler 515 nm i lengde og 13 nm i bredden (leseren er henvist til refs. 1 og 2 for ytterligere informasjon om VNPs).

i planta, er usedvanlig stabil, og biokompatibelt. Også VNPs er "programmerbare" enheter, som kan være spesielt utviklet med genmodifisering eller kjemiske bioconjugation metoder 3. Strukturen av VNPs er kjent for atom oppløsning, og modifikasjoner kan utføres med romlig presisjon på atomnivå 4, et nivå av kontroll som ikke kan oppnås ved hjelp av syntetiske nanomaterialer med dagens state-of-the-art teknologi.

I denne artikkelen beskriver vi utbredelsen av CPMV, PVX, TMV, og BMV i Vigna ungiuculata og Nicotiana benthamiana planter. Ekstraksjon og rensing protokoller for hver VNP er gitt. Metoder for karakterisering av renset og kjemisk-merkede VNPs beskrives. I denne studien har vi fokus på lmemical merking av VNPs med fluoroforer (f.eks Alexa Fluor 647) og polyetylenglykol (PEG). Fargestoffer rette sporing og påvisning av VNPs 5-10, og PEG reduserer immunogenisiteten av de proteinholdige nanopartikler og samtidig forbedre deres farmakokinetikk 8,11. Vi viser tumor homing av pegylert VNPs ved hjelp av en mus xenograft svulst modell. En kombinasjon av fluorescens avbildning av vev ex vivo ved hjelp av Maestro Imaging System, fluorescens kvantifisering i homogenisert vev, og konfokalmikroskopi brukes for å studere biodistribusjon. VNPs cleares via det retikuloendoteliale system (RES), tumor homing oppnås passivt via forbedret permeabilitet og retensjon (EPR) effekt 12. Den VNP nanoteknologi er et kraftfullt plug-and-play-teknologi til bilde og behandle områder av sykdom in vivo. Vi videreutvikle VNPs å bære bedøve cargos og klinisk relevante bildebehandling molekyldeler samt vevsspesifikke ligander tilmålrette molekylære reseptorer overexpressed i kreft og hjerte-og karsykdommer.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, og TMV) Propagation

  1. Still innendørs plante kammeret kontrollerer til 15 hr på dagen (100% lys, 25 ° C, 65% fuktighet) og 9 hr av natten (0% lys, 22 ° C, 60% fuktighet).
  2. Inokuler planter ifølge tidslinjen i Tabell 1.
CPMV PVX, TMV, og BMV
Dag 0: Plant tre cowpea frø / potten. Dag 0: Plant ~ 30 N. benthamiana frø / potten. Gjødsle en gang i uken med en spiseskje kunstgjødsel / 5 L vann.
Dag 14: Re-pot N. benthamiana på en plante / potten.
Dag 10: Infect etterlater primære blader med CPMV (5 μg/50 ul / blad) med mekanisk inokulering med en liten skur av karborundum. Dag 28: Infect tre til five blader med PVX, TMV, eller BMV (5 μg/50 ul / blad) med mekanisk inokulering med en liten skur av karborundum.
Dag 20: Høst blader og oppbevar den i -80 ° C. Dag 42: Høst blader og oppbevar den i -80 ° C.

Tabell 1. Tidslinje for dyrking, infiserer, og høsting blader.

Merk: Kun CPMV forplantning vist som et eksempel.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, og TMV) Rensing

Merk: Alle trinn utføres på is eller ved 4 ° C.

  1. Homogenisere 100 g frosne bladene i en standard blander med 2 volumer av kald buffer (se Tabell 2). Filtrer gjennom 2-3 lag med cheesecloth.
  2. For PVX, justere pH til 6,5 ved anvendelse av 1 M HCl. Legg 0,2% (w / v) askorbinsyre og 0,2% (w / v) natrium Sulfite.
  3. Sentrifuger råolje anlegget homogenat på 5500 xg i 20 min. Samle supernatant.
  4. For BMV, lag 25 ml av supernatant over 5 ml 10% (w / v) sukrose-løsning. Sentrifuge ved 9000 x g i 3 hr og resuspender pellets i 38,5% CsCl løsning (w / v). Mix ved risting for 5 timer, og deretter fortsette med trinn 2.12.
  5. Pakk plantemateriale ved tilsetning 0,7 volumer 1:1 (v / v) kloroform :1-butanol. Rør blandingen i 30-60 min.
  6. Sentrifuger løsning på 5500 xg i 20 min. Samle øvre vandige fasen.
  7. Legg NaCl til 0,2 M og 8% (w / v) PEG (MW 8000). For TMV, også legge 1% (v / v) Triton X-100. Omrør i minst 1 time, deretter la sitte i minst 1 time.
  8. Sentrifuger oppløsningen ved 15.000 xg i 15 min. Gjensuspender pellet i 10 ml buffer. For PVX legger 0,1% β-merkaptoetanol og urea til 0,5 M.
  9. Sentrifuger ved 8000 xg i 30 min, og samle supernatant.
  10. Ultrasentrifuge supernatant ved 160.000 xg i 3 timer. Gjensuspender pellet i 5 ml buffer overnight.
  11. Forberede en 10-40% sukrosegradient hjelp like volumer av 10%, 20%, 30%, og 40% sukrose i buffer (tyngste først). Tillat graderingen å ekvilibrere over natten ved romtemperatur.
  12. Ultrasentrifuger resuspendert pellet i sukrosegradient ved 100.000 xg i 2 timer (24 timer for BMV).
  13. Samle lysspredning band og Dialyser mot buffer.
  14. Karakterisere VNPs (under) og lagre ved 4 ° C. For langtidslagring, lagre ved -80 ° C.
CPMV og TMV 0,1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7,0)
38,5 mm KH 2 PO 4
61.5 mm K 2 HPO 4
PVX 0,5 M boratbuffer (pH 7,8)
0,5 M borsyre
Juster pH med NaOH
BMV SAMA buffer (pH 4.5)
250 mM natriumacetat
10 mM MgCl 2
2 mM β-mercaptoethanol (legg fersk)

Tabell 2. Buffere og deres oppskrifter for hver VNP.

Merk: Kun CPMV forplantning vist som et eksempel.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, og TMV) karakterisering

  1. Utfør UV / synlig spektroskopi for å bestemme konsentrasjonen av VNPs.
    1. Mål absorbansen 2 pl av prøve ved hjelp av en NanoDrop spektrofotometer.
    2. Bestemme konsentrasjonen av partikler og fargestoffer ved hjelp av Beer-Lambert loven (A = εcl, hvor A er absorbans, ε er ekstinksjonskoeffisient, er c konsentrasjonen, og l er veilengden). Banen lengde er 0,1 cm for NanoDrop.
      De VNP-spesifikke utryddelse koeffisientene er:
      CPMV: 8.1 cm -1 mg -1 ml (ved 260 nm)
      PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (ved 260 nm)
      TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (ved 260 nm)
      BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (ved 260 nm)
  2. Analyser partikler ved størrelse-ekskludering rask protein-væskekromatografi (FPLC).
    1. Ved hjelp av en Superose 6 størrelse-exclusion stammen og Akta Explorer, last 50-100 ug VNPs i 200 ul 0,1 M kaliumfosfatbuffer (pH 7,0).
    2. Still detektorer til 260 nm (nukleinsyre), 280 nm (protein), og eksitasjonsbølgelengde eventuelle fargestoffer vedlagt.
    3. Kjør ved en strømningshastighet på 0,5 ml / min i 72 min.
    4. Elueringen profil og A260: A280 nm indikerer om VNP forberedelse er ren og om partiklene er intakt og montert.
      Følgende A260: 280 forholdstall indikerer en ren VNP forberedelse:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1.2 ± 0.1
      TMV:1.1 ± 0.1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Utfør denaturering (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris polyakrylamid 4-12% stigning gelelektroforese for å analysere renheten av forberedelser og konjugering til individuelle pels proteiner.
    1. Tilsett 3 ml av 4x LDS prøvebuffer til 10 ug av partiklene i 9 pl kaliumfosfatbuffer. Legge til en ekstra 1 ul 4x LDS prøvebuffer og 3 pl av β-merkaptoetanol til BMV å redusere det høye antallet disulfidbindinger.
    2. Inkuber i varme blokk i 5 min ved 100 ° C.
    3. Laster prøver på en SDS gel.
    4. Kjør prøver ved 200 V i 1 time i 1x MOPS kjører buffer.
    5. Dokumentere gel under UV-lys for å visualisere fluorescerende pels proteiner.
    6. For ikke-fluorescerende protein, flekken med Coomassie blå (0,25% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) metanol, 10% (v / v) eddiksyre) i 1 time.
    7. Destain med 30% metanol, 10% eddiksyre over natten. Change løsningen hvis nødvendig.
    8. Dokumentere gel under hvitt lys.
  4. Analyser integriteten partikler ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM).
    1. Fortynn prøvene til 0,1-1 mg / ml i 20 pl av DI-vann.
    2. Plasser 20 ul dråper prøvene på Parafilm.
    3. Dekk dråper med en TEM rutenett og la sitte i 2 min. Veke av overflødig løsning på rutenettet med filter papir.
    4. Vask rutenett ved å plassere på en dråpe DI vann og deretter fukttransporterende tørr.
    5. Stain rutenett ved å plassere på en 20 pl dråpe av 2% (w / v) uranyl acetat i 2 min. Veke av overflødig flekken med filter papir.
    6. Vask rutenett gang i vann.
    7. Observere rutenett under et transmisjonselektronmikroskop.

4. Kjemisk Bøyning av VNPs med PEG og fluoroforer, rensing og karakterisering

  1. For beregninger for reaksjonene nedenfor, den molare massen av VNPs er:
    CPMV: 5.6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Konjugat fargestoffer og PEG til overflaten lysines av CPMV og PVX ved hjelp av en ett-trinns N-hydroxy succinimid koblingsreaksjon: Legg 2500 molekvivalenter (alle molare utskeielser referere til molar overskudd per VNP) av Alexa Fluor 647 succinimidyl ester og 4500 ekvivalenter NHS- PEG (MW 5000) oppløst i DMSO til CPMV i 0,1 M kaliumfosfatbuffer. Når du arbeider med PVX, legge en 10.000 molar overskudd av NHS-dye og NHS-PEG. Juster buffer og DMSO volumer slik at den endelige konsentrasjonen av CPMV og PVX er 2 mg / ml og DMSO innholdet er 10% av det totale reaksjonsvolum. Inkuber reaksjonsblandingen over natten ved romtemperatur beskyttet mot lys. CPMV og PVX har 300 og 1270 adresserbare lysines, henholdsvis. (Leseren refereres til følgende referanser for videre lesing påkjemisk modifisering av CPMV og PVX: 13-15).
  3. Konjugerte fargestoffer og PEG til tyrosiner av TMV etter diazonium kopling etterfulgt av kobber (I)-katalysert azide-alkyne cycloaddition.
    1. Forbered diazoniumsalt (alkyne) ved å blande 400 pl av 0,3 M p-toluensulfonsyre monohydrat, 25 pl av 3,0 M natriumnitritt og 75 pl av 0,68 M destillert 3-ethynylaniline oppløst i acetonitril ved 4 ° C i 1 time.
    2. Legg 3,3 ml boratbuffer, 8,8 pH, inneholdende 100 mM NaCl til 1,25 ml TMV (20 mg / ml stamløsning).
    3. Reagerer TMV med 450 pl av diazoniumsaltet (alkyne) oppløsning i et isbad i 3 timer for å legge en alkyne ligering Håndtak TMV etter diazonium kopling. Løsningen vil bli en lys brun farge. TMV har 2140 ledige tyrosiner for konjugering.
    4. Rense sluttproduktet ved hjelp av en sukrose pute som beskrevet i trinn 4.4.
    5. Fest azide-funksjonelle Alexa Fluor 647 og PEG-azide (MW 5000) using kobber (I)-katalysert azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). Legg 2 ekvivalenter dye-og PEG-azid per strøk protein og inkuber med 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, og 2 mM natriumaskorbat ved romtemperatur i 15 min. Juster buffervolumet slik at den endelige konsentrasjonen av reaksjonen TMV er 2 mg / ml. (Leseren henvises til følgende referanser for videre lesning om kjemisk modifisering av TMV: 16,17).
  4. Konjugat fargestoffer til lysines og PEG til cysteinene av BMV cystein mutant (cBMV):
    1. Legg 2000 molekvivalenter Oregon Grønn 488 succinimidyl ester oppløst i DMSO til cBMV i 0,1 M TNKM buffer (50 mM Tris-base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM 2 MgCl, pH 7,4). Juster buffer og DMSO volumer slik at den endelige konsentrasjonen av BMV er 1 mg / ml og DMSO innholdet er 10% av det totale reaksjonsvolum. Inkuber reaksjonsblandingen over natten ved 4 ° C beskyttet mot lys.
    2. Rens partikler med sentrifugeresfugal filtre som beskrevet i trinn 4.4.
    3. Legg 2.000 molart overskudd av PEG-maleimid (MW 2000) anvendelse av de samme reaksjonsbetingelsene som før og inkuber reaksjonsblandingen i 2 timer ved 4 ° C. cBMV har 180 reaktive lysines og cysteinene. (Leseren refereres til følgende referanser for videre lesning på kjemisk modifikasjon av BMV: 18).
  5. Rensing: Før løsningen gjennom en 40% (w / v) sukrose pute ved 160.000 xg 2.5 hr. Gjenoppløs pelleten i bufferen. Alternativt Dialyser mot nødvendig buffer bruke 10 kDa cut-off spin filtre.
  6. Karakterisering: pegylert og fluorescently-merket VNPs analyseres med de ovenfor beskrevne metoder: UV / synlig spektroskopi, SDS gel elektroforese, FPLC og TEM (ikke vist, men se fig 6 og 7).

5. Tumor målretting og bildebehandling ved hjelp av en mus xenograft modell

  1. Kultur HT-29 humane tykktarm kreftceller i RPMI medium supplert med 5% FBS, 1% penicillin-streptomycin, og 1% L-glutamin ved 37 ° C i 5% CO 2 ved 175 cm 2 cellekultur kolber.
  2. Vask celler to ganger med steril PBS og innhøsting ved inkubering med 5 ml trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5 min. Inaktivere trypsin med 5 ml RPMI medium. Samle celler ved sentrifugering ved 500 xg i 5 minutter. ved 4 ° C og resuspender i frisk RPMI ved 5x10 6 cells/50 pl medium (bestemme total celletall hjelp Trypan blå og en hemocytometer). Bland med en likt volum Matrigel før injeksjon (holde alle løsninger og reagenser sterilt).
  3. Skaffe seks uker gamle NCR nu / nu mus og vedlikeholde dem på en alfalfa diett for to uker. [Merk:. Alle animalske prosedyrer må være IACUC godkjennes] Fremkall tumorxenotransplantater ved subkutan injeksjon av 5x10 6 cells/100 ul / svulst i flankene (2 svulster / mus) med en 18 1/2 måler sterilenål. Overvåke dyrene regelmessig. Måle tumorstørrelse hjelp calipers og lar svulstene vokse til en gjennomsnittlig volum på 20 mm 3 (i løpet av de neste 12 dager). Tildele mus til to forskjellige grupper tilfeldig: PBS og VNP (n = 3 dyr / gruppe / tidspunkt). Ved hjelp av en 1 ml 28 måle insulinsprøyte, administrere ved intravenøs halevenen injeksjon 100 mikroliter sterilt PBS eller 10 mg / kg VNP formulering.

Merk: Cellekulturstudier eksperimenter og studier med levende dyr vil ikke bli vist. Hands-on demonstrasjon vil være begrenset til vev prosessering og datainnsamling. For en referanse på HT-29 tumor xenograft modell, henvises leseren til ref.. 19

Tre teknikker brukes til å evaluere svulst homing av VNPs:

  1. Fluorescens bildebehandling med Maestro Imaging System: Sacrifice mus på ulike tidspunkter (2, 24, og 72 timer) med CO 2gass. Dissekere dyr og avgiftsetaten alle viktige organer (hjerne, hjerte, lunger, milt, nyrer og lever) sammen med svulster på flankene, plasserer vev på parafilm, og analysere med fluorescens bildebehandling instrumentet med gul eksitasjon og utslipp filtre (800 ms eksponering) for å påvise tilstedeværelse av fluorescerende signalene i vev (utledet fra A647 etikett konjugert til VNPs). Lagre bildene og analysere fluorescerende intensiteter med ImageJ 1.44o programvare ( http://imagej.nih.gov/ij ). Sammenligne mønsteret av opptak av VNPs i svulster med andre store vev med tid.
  2. Etter bildebehandling, kutt hver vev i to og legge den ene halvdelen i OCT sammensatt for Cryo-seksjonering og confocal analyse. Samle den andre halvparten i pre-veide Cryo-ampuller og umiddelbart fryse dem med flytende N 2. Lagres -80 ved ° C inntil klar for videre bearbeiding.
  3. Fluorescens kvantifisering: Reledningen vev vekter. Tine frosne vev ved romtemperatur og plassere dem i egne 50 ml Falcon rør som inneholder 1 ml PBS. Ved hjelp av en håndholdt vev homogenisator, homogenisere vevet i 2-3 min i PBS deretter overføre homogenatet til mikrofugerør. Sentrifuger homogenater i 10 minutter ved 13.000 xg for å fjerne ikke-homogeniserte vev.
  4. Pipet 100 ul av supernatanten fra vev fra hver gruppe (PBS og VNP formuleringer / tid poeng) i en 384 godt sort UV plate. Evaluere fluorescensintensitet (Tidligere / Em bølgelengder 600/665) med en plate leser. Normaliser de oppnådde fluorescerende verdier ved vevet vekter.
  5. Immunhistokjemi: Forbered Cryo-mikrotom seksjoner (10 mikrometer) og lagre ved -20 ° C. Stain vev seksjoner for cellekjerner (DAPI) og endotelcelle markør (FITC-merket anti-mus CD31 antistoff). Gjennomføre konfokalmikroskopi analyse for å kartlegge vaskulære og intra-tumoral lokalisering av fluorescently-merket VNPs.

Merk: Denne fremgangsmåten vil ikke påvises, er representative data vist i figur 8.. For en referanse på immunhistokjemi og de ​​beskrevne farvemetoder, henvises leseren til ref.. 19

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen gir en tilnærming for kjemisk modifisering av VNPs og deres applikasjoner for in vivo tumor imaging. The Animal fluorescens bildebehandling, fluorescens kvantifisering, og immunhistokjemi teknikkene som presenteres her er nyttige for å studere biodistribusjon og evaluering svulst homing. Disse teknikkene gir verdifull informasjon om tilgang av nanopartikler til svulsten via EPJ effekt. Ved å kombinere resultatene fra de ulike analysemetoder, får vi en kraftig tilnærming for å vurdere lokalisering og fordelingen av de VNPs.

Før disse studiene kan utføres er det imidlertid nødvendig å skaffe en ren virus forberedelse. Bortsett fra mekanisk inokulering, er et mulig alternativ for VNP forplantning agroinfiltration, som kan ha en høy omdanning og akkumulering rate. Når spre de VNPs, bør man sørge for å holde plantene infisert med ulike virus separat som to unngå krysskontaminering. I særdeleshet er TMV lett spres og overføres mekanisk. En annen kritisk punkt for å være oppmerksom på er å utføre virus rensing på is eller ved 4 ° C. Alle buffere bør brukes iskald. Den lavere temperaturen er nødvendig for å unngå skader på de VNPs som følge av proteaser og oksyderende enzymer tilstede i plantematerialet.

Lave utbytter av rensede VNPs kan oppstå fra flere faktorer. En mulig årsak kan være en alder av VNPs brukes til forplantning. Det er å foretrekke å bruke mer nylige virus preparater. For eksempel, den C-terminale 24 aminosyrer av S belegge proteinet av CPMV er nødvendig for undertrykkelse av genet Silencing. Sletting av denne overflaten eksponert region oppstår over tid på grunn proteolyse. Selv om strukturen og stabiliteten CPMV ikke påvirkes, veksthemming og forsinket spredning av viruset resultatene. En annen kilde til lave utbytter er tap av VNPs under rensingen. Spesielt påtention bør gis til resuspensjon trinn etter PEG nedbør. Ufullstendig resuspendering av pelleten vil medføre VNP tapt i pellet av den påfølgende sentrifugeringstrinnet.

Total, bioconjugation kjemi som presenteres her er grei. Er 14,17,18,21 karakterisering metoder beskrevet verdifull for å sikre partikkel integritet og bestemme omfanget av konjugering. Molare utskeielser kan bli justert tilsvarende avhengig av programmet og graden av funksjonalisering ønsket.

Når du arbeider med musen xenograft modell, er den viktigste praksis etter aseptisk teknikk. I tillegg er halevenen injeksjon et kritisk trinn for å sikre en ensartet prøve dose for hver mus. Det kan hjelpe å plassere halen i varmt vann på forhånd for å utvide venen. En annen vurdering er autofluorescens for fluorescens bildebehandling og målinger. Vanligvis er vev autofluorescens minimized utover 600 nm, noe som gjør lange bølgelengde fargestoffer med utslipp maxima utover 600 nm optimale som bildebehandling sonde. Imidlertid normal mus dietter består av klorofyll-holdige alfalfa, som også fluorescerer rødt. Som et resultat, er det nødvendig å opprettholde de musene på en alfalfa fri diett i minst 2 uker for å redusere bakgrunnssignaler. Til slutt bør det bemerkes at fluorescens deteksjon med fluorescens avbildning er begrenset på grunn av forskjeller i de spredende og absorpsjon miljøene i ulike vev. Følgelig bildebehandling brukes for visualisering og som et innledende metode for overvåking biodistribusjon mens kvantifisering utføres med vev homogenat.

Noen fordeler med å bruke VNPs som plattform teknologien er deres monodispersity, biokompatibilitet, evne til oppskalering produksjon, og amenability til flere funksjonalisering strategier. I tillegg til kjemiteknikk, er genteknologi illustrert her med innføringsjon av cysteinene å BMV som et mål for bioconjugation. Genteknologi kunne også brukes til å introdusere målretting peptider eller affinitet koder. Mens protokollen beskrevet benytter dual-merket (fargestoff og PEG) partikler, er pågående studier ser på å innlemme flere funksjoner (dvs. legemiddelselskap og målretting) for å forbedre vev spesifisitet og terapeutisk effekt. Dermed legger denne tilnærmingen grunnlaget for fremtidige biomedisinske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIBIB tilskudd R00 EB009105 (til NFS) og P30 EB011317 (til NFS), en NIH / NIBIB trening stipend T32 EB007509 (til AMW), en Case Western Reserve University Tverrfaglig Alliance Investment Grant (til NFS), og en sak Comprehensive Cancer Center stipend P30 CA043703 (til NFS). Vi takker Steinmetz Lab undergraduate student forskere for sin hands-on støtte: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Så og Paul Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Viral Nanopartikler for<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter