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Bioengineering

Nanopartículas virais para doi: 10.3791/4352 Published: November 16, 2012

Summary

Nanopartículas de plantas virais (VNPs) são promissoras plataformas para aplicações em biomedicina. Aqui, descrevemos os procedimentos para a propagação de plantas VNP, purificação, caracterização e bioconjugação. Por fim, mostramos a aplicação de VNPs para homing tumor e de imagem usando um modelo de xenoenxerto mouse e imagens de fluorescência.

Abstract

O uso de nanomateriais tem o potencial de revolucionar a ciência de materiais e medicamentos. Actualmente, um número de diferentes nanopartículas estão a ser investigados para aplicações em imagiologia e terapia. Nanopartículas virais (VNPs) derivados de plantas pode ser considerada de auto-montagem bionanomaterials com tamanhos e formas definidas. Vírus de plantas em estudo em laboratório Steinmetz incluem partículas formadas por icosaédrica Cowpea mosaic virus (CPMV) e vírus do mosaico Brome (BMV), ambos os quais são de 30 nm de diâmetro. Também estamos a desenvolver estruturas em forma de bastonete e filamentosas derivados de vírus de plantas os seguintes: vírus do mosaico do tabaco (TMV), o qual forma hastes rígidas com as dimensões de 300 nm por 18 nm, e os vírus da batata X (PVX), que formam as partículas filamentosas 515 nm de comprimento e 13 nm de largura (o leitor é remetido para refs. 1 e 2 para mais informações sobre VNPs).

in planta, são excepcionalmente estáveis ​​e biocompatíveis. Além disso, VNPs são "unidades programáveis", que podem ser especificamente modificados usando a modificação genética ou métodos químicos bioconjugação 3. A estrutura de VNPs é conhecida a resolução atómica, e modificações podem ser efectuadas com uma precisão espacial ao nível atómico 4, um nível de controle que não pode ser conseguido usando os nanomateriais sintéticos com correntes estado-da-arte.

Neste artigo, descreve a propagação de CPMV, PVX, TMV e BMV em Vigna ungiuculata e plantas Nicotiana benthamiana. Extracção e purificação de protocolos para cada VNP são dadas. Métodos para caracterização da purificada e VNPs quimicamente marcados encontram-se descritos. Neste estudo, nos concentramos em chrotulagem emical de VNPs com fluoróforos (por exemplo, Alexa Fluor 647) e polietileno glicol (PEG). Os corantes de rastreamento e facilitar a detecção dos VNPs 5-10, e PEG reduz a imunogenicidade das nanopartículas proteicas enquanto melhora sua farmacocinética 8,11. Demonstramos tumor homing de VNPs peguilado utilizando um rato modelo de xenoenxerto de tumor. Uma combinação de imagens de fluorescência de tecidos ex vivo utilizando Maestro Imaging System, a quantificação da fluorescência em tecidos homogeneizados, e microscopia confocal é utilizada para estudar a biodistribuição. VNPs são limpas por meio do sistema reticuloendotelial (RES); tumor homing de forma passiva, através da maior permeabilidade e efeito de retenção (EPR) 12. A nanotecnologia VNP é um poderoso plug-and-play tecnologia para imagem e tratar locais de doença in vivo. Estamos aprofundar VNPs para transportar cargas de drogas e porções de imagem clinicamente relevantes, bem como tecido-específicos para ligandosalvo receptores moleculares overexpressed em câncer e doenças cardiovasculares.

Protocol

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1. VNP (CPMV, VMB, PVX, e TMV) Propagação

  1. Defina a câmara de plantas de interior controla a 15 horas do dia (100% de luz, 25 ° C, umidade 65%) e 9 horas da noite (luz 0%, 22 ° C, umidade 60%).
  2. Inocular plantas de acordo com a linha do tempo na Tabela 1.
CPMV PVX, TMV e BMV
Dia 0: Fábrica 3 caupi sementes / vaso. Dia 0: Planta ~ 30 sementes de N. benthamiana / vaso. Fertilizar uma vez por semana, com uma colher de sopa de adubo / 5 L de água.
Dia 14: Re-pote N. benthamiana em uma planta / vaso.
Dia 10: Infect deixa folhas primárias com CPMV (5 μg/50 ul / folha) por inoculação mecânica com um pouquinho de carborundum. Dia 28: Infect três a five sai com PVX, TMV, ou BMV (5 μg/50 ul / folha) por inoculação mecânica com um pouquinho de carborundum.
Dia 20: Folhas de Colheita e armazenar a -80 ° C. Dia 42: Folhas de Colheita e armazenar a -80 ° C.

Timeline Tabela 1. Para crescer, infectando e corte de folhas.

Nota: A propagação CPMV só é demonstrada como um exemplo.

2. Purificação VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV)

Nota: Todos os passos são realizados em gelo ou a 4 ° C.

  1. Homogeneizar 100 g de folhas congeladas em um misturador padrão com 2 volumes de tampão frio (ver Tabela 2). Filtrar através de 2-3 camadas de gaze.
  2. Para PVX, ajustar o pH para 6,5 ​​utilizando HCl 1 M. Adicionar 0,2% (w / v) de ácido ascórbico e 0,2% (w / v) de sódio sulfite.
  3. Centrifugar homogenato bruto planta a 5.500 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante.
  4. Para BMV, camada de 25 ml de sobrenadante de mais de 5 ml de 10% (w / v) de uma solução de sacarose. Centrifugar a 9.000 xg durante 3 hr pelotas e ressuspender em 38,5% de solução de CsCl (w / v). Mix agitando durante 5 horas, em seguida, continuar com o passo 2.12.
  5. Extrair o material vegetal por adição de 0,7 volumes de 1:1 (v / v) de clorofórmio :1-butanol. Agita-se mistura durante 30-60 min.
  6. Centrifugar solução a 5500 xg durante 20 min. Recolher a fase aquosa superior.
  7. Adicionar NaCl a 0,2 M e 8% (w / v) de PEG (PM 8000). Para TMV, também adicionar 1% (v / v) de Triton X-100. Agita-se durante pelo menos 1 h, em seguida, deixar sentar durante pelo menos 1 hr.
  8. Centrifugar solução a 15.000 xg durante 15 min. Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão. Para PVX, adicionar 0,1% de β-mercaptoetanol e de ureia a 0,5 M.
  9. Centrifugar a 8.000 xg durante 30 minutos e recolher o sobrenadante.
  10. Ultracentrífuga sobrenadante a 160000 xg durante 3 hr. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão overnight.
  11. Preparar um gradiente de sacarose de 10-40% o uso de volumes iguais de 10%, 20%, 30% e 40% de sacarose em tampão (mais pesado primeiro). Permitir que o gradiente se equilibre durante a noite à temperatura ambiente.
  12. Ultracentrífuga sedimento ressuspenso sobre gradiente de sacarose a 100.000 xg durante 2 horas (24 horas para BMV).
  13. Colete banda de espalhamento de luz e dializar contra tampão.
  14. Caracterizar os VNPs (abaixo) e armazenar a 4 ° C. Para armazenamento de longo prazo, armazenar a -80 ° C.
CPMV e TMV 0,1 M de tampão fosfato de potássio (pH 7,0)
38,5 mM KH 2 PO 4
61,5 mM de K 2 HPO 4
PVX 0,5 M de tampão de borato (pH 7,8)
0,5 M de ácido bórico
Ajustar o pH com NaOH
BMV SAMA tampão (pH 4,5)
250 mM de acetato de sódio
10 mM de MgCl2
2 mM β-mercaptoetanol (adicionar fresco)

Tabela 2. Buffers e suas receitas para cada VNP.

Nota: A propagação CPMV só é demonstrada como um exemplo.

3. Caracterização VNP (CPMV, VMB, PVX, e TMV)

  1. Realizar a espectroscopia UV / visível para determinação da concentração de VNPs.
    1. Medir a absorvância de 2 ul de amostra, utilizando um espectrofotómetro NanoDrop.
    2. Determinar a concentração de partículas e corantes utilizando a lei de Beer-Lambert (A εcl =, em que A é a absorvância, ε é o coeficiente de extinção, c é a concentração, e L é o comprimento do caminho). O comprimento do percurso é de 0,1 cm para o NanoDrop.
      Os coeficientes de extinção VNP-específicos são os seguintes:
      CPMV: 8.1 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      TMV: 3.0 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
  2. Analisar partículas por exclusão de tamanho de cromatografia líquida rápida de proteína (FPLC).
    1. Usando uma coluna de Superose 6 de exclusão de tamanho e o Explorador Akta, ug de carga 50-100 VNPs em 200 ul de 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0).
    2. Definir detectores de 260 nm (ácido nucleico), 280 nm (proteína) e o comprimento de onda de excitação de quaisquer corantes ligados.
    3. Correr a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min durante 72 min.
    4. O perfil de eluição e A260: A280 nm indica se a preparação VNP é pura e se as partículas estão intactos e montados.
      O A260 seguinte: 280 rácios indicam uma preparação pura VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Executar desnaturação (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris de poliacrilamida de electroforese em gel de gradiente 4-12% para analisar a pureza da preparação e conjugação de proteínas de revestimento individuais.
    1. Adicionar 3 ml de tampão de amostra LDS 4x a 10 ug das partículas em 9 ul de tampão de fosfato de potássio. Adicionar um adicional de 1 ul de tampão de amostra LDS 4x e 3 ul de β-mercaptoetanol a BMV a reduzir o elevado número de ligações dissulfureto.
    2. Incubar em bloco de aquecimento durante 5 minutos a 100 ° C.
    3. Coloque as amostras num gel de SDS.
    4. Executar amostras a 200 V durante 1 hora em MOPS 1x tampão de corrida.
    5. Documentar o gel com luz UV para visualizar proteínas de revestimento fluorescente.
    6. Para não fluorescente proteína, cora com azul de Coomassie (0,25% (w / v) de Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) de metanol, 10% (v / v) de ácido acético) durante 1 h.
    7. Destain com 30% de metanol, 10% de ácido acético durante a noite. Change a solução, se necessário.
    8. Documentar o gel sob luz branca.
  4. Analisar a integridade das partículas por microscopia electrónica de transmissão (TEM).
    1. Diluir as amostras de 0,1-1 mg / ml em 20 ul de água desionizada.
    2. Colocar 20 gotas uL das amostras de Parafilm.
    3. Cobrir gotas com uma grelha TEM e deixe descansar por 2 min. Wick fora o excesso de solução da grelha com papel de filtro.
    4. Lavar grade, colocando sobre uma gota de água desionizada seguida wicking seco.
    5. Stain grade, colocando uma gota de 20 ul de 2% (w / v) de acetato de uranilo, durante 2 min. Wick fora o excesso de corante com papel de filtro.
    6. Lavar grelha mais uma vez em água.
    7. Observe grade sob um microscópio eletrônico de transmissão.

4. Conjugação química de VNPs com PEG e fluoróforos, purificação e caracterização

  1. Para os cálculos para as reacções abaixo, a massa molar dos VNPs são:
    CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Conjugado corantes e PEG a lisinas de superfície de CPMV PVX e utilizando um passo de N-hidroxi-succinimida da reacção de acoplamento: Adicionar 2,500 equivalentes molares (de todos os excessos molares referem-se a um excesso molar por VNP) de éster de succinimidilo Alexa Fluor 647 e 4.500 equivalentes de NHS- PEG (PM 5000), dissolvido em DMSO para CPMV em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio. Quando se trabalha com PVX, adicionar um excesso molar de 10.000 NHS-corante e NHS-PEG. Ajustar os volumes de tampão e DMSO de tal forma que a concentração final de CPMV e PVX é de 2 mg / ml e de teor de DMSO é de 10% do volume total de reacção. Incubar a mistura de reacção durante a noite à temperatura ambiente, protegida da luz. CPMV e PVX tem 300 e 1.270 Usinas endereçáveis, respectivamente. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobremodificação química de CPMV e PVX: 13-15).
  3. Corantes e conjugados de PEG a tirosinas de TMV por acoplamento de diazônio seguido de cobre (I) catalisados ​​cicloadição azida-alcino.
    1. Preparar o sal de diazónio (alcino) através da mistura de 400 ul de 0,3 M de ácido mono-hidratado p-toluenossulfónico, em 25 ul de 3,0 M de nitrito de sódio, e 75 ul de 0,68 M destilado 3-etinilanilina dissolvidos em acetonitrilo a 4 ° C durante 1 h.
    2. Adicionar 3,3 ml de tampão de borato, pH 8,8, contendo 100 mM de NaCl e 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solução stock).
    3. Reagir o TMV com 450 ul da solução de sal de diazónio (alcino) num banho de gelo durante 3 h para adicionar uma ligadura para tratar alcino TMV pelo acoplamento de diazónio. A solução vai se transformar em uma cor marrom claro. TMV tem 2140 tirosinas disponíveis para conjugação.
    4. Purifica-se o produto final utilizando uma almofada de sacarose, tal como descrito no passo 4.4.
    5. Anexar-funcional azida Alexa Fluor 647 e PEG-azida (MW 5.000) using de cobre (I) catalisados ​​cicloadição azida-alcino (CuAAC). Adicionar 2 equivalentes de corante e azida de PEG-proteína de revestimento por e incubar com 1 mM de CuSO 4, 2 mM de AMG, e 2 mM de ascorbato de sódio à temperatura ambiente durante 15 min. Ajustar o volume do tampão de tal modo que a concentração final da reacção de TMV é de 2 mg / ml. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobre a modificação química do TMV: 16,17).
  4. Conjugado corantes para lisinas e PEG para cisteínas de cisteína BMV mutante (cBMV):
    1. Adicionar 2,000 equivalentes molares de Oregon Verde 488 éster de succinimidilo dissolvidos em DMSO a 0,1 M em cBMV TNKM tampão (50 mM de base Tris, 50 mM NaCl, 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, pH 7,4). Ajustar os volumes de tampão e DMSO de tal forma que a concentração final de BMV é de 1 mg / ml e de teor de DMSO é de 10% do volume total de reacção. Incubar a mistura de reacção durante a noite a 4 ° C protegidos da luz.
    2. Purificar partículas usando centrifugais filtros como descrito no passo 4.4.
    3. Adicionar 2,000 excesso molar de PEG-maleimida (MW 2000), utilizando as mesmas condições de reacção como antes, e incubar a mistura reaccional durante 2 horas a 4 ° C. cBMV tem 180 Usinas reativos e cisteína. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobre a modificação química da BMV: 18).
  5. Purificação: Filtrar a solução através de uma almofada de sacarose a 40% (w / v) a 160.000 xg durante 2,5 horas. Re-dissolver o sedimento em tampão. Alternativamente, dializar contra tampão apropriado usando 10 kDa filtros de corte de rotação.
  6. Caracterização: VNPs peguilado e marcado por fluorescência são analisadas utilizando os métodos acima descritos: UV / visível de espectroscopia, electroforese em gel SDS, FPLC, e TEM (não mostrado, no entanto, referem-se as Figuras 6 e 7).

5. Segmentação do tumor e imagem usando um modelo heteróloga Rato

  1. Cultura células HT-29 de cólon humano em meio RPMI suplementado com 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em 5% de CO 2, utilizando 175 centímetros dois frascos de cultura de células.
  2. Lave as células duas vezes com PBS estéril e colheita por incubação com 5 ml de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Inactivar a tripsina com 5 ml de meio RPMI. Recolher as células por centrifugação a 500 xg durante 5 min. a 4 ° C e ressuspender em meio RPMI fresco a 5x10 6 células/50 ul de meio (determinar contagem total de células utilizando azul de tripano e um hemocitómetro). Misturar-se com um volume igual de Matrigel antes da injecção (manter todas as soluções de reagentes e estéril).
  3. Adquirir seis semanas de idade NCR nu / nu e mantê-los em uma dieta de alfafa livre para 2 semanas. [Nota:. Todos os procedimentos com animais deve ser aprovada IACUC] Induzir xenoenxertos de tumor por injecção subcutânea de 5x10 6 células/100 ul / tumor nos flancos (2 tumores / ratinho), utilizando um medidor de 18 1/2 estérilagulha. Monitorar os animais regularmente. Medir o tamanho do tumor usando compassos de calibre e permitir que os tumores a crescer a um volume médio de 20 mm 3 (dentro dos próximos 12 dias). Atribuir ratos a dois diferentes grupos aleatoriamente: PBS e VNP (n = 3 ponto animais / grupo / hora). Utilizando uma seringa de insulina de 1 ml de calibre 28, por administrar a injecção intravenosa da veia da cauda 100 ul de PBS estéril, ou 10 mg / kg de formulação VNP.

Nota: experimentos de cultura de tecidos e estudos com animais vivos não será demonstrado. Demonstração prática será limitado ao processamento de tecido e aquisição de dados. Para uma referência no modelo de xenoenxerto de tumor HT-29, o leitor é remetido para ref 19.

Três técnicas são usadas para avaliar tumor homing de VNPs:

  1. Imagens de fluorescência utilizando Maestro Imaging System: ratinhos sacrifício em pontos de tempo diferentes (2, 24, e 72 horas), utilizando CO 2gás. Dissecar os animais e impostos especiais de consumo todos os principais órgãos (cérebro, coração, pulmões, baço, rins e fígado), juntamente com os tumores nos flancos, coloque os tecidos em parafilme, e analisar com o instrumento usando imagens de fluorescência de excitação amarelo e filtros de emissão (800 ms exposição) para detectar a presença de sinais de fluorescência nos tecidos (derivado de A647 etiqueta conjugados aos VNPs). Salve as imagens e analisar intensidades fluorescentes usando ImageJ 1.44o software ( http://imagej.nih.gov/ij ). Comparar o padrão de absorção das VNPs em tumores com outros tecidos importantes, com o tempo.
  2. Depois de imagem, corte cada tecido ao meio e incorporar um meia no composto outubro para análise crio-secção e confocal. Colete a outra metade em pré-pesados ​​crio-frascos e imediatamente congelá-los usando líquido N 2. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para posterior processamento.
  3. Quantificação de fluorescência: Retecidos da medula pesos. Descongelar os tecidos congelados à temperatura ambiente e colocá-los em diferentes tubos de 50 ml Falcon contendo 1 ml de PBS. Usando um homogeneizador de tecidos de mão, homogeneizar o tecido para 2-3 min em PBS, em seguida, transferir o homogenado a tubos de microcentrífuga. Centrifugar os homogeneizados durante 10 min a 13000 xg para remover o não-tecido homogeneizado.
  4. Pipetar 100 uL do sobrenadante a partir de tecidos de cada grupo (PBS e VNP formulações / pontos de tempo) em uma placa de 384 poços UV preto. Avaliar a intensidade de fluorescência (Ex / Em comprimentos de onda 600/665), utilizando um leitor de placas. Normalizar os valores obtidos fluorescentes pelos pesos de tecido.
  5. Imunohistoquímica: Prepare crio-micrótomo seções (10 m) e armazenar a -20 ° C. Stain secções de tecido para os núcleos das células (DAPI) e marcador de células endoteliais (marcado com FITC anti-ratinho CD31). Realizar análise de microscopia confocal para mapear a localização vascular e intra-tumoral de VNP fluorescente marcados.

Nota: este procedimento não será demonstrada, os dados representativos são apresentados na Figura 8. Para uma referência em imuno-histoquímica e os métodos de coloração descrito, o leitor é remetido para ref 19.

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Discussion

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Este protocolo proporciona uma abordagem para a modificação química da VNPs e suas aplicações para a imagiologia de tumores in vivo. As técnicas de imagem de animais de fluorescência, quantificação de fluorescência, e imunohistoquímica aqui apresentadas são úteis para o estudo de biodistribuição e avaliar tumor homing. Estas técnicas proporcionam informação valiosa sobre o acesso das nanopartículas para o tumor, através do efeito EPR. Ao combinar os resultados dos vários métodos de análise, obtemos uma abordagem poderosa para avaliar a localização e biodistribuição dos VNPs.

Antes destes estudos podem ser realizados no entanto, é essencial para se obter uma preparação de vírus puro. Para além de inoculação mecânica, uma alternativa possível para a propagação VNP é agroinfiltration, que pode ter uma elevada transformação e taxa de acumulação. Quando a propagação dos VNPs, cuidados devem ser tomados para manter as plantas infectadas com o vírus diferentes separados como tO Evite a contaminação cruzada. Em particular, TMV é facilmente espalhar e transmitida mecanicamente. Outro passo fundamental para estar atento a está realizando a purificação do vírus em gelo ou a 4 ° C. Todos os tampões devem ser utilizados gelada. A temperatura mais baixa é necessária para evitar qualquer dano às VNPs como resultado de proteases e enzimas oxidantes presentes no material vegetal.

Baixos rendimentos de VNPs purificadas podem surgir a partir de múltiplos factores. Uma causa possível poderia ser a idade das VNPs utilizados para propagação. É preferível utilizar preparações de vírus mais recentes. Por exemplo, as C-terminal 24 aminoácidos da proteína de revestimento de S CPMV são necessárias para a supressão de silenciamento do gene. Deleção desta região da superfície exposta ocorre ao longo do tempo devido à proteólise. Embora a estrutura e estabilidade da CPMV não são afectados, atraso de crescimento e atraso de espalhar os resultados de vírus. Outra fonte de baixo rendimento é a perda das VNPs durante a purificação. Particular emtention deve ser dada ao passo ressuspensão após precipitação com PEG. Ressuspensão do sedimento incompleta resultaria em VNP perdido no sedimento do passo de centrifugação subsequente.

No geral, os químicos bioconjugação aqui apresentados são simples. 14,17,18,21 Os métodos de caracterização descritos são importantes para garantir a integridade das partículas e determinar extensão da conjugação. Excessos molares podem ser ajustados de acordo, dependendo da aplicação e do grau de funcionalização pretendida.

Ao trabalhar com o modelo de xenoenxerto mouse, a prática mais importante é seguir técnica asséptica. Além disso, a injecção na veia da cauda é um passo crítico para assegurar uma dose de amostra uniforme para cada rato. Pode ajudar a colocar a cauda em água quente antes de dilatar a veia. Outra consideração é a autofluorescência para imagens de fluorescência e as medições. Geralmente, o tecido é autofluorescência minimizandoed além de 600 nm, comprimentos de onda longos fazem corantes com máximos de emissão de 600 nm para além óptimas quanto a sonda de geração de imagens. No entanto, as dietas de camundongos normais consistem em clorofila-contendo alfafa, que também fluoresce vermelho. Como resultado, é necessário manter os ratos com uma dieta de alfafa livre durante pelo menos 2 semanas, para reduzir os sinais de fundo. Finalmente, deve notar-se que a detecção de fluorescência usando imagens de fluorescência é limitado, devido às diferenças nos ambientes de dispersão e de absorção dos vários tecidos. Consequentemente, a imagem é utilizado para visualização e como um método para a biodistribuição inicial de monitorização, ao passo que a quantificação é realizada usando homogenatos de tecidos.

Algumas vantagens da utilização de VNPs como a tecnologia de plataforma são monodispersity sua biocompatibilidade, capacidade de aumento de escala de produção e receptividade à funcionalização estratégias múltiplas. Além de engenharia química, engenharia genética, é ilustrada aqui com a introduçãoção de cisteínas para BMV como um alvo para bioconjugação. A engenharia genética pode também ser usado para introduzir os péptidos alvo ou tags de afinidade. Embora o protocolo descrito utiliza dual-rotulado (corante e PEG) partículas, estudos em curso estão a olhar para incorporar funcionalidades adicionais (isto é, da terapêutica e direccionamento) para aumentar a especificidade do tecido e a eficácia terapêutica. Assim, esta abordagem estabelece as bases para futuras aplicações biomédicas.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIBIB bolsas R00 EB009105 (para NFS) e P30 EB011317 (para NFS), um NIH / NIBIB treinamento concessão T32 EB007509 (para AMW), um Case Western Reserve University Interdisciplinar Alliance Investment Grant (a NFS), E um caso Comprehensive Cancer Center concessão P30 CA043703 (para NFS). Agradecemos aos Steinmetz Lab pesquisadores estudantes de graduação para suas mãos no apoio: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Assim, e Paulo Chariou .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VNP production
Indoor plant chamber Percival Scientific E-41L2
V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) Burpee 51771A
N. benthamiana seeds N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation.
Carborundum Fisher C192-500
Pro-mix BX potting soil Premier Horticulture 713400
Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer JR Peters 77860
Equipment
50.2 Ti rotor Beckman 337901
SW 32 Ti rotor Beckman 369694
Optima L-90K ultracentrifuge Beckman 365672
SLA-3000 rotor Thermo Scientific 07149
SS-34 rotor Thermo Scientific 28020
Sorvall RC-6 Plus centrifuge Thermo Scientific 46910
Polypropylene bottle Beckman 355607 For SLA-3000 rotor
Polycarbonate bottle Beckman 357002 For SS-34 rotor
Ultra-Clear tube Beckman 344058 For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor
Polycarbonate bottle Beckman 355618 For pelleting and 50.2 Ti rotor
NanoDrop spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop2000c
PowerEase 500 pre-cast gel system Invitrogen EI8675EU
Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column GE Healthcare 17-5172-01
ÄKTA Explorer 100 Chromatograph GE Healthcare 28-4062-66
Allegra X-12R Beckman 392302 Benchtop centrifuge
Cryostat Leica CM1850
Maestro 2 Caliper Life Sciences In vivo imaging system
Tissue-Tearor Biospec Products 985370-395
Microplate reader Tecan Infinite-200
Transmission electron microscope ZEISS Libra 200FE
FluoView laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
Chemicals and Reagents
3-ethynylaniline Sigma Aldrich 498289-5G
384 well black plate BD Biosciences 353285
4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel Invitrogen NP0321BOX
4X LDS sample buffer Invitrogen NP0008
Acetic Acid Fisher A385-500
Acetonitrile Sigma Aldrich 271004-1L
Alexa Fluor 647 azide Invitrogen A10277
Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20006
Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters Millipore UFC501096 10 kDa cut-off
Aminoguanidine hydrochloride Acros Organics 36891-0250
Boric acid Fisher A74-500
Coomassie Brilliant Blue R-250 Fisher BP101-25
CsCl Acros Organics 42285-1000
DAPI MP Biomedicals 157574
Dimethyl sulfoxide Fisher BP231-100
Filter paper Fisher 09-801K P5 grade
FITC anti-mouse CD31 BioLegend 102406
Goat serum Invitrogen 16210-064
KCl Fisher BP366-500
L-ascorbic acid sodium salt Acros Organics 35268-0050
Methanol Fisher A412P-4
MgCl2 Fisher BP214-500
Microscope slides Fisher 12-544-3
Microscope cover glass VWR 48366-277
MOPS buffer Invitrogen NP0001
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-2k MW 2000
mPEG-N3 Nanocs PG1-AZ-5k MW 5000
mPEG-NHS Nanocs PG1-SC-5k MW 5000
NaCl Fisher BP358-212
Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* Invitrogen O-6149
p-toluenesulfonic acid monohydrate Acros Organics 13902-0050
Permount Fisher SP15-100
Potassium phosphate dibasic Fisher BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher BP362-1
Sodium acetate Fisher BP333-500
Sodium nitrite Acros Organics 42435-0050
Sodium sulfite Amresco 0628-500G
Sucrose Fisher S6-500
TEM grid Ted Pella FCF-400Cu
Tris base Fisher BP152-500
Triton X-100 EMD Chemicals TX1568-1
β-mercapt–thanol Fisher O3446I-100
Tissue Culture
Fetal bovine serum Invitrogen 12483-020
Hemocytometer Fisher 0267110
HT-29 cells ATCC HTB-38
L-glutamine Invitrogen 25030-080
PBS Cellgro 21-040-CV
Penicillin-streptomycin Invitrogen 10378-016
RPMI-1640 Invitrogen 31800-089
Tissue culture flasks Corning 431080 175 cm2
Trypan Blue Thermo Scientific SV30084.01
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid Invitrogen 25300-054
Animal Studies
18% Protein Rodent Diet Harlan Teklad Teklad Global 2018S Alfalfa free diet
Insulin syringe BD Biosciences 329410 28 gauge
Isoflurane Baxter AHN3637
Matrigel Matrix basement membrane BD Biosciences 356234
NCR nu/nu mice CWRU School
of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility
Sterile syringe BD Biosciences 305196 18 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Andwin Scientific 4583

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References

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor
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Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).More

Wen, A. M., Lee, K. L., Yildiz, I., Bruckman, M. A., Shukla, S., Steinmetz, N. F. Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging. J. Vis. Exp. (69), e4352, doi:10.3791/4352 (2012).

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